Relatório Precipitação de Proteínas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
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Relatório - Precipitação de Proteínas
 
Disciplina: Bioquímica Estrutural
Profº: Jonas Contiero
Ana Flávia Vieira de França
Davi Ferrari Baldissera
Diana de Lima Ramos
Flávia Komezo
Gabrielly Cristine Martins
Rio Claro, SP.
Maio - 2017
INTRODUÇÃO
As proteínas são caracterizadas por serem polímeros de aminoácidos com massa molecular maior que 10.000 Da, apresentando diferentes funções biológicas e propriedades conforme a sequência de aminoácidos ligados. Em geral, são vinte aminoácidos que se ligam em diferentes sequências através de ligações peptídicas para formar diversas proteínas (NELSON, D.L. & COX, M.M., 2006).
A ligação peptídica envolve a união de forma covalente de dois aminoácidos, sendo que tal ligação é formada pela remoção de elementos de água de um grupo carboxila de um aminoácido e um grupo amino de outro. Assim, a ocorrência de várias ligações peptídicas entre aminoácidos forma uma proteína (ALBERTS et al., 2011, p. 55-56).
Uma das propriedades que a proteína contém é a solubilidade, a qual é muito variável e depende de como os grupos polares (hidrofílicos) e os grupos apolares (hidrofóbicos) são distribuídos, bem como sua proporção. Devido à presença do grupo R, o qual é variável entre as proteínas, esta pode possuir muitos grupos carregados positivamente e negativamente, fazendo com que ocorra interação entre proteína-proteína, proteína-água e proteína-pequenos íons. Quando a interação proteína-água é alta, então esta proteína tende a ser solúvel (NELSON, D.L. & COX, M.M., 2006).
Todas as proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida, o que lhe confere suas propriedades, como a solubilidade. A modificação dessa estrutura altera suas propriedades e é conhecida como desnaturação. Esses diferentes processos de precipitação de proteína citados são importantes para a separação e purificação de uma proteína, permitindo que esta seja estudada detalhadamente.
2. OBJETIVOS
	O objetivo do experimento realizado foi relacionar os mecanismos de ação com as diferentes formas de precipitação de proteínas.
	
3. MATERIAL E MÉTODOS
Para a realização do experimento foram necessários 6 tubos de ensaio dos quais foram colocados aproximadamente 2 mL de clara de ovo em cada um desses tubos. 
O primeiro tubo foi aquecido no bico de Bunsen com o auxílio de uma pinça de madeira, e nos demais tubos foram adicionados reagentes: no segundo e terceiro tubo adicionou-se 3 gotas de sulfato de cobre e acetato de chumbo, respectivamente. 
Ao quarto tubo adicionou-se duas gotas de ácido tricloroacético e após a observação do resultado adicionou-se o mesmo reagente em excesso e observou-se; no quarto tubo houve adição de álcool etílico até que ocorresse a precipitação, este procedimento foi repetido no sexto tubo, porém utilizou acetona e não álcool.
Finalmente, em um sétimo tubo de ensaio foi colocado solução alcalina de caseína, e adicionou-se à solução azul de bromofenol para a consulta do pH da solução e após observado adicionou-se ácido clorídrico até a ocorrência da precipitação, o ácido continuou sendo adicionado gota a gota e o tubo foi agitado para que fosse observado o resultado da reação.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Como dito no item anterior foram utilizados 6 tubos de ensaio preenchidos com clara de ovo para o experimento com os agentes desnaturantes de proteínas. (Figura 4.1) 
No primeiro tubo foi observado que ao aquecer a solução houve a precipitação de proteínas devido a exposição do tubo ao calor(agente desnaturante). Observou-se alteração na viscosidade da solução e também de solubilidade. (Figura 4.2)
No segundo e terceiro tubo de ensaio houve a adição de sais de metais pesados: sulfato de cobre 0,1 M e acetato de chumbo 0,1 M. No tubo em que foi adicionado o sulfato de cobre houve precipitação e mudança na coloração da solução sendo que de transparente, caracterizando assim a clara do ovo, a solução se tornou esverdeada (Figura 4.3). No tubo em que houve a adição de acetato de chumbo também houve precipitação porém a mudança de coloração não foi perceptível. (Figura 4.4)
No quarto tubo de ensaio houve a adição de ácido de tricloroacético 10%, após a adição do excesso desse reagente houve a precipitação (Figura 4.5). Em seguida, foi adicionado NaOH 2,5M que ocasionou a dissolução do precipitado através da neutralização do pH fazendo-a semelhante a seu aspecto inicial antes da adição do agente desnaturante (Figura 4.6).
No quinto tubo foi adicionado álcool etílico até que houve precipitação na solução de proteínas (Figura 4.7). No sexto tubo houve a adição de acetona na solução até que ocorreu a formação de precipitado (Figura 4.8). Ambos os reagentes (álcool e acetona) estavam sob resfriamento contínuo antes do início do experimento. A precipitação nos dois casos ocorreu devido à adição de agentes desnaturantes.
Foi feita a adição de um novo tubo de ensaio, que foi pipetado com 2ml de solução alcalina de caseína, e foram adicionadas 3 gotas de azul de bromofenol para acompanhar as variações de PH da solução, que obteve coloração roxa devido ao PH alcalino. Onde em PH=3,1 a cor é amarela e em PH=4,7 a cor é azul (Figura 4.9). Em seguida, houve a adição de ácido clorídrico 0,1M gota a gota, agitando o tubo após cada gota, até que ocorreu a precipitação da solução. Devido ao acréscimo do ácido, o PH da solução abaixou.
 							
