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Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 112 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA Componente crítico na regulação do metabolismo celular e na orquestração e manutenção das diferenças estruturais e funcionais que existem nas células em desenvolvimento. Dado ao alto custo da síntese de proteínas, a regulação da exp. gênica é essencial p/ a célula fazer o melhor uso da energia disponível. Há pelo menos 7 pontos potenciais onde a quantidade de proteína pode ser regulada: A síntese do transcrito primário do RNA. O processamento pós-transcrição do mRNA. A degradação do mRNA. A síntese proteíca (tradução). Modificações pós-tradução das proteínas. Degradação das proteínas. Endereçamento e transporte das proteínas. *A conc. De uma dada proteína é controlada por mecanismos reguladores em qualquer um ou todos esses pontos. Principal regulação: iniciação da transcrição (melhor documentada e a mais comum). *As proteínas podem ser divididas em 2 grandes grupos quanto a sua forma de expressão: 1. Proteínas constitutivas são aquelas cuja quantidade na célula não é influenciada por mudanças ambientais (nutricionais, temperatura etc.). São sintetizadas constantemente e em grandes quantidades. Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 113 *A expressão invariável de um gene é chamada expressão de um gene constitutivo. 2. Proteínas induzidas são aquelas cuja expressão varia de acordo com as condições da célula. Os genes que codificam estas proteínas são chamados genes regulados e incluem todos aqueles que são sensíveis a mudanças ambientais. *produtos gênicos onde os níveis celulares aumentam ou diminuem em resposta a sinais moleculares expressão gênica regulada. Bactérias: controle da exp. gênica serve p/ que a célula se ajuste a uma nova condição ambiental. *Princípios básicos da regulação gênica em procariotos: 1. Esses organismos necessitam ter mecanismos rápidos e eficientes de adaptação a mudanças no ambiente. 2. Produtos gênicos que funcionam em conjunto, normalmente tem regulação da expressão semelhante, ou estão organizados em operons. 3. A transcrição da maioria dos genes esta em um estado “bloqueado”, pela ligação de proteínas inibidoras. 4. A dissociação dessas depende de um indutor, normalmente uma molécula pequena, que “sinaliza” a mudança ambienta. Organização das unidades transcricionais Operon é uma unidade de expressão gênica, incluindo genes estruturais e elementos que controlam sua expressão. É constituído por um grupo de genes ordenados lado a lado que codificam enzimas que trabalham numa via metabólica integrada, controlada por um único promotor. Um gene regulador ajuda a controlar a transcrição de genes estruturais do operon. É composto por 3 elementos principais: 1. Promotor ou região promotora: onde vai haver a ligação da RNA pol. 2. Operador: região do DNA em que vai haver a ligação de proteínas regulatórias. O operador localiza-se ao lado dos genes estruturais que são por eles controlados. 3. Genes estruturais: genes da proteína que será expressa. Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 114 *Observem que o operador pode ficar com parte dentro do promotor ou completamente inserido no promotor. Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 115 *Tipos de Regulação: padrões comuns de regulação da iniciação da transcrição. 1- Regulação negativa: 2- Regulação positiva: -A maioria dos genes procarióticos são regulados em unidades chamadas operons. Exemplos: Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 116 1- Operon Lac: o metabolismo da lactose na E.coli Como o operon Lac está organizado? Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 117 O operon lac no estado reprimido. O gene I codifica o represor Lac. Os genes lac Z, Y e A codificam a -galactosidade, a galactosídeo permease e a transacetilase, respectivamente. P é o promotor para os genes lac e P1 é o promotor para o gene I, O1 é o operador principal para o operonlac; O2 e O3 são sítios operadores secundários chamados pseudo-operadores. Relações entre a seqüência do operador lac e o promotor lac: O operon lac está sujeito a regulação positiva: -Ativação da transcrição do operon lac pela CRP (cAMP receptor protein) ou CAP (catabolite gene activator protein): -Sequência do promotor lac comparada com a seqüência consenso do promotor: Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 118 Outros fatores, além da lactose, afetam a expressão dos genes lac, como a disponibilidade da glicose. -Observem os efeitos combinados da glicose e da lactose na expressão do operon lac: -A transcrição ocorre apenas quando as concentrações da glicose forem baixas (de forma que os níveis de cAMP sejam altos e a CRP esteja ligada) e as concentrações de lactose forem altas de forma que o repressor lac não esteja ligado. Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 119 -A CRP e o cAMP estão envolvidos na regulação coordenada de muitos operons, principalmente àqueles que codificam enzimas para o metabolismo de outros açúcares secundários, como a galactose e a arabinose. Muitos genes para a biossíntese dos aminoácidos são regulados pela atenuação da transcrição. - Os 20 aminoácidos-padrão são requeridos em grandes quantidades para a síntese de proteínas e a E. coli pode sintetizar a todos. - Os genes das enzimas necessárias para sintetizar um certo aminoácido estão, geralmente, agrupadas num operon e são expressados toda vez que o suprimentos do aminoácido sejam inadequados para os requerimentos celulares. 2- Operon triptofano: - Este operon é regulado por 2 mecanismos: repressão e por atenuação. 2.1- Regulação por repressão: Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 120 2.2- Por atenuação:Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 121 Regulação da Expressão gênica em eucariotos: - A iniciação da transcrição também é o ponto de regulação principal. - As células eucarióticas usam muitos dos mesmos esquemas regulatórios, embora a regulação positiva pareça ser mais comum e a transcrição seja acompanhada por grandes alterações na estrutura da cromatina. - Os promotores para RNA polimerase II tipicamente possuem seqüências TATA e Inr, bem como sítios de ligação múltiplos para os transativadores de ligação ao DNA. Estes sítios, algumas vezes, estão localizados a centenas ou mesmo milhares de pares de bases distantes da seqüência TATA (chamados seqüências ativadoras a montante na levedura e intensificadores nos eucariotos superiores). - Grandes complexos de proteínas são geralmente requeridos para regular a atividade transcricional. - Genes eucariotos não se organizam em operons, mas regulação conjunta pode ser obtida pela presença de mais sitios reguladores da iniciação de transcrição. - Acesso as regiões promotoras é restrito pela estrutura da cromatina, e remodelamento da cromatina é necessário (hetero e eucromatina) Remodelação da cromatina: 1. Heterocromatina: tipicamente, 10% da cromatina esta sempre supercondensada, essas regiões são transcricionalmente inativas. 2. Eucromatina: cromatina mais “relaxada”, transcricionalmente ativa. Cromatina é remodelada por acetilação ou movimentação dos nucleossomos A acetilação das histonas diminui a compactação da cromatina pois diminui a interação do “core complex” com o DNA, com isso os sítios promotores e reguladores estão mais acessíveis para a ligação dos fatores de transcrição. Manual de Estudo Dirigido em Biologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca do Espírito Santo 122 Exercícios de Fixação: Regulação da expressão gênica (procariotos) 1- Observe a estrutura do gene abaixo e explique cada um dos elementos descrito na figura. 2- Quais são os pontos potenciais para a regulação de um gene? 3- Em procariotos existem sistemas constitutivos como é o caso de proteínas como fatores de iniciação e alongamento na tradução. Alguns genes estão se expressando continuamente, enquanto outros sistemas (indução, repressão) funcionam apenas quando necessários. Por que todos os genes não podem se expressar ao mesmo tempo? 4- Diferencie a regulação negativa da positiva. 5- Por que quando um repressor se liga ao operador o gene fica “inativo”? 6- Esquematize o operon lac com todos seus elementos principais. 7- O que ocorre com o operon lac quando a E. coli está crescendo numa solução de meio de cultura onde a lactose está alta, a glicose baixa e cAMP elevado? 8- O que ocorre com o operon lac quando a E. coli está crescendo numa solução de meio de cultura onde a lactose está baixa, a glicose alta e cAMP baixo? 9- O efeito CRP-cAMP na transcrição do operon lac é um exemplo de regulação positiva ou negativa? Por quê? Como esta regulação sofre influência da glicose? 10- Sabemos que um gene nunca fica 100% reprimido, e a expressão ocorre em nível basal. Explique o que é “vazamento” da informação genética no contexto do operon lac, por que ocorre e para que ele serve. 11- O que o complexo CAP-cAMP determina na interação RNApolimerase - promotor? 12- Se tivermos uma mutação na caixa 1 da seqüência líder do operon triptofano, com a perda dos códons para triptofano, o que a acontecerá com a bactéria na ausência completa de triptofano? Por que? 13- Descreva como é formado um grampo intermediário (que não é um grampo de terminação) no mRNA nascente do operon triptofano, na presença de pequenas quantidades de triptofano no citosol bacteriano.
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