Ponto de Controle G1

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FASE G1
*Ponto de Restrição = Ponto de Checagem
*Mitógenos estimulam síntese de ciclinas D e p21;
*p21 e 27 são cofatores estimuladores do complexo Cdk(cyclin-dependent protein kinase)4/6-ciclina D
	-aumentam a montagem do complexo Cdk4/6-ciclina D
	-importação nuclear de Cdk4/6-ciclina D
		#ativação das Cdks pela CAK (CDK-activating kinase)
		#aumento da estabilidade da ciclina D (meia-vida de 10 minutos – níveis baixos p/ ativar Cdk e o que é formado é inativo pela p27)
*Quando a ciclina D chega num limiar de concentração (início da fase S) ativa as Cdks.
*Qualquer par Cdk-ciclina pode fosforilar pRb (proteína de susceptibilidade a Retinoblastoma) – passagem pelo ponto de checagem: Cdk4-ciclina D, Cdk6-ciclina D, Cdk2-ciclina E e Cdk2-ciclina A
*pRb + E2F ligados a promotores via subunidade DP1 da E2F (complexo pRb/E2F/DP1 se ligam e inativam vários genes promotores específicos)
*pRb fosforilada se desliga da E2F.
*E2F/DP1 permanecem no promotor e são fortes fatores de transcrição para genes que codificam proteínas necessárias para síntese de DNA, avanço (ciclinas E e A e Cdk1) ou freio (pRb) do ciclo celular.
NA REPLICAÇÃO:
1) complexo Cdk-ciclina, chamado SPF (S-phase promoting fator)
2) que é responsável pela indução do complexo chamado pré-RC (pre-replication complex) que é
3) formado pela MCM (minichromosome maintenance proteins), Cdcbp (cell division cycle protein) mais o ORC (origin recognition complex) que, 
4) além de recrutar o MCM e o Cdcbp, o ORC (complexo de 6 proteínas) se associa
5) às origens de replicação (=ponto de partida) que são sequências de centenas de nucleotídeos, apesar de que 
6) em todas as origens há uma sequência comum de 11 nucleotídeos chamada ARS (autonomous replication sequence).
A) com a queda da concentração de ciclina, o SPF se desfaz,
B) e o ORC volta a se associar às origens de replicação e impedir nova replicação
NO CÂNCER:
*Perda da inibição por contato = células transformadas
*Anormalidades em duas classes de genes:
	-Oncogenes: ativação indevida causa transformação (p. ex.: reguladores do crescimento e da proliferação, componentes das vias de transdução de sinal)
	-Supressores de Tumor: inativação indevida causa transformação (produtos inibem produtos de oncogenes).
*Qualquer superatividade que mimetize ou induza o avanço além do ponto de checagem pode transformar uma célula.
*Ponto de checagem de dano no DNA em G1 tardio = proteína supressora de tumor p53 (essencial).
*Se em excesso é extremamente tóxica
*Regulada pela Mdm2 (ubiquitina-ligase –E3)
*A p53 estimula a expressão de Mdm2 que se liga a ela no citoplasma, levando-a ao proteossomo = feedback negativo
*Fosforilação da p53 por proteínas-quinases leva a estabilidade e aumento da p53 que induz aumento de expressão dos genes regulados por ela
*Expressão da proteína supressora de tumor p19 que liga e sequestra a Mdm2 no nucléolo (aumento da p53 no núcleo).
*A p53 induz apoptose (caspases (cysteinyl aspartate proteinases))
	-Citoesqueleto se desmonta, perda de contato com vizinhas: célula esférica;
	-Condensação do citosol e organelas;
	-Desintegração do envoltório nuclear
	-Compactação da cromatina, secção do DNA, fragmentação do núcleo
	-Protrusões superficiais (com restos nucleares)
	-Formação dos corpos apoptóticos (protrusões desprendidas)
	-Translação das fosfatidilserinas da parte interna para externa da membrana dos corpos apoptóticos
	-Quimiotaxia dos macrófagos devido às fosfatidilserinas
FASE G2
*Entrada em Mitose é regulada por Cdk1-ciclina B1
*Após formação do complexo Cdk1-ciclina B1, Cdk é ativada pela CAK e inativada pela Wee1.
*Por último Cdk1-ciclina B1 é ativada pela fosfatase Cdc25.
*Cdc25 é formada pelas:
	-Cdc25A: ?