			
 
 
 
Foi observado que durante o experimento, quando houve a precipitação de proteínas a principal propriedade observada foi: a solubilidade. A diminuição de solubilidade em algumas amostras, é explicada pela exposição de radicais apolares (hidrofóbicos) e outros, os quais prejudicam a interação proteína-água e favorecem a interação proteína-proteína, formando um precipitado.
Além da solubilidade alterações como a viscosidade da solução foram observadas nas amostras, assim como em algumas também houve a alteração de coloração.
Os solventes orgânicos utilizados no experimento, etanol e cetona, ocasionaram a precipitação através das suas correntes dielétricas que são inferiores a corrente da água, esse fator permitiu a predominância da interação proteína-proteína. 
Os sais utilizados, acetato de chumbo e o sulfato de cobre, devido a suas propriedades em baixas concentrações podem aumentar a solubilidade de muitas proteínas (solubilização por salificação), isso porque a interação da proteína com os sais causam a diminuição da interação proteína-proteína. 
Já em concentrações elevadas, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente (precipitação por salificação), isso porque acredita-se que a concentração elevada de sais pode remover água de hidratação das moléculas proteicas, levando a um aumento na interação proteína-proteína, ocorrendo precipitação.
 
 
5. CONCLUSÃO
Ao realizar os experimentos, foi possível observar a propriedade da proteína aqui discutida, a solubilidade. E, de acordo com a observação e o estudo detalhado, conclui-se que as proteínas sofrem alterações causadas pela desnaturação quando expostas ao calor, ácidos, bases, solventes orgânicos, sais de metais pesados, entre outros, que resultam na diminuição da solubilidade, perda de atividade, alteração na viscosidade, etc. 
 
	
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 ALBERTS, B. et al. Fundamentos da biologia celular. Artmed editora S.A., 3ª edição – Porto Alegre, RS, 2011.
 NELSON, D.L. & COX, M.M Lehninger – Princípios de Bioquímica. Sarvier Editora de Livros Médicos Ltda, 4ª edição – São Paulo, SP, 2006.
 VILLELA,G.G.; BACILA, M. & TASTALDI, H. Técnicas e experimentos em bioquímica. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan S.A., p. 395-411, 1973.