Estrutura e função dos cromossomos

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
*
Estrutura do DNA, RNA e proteínas.
Farmacogenética
*
*
James Watson & Francis Crick
Rosalind Franklin
*
*
Estrutura do DNA e RNA
Purinas – Adenina e Guanina
Pirimidinas – Citosina, Timina, Uracil
*
*
Os nucleotídeos contém: 1 grupo fosfato / 1 radical açúcar (desoxiribose) / 1 base púrica ou pirimídica 
*
*
*
*
*
*
*
*
Ribozima hammerhead
*
*
Organização do DNA em Cromossomos
Plasmídeos
Pequenos cromossomos bacterianos
Cromossomos
DNA e Proteínas
Telômero, centrômero
Procariotas X eucariotas
Núcleo
Tamanho do genoma
*
*
Cromossomo metafásico
*
*
Cromatina
Compactação do DNA 1,8 m de DNA em 6 mm de núcleo.
Mudanças no estado de compactação têm influência na atividade dos genes.
Complexo DNA + Proteínas = cromatina
Proteínas que participam da cromatina - Histonas
Proteínas com carga + presentes em altas quantidades.
H1 - H2A - H2B - H3 - H4
Nucleosomo 200 pb + histonas
Proteínas não histonas
Regulatórias, polimerases, etc.
*
*
Fibras sem enovelamento
*
*
Nucleosomo
Composto de histonas e DNA.
Duas voltas de DNA ao redor das histonas.
Parece haver uma preferência por certas sequências de DNA.
*
*
Nucleosomo
*
*
Fibras de 10 nm e 20-30 nm
*
*
Nucleosomo
Fibra de 300Å.
Histona H1 é importante.
Cromatina é subsequentemente compactada em uma solenóide contendo 6 nucleosomos.
*
*
Cromatosomo
*
*
Níveis de enovelamento
*
*
Fibras de 30 nm
*
*
Estrutura e Função
Heterocromatina
Compactada, poucos genes.
Região de heterocromatina varia com o tempo e local.
Regiões de microsatélites ao redor do centrômero
Eucromatina
Mesmo conteúdo de histonas que heterocromatina.
Convertida em heterocromatina durante a divisão celular.
*
*
Eucromatina X Heterocromatina
*
*
Inativação do cromossomo sexual
Um dos cromossomos parece mais denso.
Não é o mesmo cromossomo que é inativado em todas as células.
Cromossomo mitótico
H1 aumenta o grau de enovelamento - maior nível de fosforilação.
Cromossomos formam grandes alças (35 - 100 kb) ao redor de uma matriz proteica.
Matriz composta de várias proteínas - topoisomerase II
*
*
Base proteica da cromatina
*
*
Replicação do DNA
Segregação conservativa das histonas.
Giemsa - Bandas claras (eucromatina) e escuras (heterocromatina) refletem o nível de atividade do DNA.
Eucromatina - replica antes da heterocromatina.
Protaminas
Aumentam o grau de compactação do DNA no espermatozóide.
*
*
Núcleo Celular - Organização
Cromossomos são organizados.
Nucléolo - sequências de genes do rDNA repetidas
*
*
Núcleo
Heterocromatina condensada.
Poros.
Eucromatina.
Organização para a ativação de genes.
*
*
Poro nuclear
*
*
Poro nuclear
*
*
Transcrição e Tradução
*
*
Transcrição
Enzimas envolvidas na transcrição
Polimerases
Proteínas reguladoreas
RNA polimerases
*
*
RNA Polimerases
Escherichia coli
Levedura
*
*
Promotor Pribnow
*
*
Bolha de Transcrição
*
*
Transcrição em Procariotas Operon
*
*
Operon trp
*
*
Repressores
*
*
Regulação do gene trp
*
*
Tipos de RNA polimerases
RNA Pol I
RNA ribosomal
RNA Pol II
Vários RNAs (housekeeping)
RNA Pol III
Alguns RNA ribosomais, genes pequenos, não traduzidos, cópias múltiplas
*
*
Promotores
Sequências consenso de DNA aonde fatores de transcrição se ligam
Procariotas - Fatores Sigma s
Eucariotas - Fatores de Transcrição
*
*
Fatores em Trans
*
*
Transcrição em Eucariotas
Diferenças na RNA polimerase procariotas x eucariotas
