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Preparo de Material de Laboratório para Análises Microbiológicas
Microbiologia Prática
Prof. Márcia G. Perdoncini
Preparo de Material de 
Laboratório para Análises 
Microbiológicas
Microbiologia Prática
Prof. Márcia R. F. G. Perdoncini
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Microbiologia Prática
Prof. Márcia G. Perdoncini
• Todos os materiais (frascos, vidrarias, 
instrumentos, utensílios, etc) utilizados em uma 
análise microbiológica passam por diversas 
etapas até que se encontrem totalmente limpos, 
estéreis e isentos de resíduos químicos e 
orgânicos.orgânicos.
• São utilizados os agentes físicos e agentes 
químicos.
• Este trabalho envolve as atividades de 
descontaminação, descarte dos resíduos 
contaminados, lavagem, 
acondicionamento e esterilização.
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1. DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DOS 
RESÍDUOS:
1.1. Material Novo:
Toda a vidraria nova deve passar por um tratamento 
de limpeza,pois podem estar presentes esporos 
resistentes provenientes do material de embalagem;
As vidrarias devem ser mergulhadas em água As vidrarias devem ser mergulhadas em água 
destilada, enxaguadas e submetidas a testes de pH, 
antes de serem utilizadas;
Um outro método também utilizado é a fervura em da 
vidraria em solução detergente, causando assim a lise 
dos organismos;
Proceder o resfriamento e lavagem completa com 
água destilada.
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Tampas de plástico ou borracha, tubos de 
roscas ou outros frascos, devem passar por um 
tratamento para a remoção de resíduos tóxicos: 
Mergulhar em água destilada, autoclavar a 
121oC/15 minutos e enxaguar com água 
destilada.destilada.
Repetir este procedimento mais de uma vez.
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1.2. Material Contaminado:
Todo o material contaminado, incluindo os 
meios de cultura onde foi submetido o 
crescimento microbiano e demais utensílios que 
tenham entrado em contato com os 
microrganismos, principalmente os patógenos, microrganismos, principalmente os patógenos, 
devem ser submetidos à esterilização em 
autoclave a 121oC por 30 minutos, observando 
os seguintes cuidados:
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Afrouxar as tampas de todos os frascos com 
tampa de rosca;
Adicionar água ou solução detergente aos 
estojos de descarte de pipetas, para amolecer 
os resíduos e facilitar a posterior remoção;
Após passar por este processo de Após passar por este processo de 
esterilização, os resíduos contidos nas 
vidrarias ou em outros materiais podem ser 
descartados.
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Obs.: 
• Pode-se também proceder a descontaminação dos 
materiais em estufa à temperatura de 170 – 180 oC por 
um tempo de 1 - 2 horas.
• Porém deve-se levar em consideração o seguinte 
critério: 
Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em 
estufa.
Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor 
dilatam e podem sofrer alterações significativas nas 
medidas de volume; 
Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser 
submetidos à temperaturas muito elevadas por longos 
períodos.
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1.3. Material não contaminado:
Materiais utilizados nas análises microbiológicas 
que não entram em contato com as culturas de 
microrganismos passam diretamente para a 
etapa de lavagem, descartando esta etapa de 
descontaminação.descontaminação.
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2. LAVAGEM:
• Nesta etapa deve-se levar em consideração a 
escolha do detergente e os métodos de 
enxágüe, para a remoção dos resíduos.
2.1. Escolha do Detergente:
• Os detergentes mais utilizados são os 
aniônicos, principalmente aqueles que contém 
compostos alcalinos como os silicatos 
carbonatos ou fosfatos.
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O detergente escolhido deverá satisfazer os 
seguintes critérios:
Ter a capacidade de “amolecer” a água fornecida 
localmente. Obs.: Água mole é aquela que carece de 
íons que formam sais insolúveis com os ácidos 
graxos de tal forma que o sabão espumará facilmente 
em tal fluido.
