MED RESUMOS - Engenharia Genética

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Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● GENÉTICA 
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ENGENHARIA GENÉTICA 
 
A engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante representa o uso no dia-a-dia de todos os 
estudos feitos a cerca da genética. É a partir desses estudos que se utiliza para identificação de cadáveres 
carbonizados, testes de paternidade, tratamento com hormônios exógenos, etc. Embora grande parte do genoma 
humano já tenha sido identificado, ainda não se obteve o custo-benefício desses estudos. Observa-se também que a 
maior parte do DNA (tanto o DNA nuclear quanto o mitocondrial) não é utilizada. 
 
 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
A engenharia genética faz uso de ferramentas desenvolvidas para se chegar aos resultados que se quer obter. 
As enzimas de restrição são exemplos desses instrumentos. Essas enzimas funcionam como uma “tesoura molecular” 
que reconhece certas sequências de bases nitrogenadas do DNA e o corta em locais específicos. Geralmente, elas 
obedecem uma nomenclatura: a enzima de restrição Eco R1 (a mais estudada hoje em dia) deu-se por  A primeira 
letra se dá de acordo com o gênero da qual ela foi estudada (E de Escherichia); duas primeiras letras da espécie do ser 
(co de coli); uma letra para o local de onde foi isolado e a ordem de quando foi isolada (R porque foi do plasmídeo R e 1 
porque foi a primeira a ser isolada). 
Ex: Enzima de restrição colhida do Staphylococcus aureus  Sau. 
 
 Essas enzimas reconhecem sequências “palindrômicas” do DNA. Isso 
significa o mesmo da língua portuguesa: uma palavra ou oração palíndromo 
significa que lendo no sentido correto quanto no sentido contrário, apresenta o 
mesmo significado, como na oração “Amor a Roma” ou “Socorram-me subi no 
ônibus em Marrocos”. No DNA, uma sequência palindrômica pode ser representada, 
como na molécula ao lado, a sequência lida da esquerda pra direita na fita de cima, 
é a mesma sequência lida da direita para a esquerda na fita de baixo e corta, 
relativamente, no mesmo local do corte na fita pareada. 
 
OBS
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: As bactérias usam as enzimas de restrição para se defender do ataque de vírus, cortando o DNA viral, impedindo 
a sua multiplicação. E para que as enzimas de restrição não ataquem seu próprio material genético, a bactéria se 
protege metilando suas bases nitrogenadas a partir da adição de CH3. 
 
 Para se obter um indivíduo transgênico, deve-se seguir os passos para 
obtenção de plasmídeos recombinantes: 
 Corte de sequencias de DNA plasmidial e estranho (por exemplo, do gene da 
insulina) com a mesma enzima de Restrição. Verificar extremidades coesivas (em que 
essas extremidades sejam complementares). 
 Mistura dos DNAs para a união dos fragmentos por pareamento de bases 
nitrogenadas. 
 Aplica-se DNA ligase, resultando em plasmídeo híbrido (recombinante). 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROBE: CONFECÇÕES DE SONDAS DE DNA 
 É uma técnica utilizada para isolar e capturar fragmentos de genes especificamente predeterminados. Para isso, 
faz-se uso de uma sonda (ou probe), que é uma sequência de bases complementares ao gene que se deseja isolar, de 
modo que esteja marcado radioativamente para melhor ser identificado. 
 Isso é utilizado para identificar, por exemplo, qual foi a sequência exata de bases utilizada para produzir um 
determinado aminoácido. De modo analógico, não se pode ter uma conclusão definitiva pois o código genético pode ser 
degenerado, ou seja, mais de um tipo de códon pode produzir o mesmo aminoácido. É nesse momento que entra a 
sonda: faz uma série de oligonucleotídeos marcados radioativamente (P-32) de modo que um deles se hibridize com a 
sequência que se deseja descobrir. 
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 Observa-se então que existirá apenas uma sequência que se hibridiza 100% com o a sequência que se quer 
descobrir por serem exatamente complementares. Desse modo, é possível pescar esse gene em outra série de genes 
em um meio qualquer. Para isso, misturam-se os elementos de fita simples para que se hibridizem e se individualize 
devido a sua marca radioativa, de modo que os outros genes sejam excluídos do experimento. 
 
 
 
TÉCNICA ASO (OLIGONUCLEOTÍDEO ALELO ESPECÍFICO) 
 É uma técnica utilizada para detectar algum fragmento alterado de DNA, mesmo que essa alteração seja limitada 
a uma base nitrogenada. Essa sonda marcada tem a capacidade de se hibridizar com o fragmento alterado, e não com o 
normal, identificando-o. 
 