Participação de outras proteínas no reconhecimento do promotor
*
*
Tipos de Fatores de Transcrição
Zinc Fingers
Helix-Turn-Helix
Leucine Zippers
Helix-Loop-Helix
Leucine zipper + DNA
*
*
Maquinário de Transcrição
*
*
Enhancers - Gene do Receptor de Células T
*
*
Controle de Expressão de Genes da
b-Globina
*
*
Receptor Glucocorticóide
Domínio de Ligação ao DNA
*
*
Receptor Glucocorticóide e DNA
*
*
Receptor de Gluco-corticoide
*
*
Término da Transcrição
Sinais de término
Em procariotas proteínas acessórias podem ser necessárias (fator rho - )
r
*
*
Controle de Expressão de Genes
*
*
Mudanças no RNA Após a Transcrição
Edição
Poliadenilação
Capping
*
*
Edição - Eliminação dos Introns
*
*
Capping
*
*
Poliadenilação
*
*
Processamento Diferencial
Transcrição de gene de Antennapedia iniciada em promotores diferentes
*
*
Processamento Diferencial
Estruturas de mRNA de Ultrabithorax geradas por processamento
diferencial de RNA
*
*
Regulação Combina-tória
*
Livro - A dupla hélice
The Double Helix : A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA by James D. Watson
*
Purinas – Adenina e Guanina SLIDE
Pirimidinas – Citosina, Timina, Uracil
*
Os nucleotídeos contém: 1 grupo fosfato / 1 radical açúcar (desoxiribose) / 1 base púrica ou pirimídica 
*
Os nucleotídeos são ligados entre si por ligações fosfodiester entre o grupo fosfato do nucleotídeo e a desoxiribose de um nucleotídeo adjacente. A direção das ligações, marcadas pelo carbono em que ocorrem dão a direção da cadeia, 5'ou 3'. 
Direção - importância para a síntese de RNA e DNA
*
Como a fita dupla se liga?
Uma purina com uma pirimidina
As ligações entre as duas fitas de DNA ocorrem entre Adenina e Guaninca ou Citosina e Timina.
As ligações entre as duas fitas são de pontes de hidrogênio, fracas. Isto é um dado com importância prática grande. Observar que 3 pontes de hidrogênio unem C e G e duas A e T. 
A própria estrutura já prevê um meio de duplicação. Uma fita serviria de molde para a construção de uma fita nova. As sequências são complementares.
A estrutura do RNA é semelhante à do DNA, trocando o açúcar deoxiribose por ribose e ao invés de timina, o RNA usa uracil.
A própria estrutura do DNA indica um modo de replicação, mas a prova disso precisou de mais algum tempo para aparecer.
*
*
Hammerhead
	menor ribozima conhecida - viróides de plantas
	cliva o RNA em sequências específicas - grande flexibilidade
	utilizada na inativação de vírus HIV, correções de mutações 	(mudança de base única)
Síndrome de Marfan - mutação no gene da fibrilina, cromos 15
	Hammerhead pode reduzir a deposição de fibrilina em 		fibroblastos de cultura
Distrofia muscular
	pode mediar o reparo de um gene mutante (edição do final 3’do 	gene causador proteína kinase) - mudança do número de 		repetições de uma unidade
*
Moléculas lineares de DNA
	1 mol. de DNA específica ligada a um grande número de 		proteínas
Plasmídeos
	Carregam genes que conferem resistência a antibióticos (grande 	utilidade)
	Relaxados - muitas cópias na célula
	Estringentes - poucas cópias na célula
Procariotas X Eucariotas
	membrana nuclear
	diferença do tamanho da célula e genoma - vírus, bactéria, 		levedura, eucariotas complexos - maior célula/organismo - 		maior complexidade - maior genoma
	adaptação do metabolismo ao meio e ao tecido (cada célula ou 	tecido expressa uma pequena quantidade de genes
	