	-Cdc25C: é ativada pela quinase Polo e remove fosfatos inibitório de Cdk1, sendo, após isso, ativada pelo seu próprio substrato (feedback positivo)
	-Cdc25B: participa para desencadear o ciclo de amplificação Cdk1-ciclina B1/Cdc25C. 
		 Atividade limitada em S e G2 devido a meia-vida baixa (30 minutos)
*O ponto de checagem de G2 envolve três componentes: sensores, quinases e efetores
*Genes Rad (sensíveis à radiação) e Hus (sensíveis a hidroxiuréia – inibidor da replicação) = ponto de checagem da estrutura do DNA.
*A estrutura formada por hRad9, hRad1 e hHus1 desliza pelo DNA e pode detectar danos.
*Detectado o dano, uma família quinase é acionada
*As duas mais importantes são a ATM (ataxia-telangiectasia) e a ATR (ataxia-telangiectasia e relacionada à Rad3)
*Ambas fosforilam p53 e Chk1 (checkpoint kinase 1)
*Chk1 é ativada por fosforilação e fosforila o Cdc25C
*Cdc25C fosforilado: a) inibição da atividade
		 b) produção de um sítio de ligação p/ as proteínas adaptadoras 14-3-3 = sequestro de Cdc25C no citoplasma
*2º alvo da ATM/ATR: p53
*p53 regula p21 que inibe Cdk1-ciclina A (100x + do que inibe a Cdk1-ciclina B1)(bloqueio da prófase)
*p53 ativa a 14-3-3σ que se liga a Cdk1-ciclina B1 e interfere no trajeto núcleo-citoplasma-núcleo ficando no citoplasma.
*Tempo para analisar erros e duplicar componentes citoplasmáticosPirimidinas (um anel): T, C e U
Purinas (dois anéis): A e G
*as reparações são enzima-específicas
*Mutações por erro de replicação, desaminação ou por apurinização
1) Durante a replicação, as DNA polimerases σ e β, através da Leitura de Provas, conseguem verificar o próprio erro e repará-lo via ação exonucleolítica 3’-5’ de uma subunidade.
2) Caso a leitura de prova falhe, uma nuclease reparadora [a mesma que remove os primers (RNA curto, 10 nucleotídeos – enzima: DNA primase e substituídos por DNA via DNA polimerase β e ligados ao DNA via DNA ligase)] corta as ligações fosfodiéster.
3) Em caso de desaminação ou apurinização, a seguinte sequência ocorre:
	-DESAMINAÇÃO = citosina em uracila e adenina em hipoxantina
	-APURINIZAÇÃO = perda de uma base (comum: purina); forma sítios AP (apurínicos ou apirimidínicos) = genes sem informação.
*DNA glicosidases específicas retiram as bases nitrogenadas
*a desoxirribose sem base é retirada por uma AP endonuclease e
*uma fosfodiesterase corta as conexões 5’ e 3’ do sítio AP e remove o açúcar
*uma DNA polimerase β insere o nucleotídeo correto e a DNA ligase termina.
4) Luz ultravioleta induz formação de dímeros de Timina
*duas nucleases em cada extremidade (ligações fosfodiéster) removem o dímero
*outras nucleases cortam a 5ª e 24ª ligação fosfodiéster contadas a partir do dímero na diração 3’ e 5’
*os 29 nucleotídeos são separados da cadeia normal pela helicase (corta as pontes de hidrogênio – dependente de ATP – posição: ângulo da forquilha)
*DNA polimerase β inseri uma nova sequência de nucleotídeos
*DNA ligase une ao resto do DNA.
FASE M
*Controle de qualidade do alinhamento dos cromossomos
*Membros: quinases conhecidas como Bub1p (brotamento desinibido por benzimidazol) e BubR1 (quinase relacionada a Bub1)
*BubR1 interage com a CENP-E (proteína motora cinesina gigante E – liga-se ao microtúbulo e ao cinetócoro = tensão) na placa externa do cinetócoro
*quinase BUB regula proteína Mad1p (mitotic arrest-defective protein) que ativa Mad2p.
*Mad2p interage com Cdc20 (cofator p/ reconhecimento do substrato APC/C (complexo promotor da anáfase/ciclossomo) 
*APC/C é uma ubiquitina ligase (E3) que marca securina (inibidora de protease) e ciclina B
*BUB e MAD ligam-se ao cinetócoro (todos)
*ativam a Mad2p que se assoscia a APC/C e o mantém inativo
*Cromossomos alinhados, fontes inibitórias removidas
*fonte acaba quando o último cromossomo se alinha
*vida curta do Mad2p, fim da fonte e liberação para anáfase