Ter a capacidade de remover rapidamente o material 
orgânico à temperatura de 60 oC;
Ser facilmente removido da vidraria após um 
enxágüe normal, com pH neutro;
Depois de enxaguada a vidraria deverá estar livre de 
fatores antimicrobianos.
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Eventualmente, pode ser necessária a aplicação 
de um agente mais forte, principalmente para a 
limpeza de utensílios que não permitem a 
introdução de escovas, ou para a remoção de 
resíduos mais resistentes à ação dos 
detergentes.
Nestes casos os agentes mais freqüentemente 
utilizados são a solução sulfocrômica e a 
solução de hidróxido de sódio a 1 N.
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• O enxágüe dos utensílios deve ser feito de 
forma a garantir a completa remoção dos 
resíduos de detergente, solução sulfocrômica ou 
outro agente de limpeza utilizado.
• Os resíduos destes compostos podem 
interferir nas análises microbiológicas, tanto por interferir nas análises microbiológicas, tanto por 
alteração das características dos meios de 
cultura, como por inibição do crescimento dos 
microrganismos.
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2.2. Procedimento para a lavagem:
a. Remover todo o material contaminado nos frascos e 
utensílios;
b. Mergulhar todo o material em solução detergente e 
deixar de molho por 2 horas ou mais, dependendo do 
grau de aderência do material a ser removido.
Deve-se fazer um pré lavagem para retirar o excesso de 
material orgânico nas bacias de lavagem;
Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em 
frascos separados, reesistentes ao calor, e submetidos à 
ação do vapor fluente por 15 minutos para a remoção dos 
resíduos de meio de cultura.
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c. Com o auxílio de escovas e esponjas , esfregar os 
frascos e demais utensílios;
d. Enxaguar todo o material em água corrente, por dez 
vezes consecutivas.
e. Enxaguar em seguida com água destilada, pelo 
menos uma vez.menos uma vez.
No caso de pipetas recomenda-se o uso de um 
lavador de pipetas, mantendo cada batelada sob 
enxágüe contínuo, por pelo menos uma hora.
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3. SECAGEM:
• Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais 
utensílios passam para a etapa de secagem;
• Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou 
em forno próprio para a secagem de materiais à 
temperatura de 100 oC por aproximadamente 1 temperatura de 100 oC por aproximadamente 1 
a 2 horas.
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4. ACONDICIONAMENTO:
• Os procedimentos seguintesreferem-se aos 
frascos e utensílios vazios.
• Material com meios de cultura, diluentes e 
reagentes devem ser preparados, 
acondicionado e esterilizado seguindo as acondicionado e esterilizado seguindo as 
orientações geralmente contidas nos rótulos de 
embalagens ou no manual próprio de preparo 
de reagentes e meios de culturas.
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a) Placas de Petri: devem ser acondicionadas em 
estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável, em 
grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em 
papel Kraft em grupos de até dez placas.
b) Pipetas: Preencher o bocal com algodão e 
acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou 
aço inoxidável, em grupos de mesmo volume com as 
pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do 
estojo. 
pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do 
estojo. 
Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou 
gaze para evitar danos nas pontas das pipetas.
Pode-se também embrulhar as pipetas 
individualmente em papel Kraft, lembrando-se de 
identificar a extremidade do embrulho que deve 
ser aberta no momento da análise, e e anotar 
externamente o volume da pipeta.
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c) Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de 
algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas 
tampas no caso dos tubos rosqueáveis.
Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo 
tamanho e volume, embrulhar com papel Kraft e vedar 
com fita crepe especial.
d) Frascos de homogeneização e outros frascos d) Frascos de homogeneização e outros frascos 
vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou 
tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com 
papel Kraft.
e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: 
embrulhar individualmente com papel Kraft, 
lembrando-se de identificar a extremidade do 
embrulho que deve ser aberta no momento da análise.
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5. ESTERILIZAÇÃO:
A destruição de todos os microrganismos 
presentes em um material, incluindo os esporos, 
é denominada esterilização.