 
TRANSCRIPTASE REVERSA 
 Técnica utilizada para produzir DNA a partir de RNA. Quando se quer obter um DNA a partir de uma simples fita 
de RNA, faz-se uso da enzima trasncriptase reversa. Fazendo uso então de uma enzima alcalina, destrói-se a fita de 
RNA que serviu como molde e, utilizando uma DNA polimerase, obtêm-se uma molécula de DNA de fita dupla. Isso é 
importante para realizar PCR com vírus de RNA (como o HIV). 
 
 
TÉCNICA DE SOUTHERN BLOTTING 
 O Southern blot é um método da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada sequência de 
DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Sem essa técnica, seria como procurar uma “agulha no 
palheiro”. Ela é feita por meio do realce do resultado de uma eletroforese em gel de agarose. O método foi batizado com 
o nome de seu inventor, o biólogo britânico Edwin Southern (1975), e isso fez com que outros métodos de blot fossem 
batizados com trocadilhos ao nome de Southern, por exemplo, Western blot e Northern blot. 
 Corta-se o DNA com enzimas de restrição e os separa em gel de agarose para eletroforese. O gel onde foi feita 
a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para 
promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturação é necessária 
porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda. 
 Transfrerência do DNA para uma membrana: Uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon) é 
posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel (tanto se usando sucção, ou pondo-se 
sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Isso faz com que o DNA passe do gel 
para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose) ou exposta a 
radiação ultravioleta (no caso do nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana. 
 Tratamento com a sonda: A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de 
DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, àquela sequência a qual se quer 
determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da dupla hélice do DNA são complementares uma 
a outra, tanto faz escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar à sequência procurada). A sonda de 
DNA é marcada de tal forma que permita ser detectada a sua presença, essa marcação é normalmente feita 
incorporando-se a ela átomos radioativos (como o P-32) ou ligando-se a ela corantes fluorescentes ou 
cromogênicos (substâncias incolores que produzem cor ao interagirem com um determinado meio). Em alguns 
casos, a sonda hibridizadora pode ser feita de RNA, em vez de DNA. Essa sonda irá parear com qualquer 
sequência de DNA complementar a ela. Portanto se a sequência procurada não estiver presente na amostra não 
haverá o pareamento. Então o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada (não 
pareada) será removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está 
presente) é revelada por uma autorradiografia em um filme de raio-X, ou pelo aparecimento de uma cor caso a 
marcação cromogênica tenha sido usada. 
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As manchas no Southern Blot ao lado mostram onde a sonda se hibridizou com a amostra. E conhecendo-se os 
pontos onde a amostra de DNA foi clivada, é possível então dizerem quais trechos a sequência procurada está ou não 
presente. 
 
OBS
2
: Finger print é o registro do DNA na eletroforese. Como já foi visto, fragmentos de maior tamanho correm menos 
(ficam mais perto do eletrodo negativo) e os menores correm mais (ficam mais perto do eletrodo positivo). 
 
 
GENÉTICA MOLECULAR 
 
STR 
 STR são sequencias de bases nitrogenadas repetidas em um 
cromossomo, mas variam de tamanho em relação de um alelo a outro. 
Essa técninca é baseada, então, em repetições de bases e o tamanho 
do cromossomo. 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DE “CENA DE CRIME” 
 
 
Observe no exemplo ao lado que, a partir da 
semelhança entre o DNA dos suspeitos de um determinado 
crime, por meio da eletroforese, pode-se comparar com um 
DNA deixado na cena desse crime. 
No caso, o DNA mais semelhante é o do indivíduo B, 
o que se mostraria então, suspeito principal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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TESTE DE PATERNIDADE E EXCLUSÃO DE PATERNIDADE 
Para entender como se faz testes de paternidade, deve-se lembrar que 
a prole sempre deve receber uma banda de DNA do pai e uma banda de DNA 
da mãe, ou seja, os filhos sempre recebem um cromossomo do pai e um 
cromossomo da mãe. Utilizando a eletroforese como base as repetições STR, 
pode-se comparar o DNA dos pais com os dos filhos. 
Se a criança tiver uma banda que a mãe não tenha, essa banda tem 
que ter vinda do pai, pois, como já foi discutido, a criança tem 50% das bandas 
(DNA) do pai e 50% (DNA) das bandas da mãe. 
 