Todo o material de laboratório vazio (placas, 
pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, 
tesouras, etc)após a etapa de 
acondicionamento devem ser esterilizados em 
autoclave (calor úmido) ou estufa (calor seco).
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• A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, 
radiações, filtrações) ou químicos (óxido de etileno, 
beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeido)
• Esterilização pelo calor:
– A temperatura elevada é um dos métodos de maior 
eficiência e um dos mais utilizados na destruição de eficiência e um dos mais utilizados na destruição de 
microrganismo.
– O calor pode ser aplicado tanto em condições úmidas 
(vapor ou água) quanto secas.
– O método que utiliza temperaturas extremas para 
matar os microrganismos é o da incineração
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5.1. Esterilização pelo calor seco:
• Calor seco ou ar quente em temperaturas 
suficientemente altas, levam os microrganismos a morte.
• Entretanto esta técnica não é tão efetiva quanto o calor 
úmido e, portanto, são necessárias temperaturas muito 
altas e tempos de exposição maior.
• Por exemplo: a esterilização de vidrarias de • Por exemplo: a esterilização de vidrarias de 
laboratórios (como placas de petri, pipetas) requer um 
tempo de 2 horas de exposição a 160 – 180 oC, 
enquanto que a esterilização dos mesmos materiais em 
autoclave requer somente 15 minutos a 121oC.
• Há situações entretanto em que um material não poderá 
ser exposto à umidade, e o método pelo calor seco é 
preferido.
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5.1.1. Flambagem: 
– Consiste em passar o material sobre a chama de um 
bico de Bunsen ou lamparina. 
– Utilizado para bocas de tubos de ensaio, lâminas de 
vidro e, eventualmente para espátulas, sondas, etc.
– Para tubos de ensaio, a flambagem tem finalidade de 
evitar possíveis contaminações na transferência ou evitar possíveis contaminações na transferência ou 
inoculação de culturas.
– No caso de lâminas, espátulas e sondas a 
flambagem é efetuada após imersão em álcool, não 
implicando necessariamente em esterilização.
5.1.2. Aquecimento ao rubro em chama: 
– Utilizado para esterilização de alças e agulhas de 
inoculação.
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•Uma alça de inoculação 
pode ser esterilizada 
colocando-se na chama do 
bico de Bunsen por alguns 
segundos.
•Quando a alça de 
inoculação é colocada na 
chama, gotículas podem ser 
formadas, resultando em formadas, resultando em 
propagação de organismos 
vivos.
•Para prevenir, deve-se 
colocar a alça primeiramente 
na porção mais fria da chama 
e só depois colocá-la na 
parte mais quente.
Parte 
mais fria
Parte 
mais 
quente x
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5.1.3. Ar quente (Estufa ou forno de Pasteur):
– Pipetas e placas de Petri são esterilizadas a uma 
temperatura de 170 – 180oCpor um período de 1 a 2 
horas em equipamento denominado Forno de 
Pasteur ou mais conhecido como estufa de 
esterilização.
– O papel que protege o material deve adquirir cor 
parda, porém não deve escurecer muito ou se tornar 
quebradiço.
– Após o término da esterilização, deve-se esperar a o 
resfriamento total da estufa antes de se abrir a porta 
da mesma. Isto deve ser feito para se evitar mudança 
brusca de temperatura nas vidrarias o que levaria à 
quebra das mesmas.
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5.2. Esterilização por Calor Úmido:
• O calor úmido é muito mais eficiente que o calor 
seco para destruir os microrganismos.
• Isto porque o calor úmido causa desnaturação e 
coagulação das proteínas vitais como as 
enzimas, enquanto o calor seco causa oxidação enzimas, enquanto o calor seco causa oxidação 
dos constituintes orgânicos da célula (isto é, ele 
“queima” lentamente as células).
• A desnaturação de proteínas celulares ocorre 
com temperaturas e tempos de exposição 
menores do que aqueles requeridos para a 
oxidação.
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• Por exemplo: os esporos de Bacillus anthracis são 
destruídos entre 2 e 15 minutos pelo calor úmido a 
100oC, mas com o calor seco leva mais de 180 min a 
140oC para conseguir o mesmo resultado.
• Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes 
de vida.
• Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são • Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são 
muito mais sensíveis ao calor e usualmente são mortas 
dentro de 5 a 10 minutos pelo calor úmido a 60 – 70 oC.
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• Células vegetativas de leveduras e outros fungos são 
geralmente destruídas entre 5 e 10 minutos pelo calor 
úmido a 50 – 60 oC.
• Para matar os esporos dos fungos no mesmo período 
de tempo são necessárias temperaturas de 70 – 80 oC.
• A susceptibilidade dos protozoários e de muitos vírus ao • A susceptibilidade dosprotozoários e de muitos vírus ao 
calor é similar àquela da maioria das células 
vegetativas.
• O calor úmido utilizado para matar os microrganismos 
pode ser na forma de vapor, água fervente ou água 
aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de 
ebulição.
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5.2.1. Vapor d’ água sob pressão:
• O uso do vapor d’água sob pressão é o método mais 
prático e seguro de aplicação do calor úmido.
• Em um sistema fechado de volume constante, um 
aumento de pressão permitirá um aumento na 
temperatura.
• Vapor d’água sob pressão fornece temperaturas 
maiores do que aqueles possíveis com vapor sem 
pressão ou água fervente.
• Há a vantagem também de um aquecimento rápido e 
maior penetração do calor.
• O aparelho destinado a esterilizar com vapor de água 
sob pressão é a autoclave.
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AUTOCLAVE:
• Desenvolvida no século XIX, a autoclave é um 
equipamento essencial em todo o laboratório de 
microbiologia. 
• Muitos meios de culturas, soluções e materiais 
contaminados são esterilizados rotineiramente com este contaminados são esterilizados rotineiramente com este 
aparelho.
• A autoclave parece uma panela de pressão no sentido 
em que ambas utilizam vapor sob pressão, porém a 
temperatura e a a pressão interna na autoclave podem 
ser bem mais controladas.
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• Â câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente 
lavada com vapor fluente, para remover todo o ar.
• É então preenchida com vapor puro e mantida a uma 
determinada temperatura e pressão por um período 
especifico de tempo.
• É essencial que todo o ar residual inicialmente presente • É essencial que todo o ar residual inicialmente presente 
na câmara seja completamente substituído por vapor 
d’água.
• Se o ar estiver presente, reduzirá a temperatura interna 
da autoclave.
• É a temperatura e não a pressão no interior da câmara, 
que mata os microrganismos
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• Uma autoclave é usualmente operada a uma pressão de 
15 lb/pol2, na qual a temperatura do vapor é 121oC.
• O tempo necessário para esterilizar nesta temperatura 
depende do material que está sendo tratado.
• Leva mais tempo para o calor penetrar em um material 
viscoso ou sólido do que em material fluido.
• O tempo necessário também depende do volume do • O tempo necessário também depende do volume do 
material que está sedo esterilizado.
• Por exemplo, 1.000 tubos contendo 10 ml cada de um 
meio líquido podem ser esterilizados em 10 a 15 
minutos a 121oC, enquanto o mesmo volume de meio 
(10 litros) em um único frasco necessitará de uma hora 
ou mais, pois mais tempo será requerido para o calor 
penetrar no centro do material volumoso.
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Vapor sob Pressão (autoclave):
– É o método mais eficiente para esterilizar 
meios de cultura e soluções diluentes.
– Deve ser utilizado para todo meio que resiste 
a altas temperaturas sem se alterar.
– Também é utilizado para vidrarias e para 
esterilização de cultivos e material 
contaminado antes da lavagem.
– A esterilização na autoclave geralmente é 
atingida a uma temperatura de 121oC por 15 
– 20 minutos a uma pressão de 15 lbs.
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• Obs. 
– Ao usar a autoclave é importante que todo o 
ar seja removido antes que a pressão seja 
aumentada, pois uma mistura de ar e vapor 
resulta numa temperatura menor a uma dada 
pressão.pressão.