OBS
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: Gêmeos monozigóticos possuem bandas iguais entre si. Já os 
dizigóticos, possuem bandas diferentes entre si. 
 
Com isso, conclui-se que, o indivíduo A (com bandas 6 e 1) pode ser 
fruto de uma relação extraconjugal do pai, pois metade de seus cromossomos 
(os que não vieram do pai então, deveriam vir da mãe) não vieram da mãe. 
Conclui-se também que, o indivíduo B poderia ser um filho adotivo do 
casal, já que nenhuma das bandas bate com o casal. 
 
 
 
 
 
 
 
Ex: 
 D1: Filha do casal. 
 D2: filha apenas da mãe. 
 S1: filho do casal. 
 S2: provável filho adotivo do casal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR-RFLP 
Em 1980, foi relatada a existência dos 
polimorfismos de comprimento de fragmento de 
restrição, ou RFLP (do inglês restriction fragment 
length polymorphisms), que são pequenas 
variações na sequência de DNA detectadas por 
enzimas de restrição. Estes RFLPs estão 
dispersos por todo o genoma humano e de 
acordo com os cortes de enzimas de restrição 
específicas, pode-se chegar ao resultado se tem 
um gene homozigoto normal, se é heterozigoto 
ou se é homozigoto afetado de alguma doença. 
Pode ser utilizada para determinar genes de 
doenças como a anemia falciforme, doença de 
Huntington, fibrose cística, etc. 
Porém, essa enzima só corta em regiões que possuam a trinca normal (no caso, CTT) e em casos de mutações 
(como a CAT), não é cortado. Com essa informação, no exemplo ao lado, a enzima de restrição cortou um fragmento de 
gene normal em três pedaços: um com 175 pares de bases, outro com 201 pares e outro sendo um fragmento maior. Já 
para o gene mutante, cortou-se apenas em dois fragmentos: um com 376 pares de base e outro maior. Se for feito o uso 
da eletroforese com esses fragmentos, encontram-se as diferenças de tamanho entre eles. 
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Conclui-se, então, que, em uma eletroforese: 
 Heterozigoto: é registrado todos os tipos de corte. 
 Homozigoto normal: é registrado a grande banda (em todos é 
registrado), e os cortes menores (201 e 176 no caso do exemplo) 
pois a enzima foi capaz de corta-los já que não são mutantes. 
 Homozigoto afetado: é registrado a grande banda e a banda 375 (as 
duas bandas menores não cortadas), pois a enzima não é capaz de 
cortar códon mutante (CAT). 
 
Ex: 
A figura ao lado mostra o resultado em gel de um experimento onde 
empregamos a técnica conhecida como PCR-RFLP para diagnosticar um 
indivíduo como portador de uma enfermidade genética recessiva. MPM, n e μ 
significam, respectivamente, marcador de peso molecular, alelo normal e alelo 
mutante. As letras a, b e c representam os resultados obtidos, respectivamente, 
para: 
 
 
Resposta: normal homozigoto, portador e afetado. 
 
 
 
 
CLADOGRAMA (DENDOGRAMA) E FILOGENIA 
 A filogenia determina que, por meio de comparação do material 
genético das espécies por meio de cladograma, é que se pode comparar o grau 
de proximidade entre as diferentes espécies. Por exemplo, o homem está mais 
próximo do macaco do que de um peixe, em termos de DNA. Traçando-se, 
assim uma escala evolutiva. 
 
 
 
 
 
 
 
TRATAMENTOS GÊNICOS 
 Terapia gênica: técnica utilizada para a cura de doenças utilizando genes sadios. Acontece por meio de troca 
de células de pessoas compatíveis ou até por meio de bactérias que lancem o gene sadio no DNA de células 
doentes. 
 Vacinas gênicas: faz uso de fragmentos de seres causadores de doenças, fazendo com que a produção de 
anticorpos pelo corpo seja mais eficiente, abundante e seguro. 
 Chips de DNA (micro arranjos): marcação do RNA de células cancerígenas diferentes por meio de fluorocromo 
para determinar se ele está ativo e qual gene que se expressa para sua produção. 
 
OBS
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: É importante o mapeamento genético de algumas doenças para o próprio tratamento e prevenção dela. Como por 
exemplo, linfoma difuso em células B, quando as mutações são nos genes lmo2, bcl6, fn1, a sobrevida é longa; nos 
genes cnd2, scy a3, bcl2 a sobrevida é curta e 60% dos quimioterápicos não funcionam.