• Por exemplo: se 1/3 do ar permanece na 
autoclave, a temperatura atingida será de apenas 
115oC .
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Corte longitudinal de uma autoclave ilustrando as partes e a 
via do fluxo de vapor.
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5.2.2. Vapor Fluente:
– Consiste em tratar térmica,mente um material 
à temperatura de 100oC, em autoclave, sem 
utilizar a pressão de vapor.
– É utilizados para certos meios de cultura que – É utilizados para certos meios de cultura que 
sofrem alterações quando submetidos a 
tratamentos térmicos acima de 100oC.
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• O tratamento pode ser:
– Por aquecimento a 100oC por no mínimo 60 minutos 
por máximo de 90 minutos;
– Calor intermitente (tindalização): por aquecimento a 
100oC por 30 minutos, repetindo este tratamento por 
três dias consecutivos, sendo o meio incubado nas 
condições que será usado entre um aquecimento e 
outro.
• O aquecimento do primeiro dia mata as formas microbianas 
vegetativas presentes no meio;
• Durante a incubação entre um aquecimento e outro, 
possíveis formas esporuladas germinam e então são 
destruídas nos aquecimentos subseqüentes.
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5.3. Esterilização por Filtração:
• Os filtros são utilizados para esterilizar materiais 
que não podem ser submetidos aos outros 
processos de esterilização.
• São utilizados filtros ou membranas filtrantes 
capazes de reter os microrganismos.capazes de reter os microrganismos.
• Estas membranas filtrantes são discos de 
ésteres de celulose finos (150 µm), com poros 
pequenos, que retém os microrganismos.
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• Um sistema de filtração por pressão positiva muito 
utilizado para pequenos volumes (até 100 ml) é o 
Swinnex filter-holderr (Millipore Filter Corporations) que 
é facilmente adaptados a seringas hipodérmicas.
• Para evitar a contaminação do analista por partículas 
aerossóis que são emitidas durante a manipulação de 
materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de 
segurança biológica que empregam sistema de filtração.
– O ar é aspirado para dentro do equipamento e filtrado 
através de filtros de acetato de celulose aderido a 
uma folha de alumínio, com a finalidade de reter 99 
% de partículas presentes no ar.
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5.4. Esterilização por radiações:
• Radiação ultra violeta (256 – 280 nm) agem sobre o 
DNA da célula do microrganismo tornando-o inativo.
• As fontes são: lâmpadas de vapor de mercúrio a baixa 
pressão.
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6. SECAGEM DE MATERIAIS:
• Esta etapa pode ou não ser realizada.
• É utilizada quando a etapa de esterilização é por calor 
úmido (autoclave).
• Geralmente após este tipo de esterilização, os materiais 
ficam úmidos, podendo facilitar uma contaminação.ficam úmidos, podendo facilitar uma contaminação.
• A secagem pode ser realizada em estufa de Pasteur a 
temperaturas de no máximo 100oC.
• A armazenagem dos materiais deve ocorrer apenas 
após os mesmo estarem totalmente secos.
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Aula PráticaROTEIRO:
• Preparar os materiais e vidrarias para serem utilizados 
em análises microbiológicas, seguindo a seguinte 
ordem:
1. Descontaminação em autoclave (121oC por 30 
minutos)minutos)
2. Descarte dos resíduos;
3. Lavagem e enxágüe;
4. Secagem;
5. Acondicionamento em papel Kraft;
6. Esterilização em autoclave;
7. Armazenamento
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Obs. 
• Identificar os pacotes de vidrarias acondicionados com o 
nome da equipe, a data da esterilização e volume da 
vidraria quando pertinente;
• Usar luvas de borracha para a lavagem das vidrarias;
• Usar avental especial para a lavagem das vidrarias;• Usar avental especial para a lavagem das vidrarias;
• Não esquecer do último enxágüe em água destilada;
• Não esquecer de retirar o ar residual da autoclave.