*
Extrema compactação do DNA para a divisão celular
Durante a interfase também há a compactação do DNA nuclear
Veremos que:
	compactação não é aleatória, segue uma ordem
	pequenas alterações nesta ordem podem gerar mudanças no 	padrão de expressão gênica
*
Cromatina - complexo formado pelo DNA e proteínas que auxiliam a sua compactação. Proteínas - histonas
Histonas
Proteínas não histonas
	não participam da estrutura da cromatina
	o enovelamento ao redor das histonas facilita o acesso de outras 	proteínas ao DNA, mas apenas 1 lado do DNA fica disponível
*
*
Nucleosomo - Participam histonas H2A, H2B, H3 e H4, 2 mol de cada
Proteínas não histonas
*
O DNA dá 2 voltas
ao redor das histonas (aprox. 146 pb)
O enovelamento do DNA não é exato, ele fica retorcido em certos pontos - espiral
Os nucleosomos seguem uma fase, não estão dispostos aleatóriamente
	Nucleosomos têm disposição semelhante em células 		de um mesmo tecido
	Flexibilidade da sequência influencia a ligação de nucleosomos
	Muitas sequências repetitivas também atraem a formação de 	nucleosomos
*
*
Próxima ordem de grandeza na organização - Fibra de 300A
	
*
Descondensada em genes ativos
	Participação importante da histona H1
	Cromatina compactada em solenóide contendo 6 nucleosomos, 	fixando o DNA ligante e as histonas por dentro
*
*
*
Heterocromatina
	Mesmo conteúdo de histonas que a eucromatina
Eucromatina
*
*
Cromossomos sexuais
	Um dos cromossomos sexuais aparece um pouco mais 		compactado do que o outro
Os cromossomos não estão condensados igualmente em todas as células
O DNA dos cromossomos sofrem mudanças químicas diferentes dependendo do tipo celular - metilação
As regiões de heterocromatina variam com o tempo e o tipo da célula
Sequência de DNA - estrutura: Ao redor dos centrômeros, regiões de DNA repetitivo (minisattélite) estão sempre presentes como heterocromatina
Cromossomo mitótico
	H1 aumenta o grau de enovelamento dos cromossomos e parece 	estar extensamente fosforilada (regulação)
	
*
	 Cromossomos formam grandes alças ao redor de uma base 	proteica (35 - 100 kb)
	Uma das proteínas da base proteica é a topoisomerase II 		(girase)
*
Replicação do DNA
	Problema: assumir a mesma constituição anterior (pelo menos 	em uma das fitas) - manter a regulação
	Heterocromatina - replica tarde
	Eucromatina - replica cedo
Protaminas
	Funcionam como histonas
	
*
Núcleo
	Interfase também é organizada
	Nucléolo - rDNA
*
Heterocromatina condensada fica presa por uma matriz proteica ao redor da parte interna da membrana
	Base proteica: filamentos intermediários, lamina tipo A 		(nucleoplasma) e tipo B (membrana nuclear)
	Fosforilação da lamina inicia uma reorganização nuclear com a 	sua quebra em vesículas (apoptose)
Cromatina está ausente das regiões ao redor dos poros
Há ainda uma organização na eucromatina. Aparentemente genes ativos estão mais associados à base proteica. A idéia é de que nesta base proteica estão proteínas envolvidas no processo de transcrição. Os promotores parecem estar presos à matriz.
*
Poro
	Diâmetro de 10 nm
	Transporte:	5000 kDa - difusão
		17000 kDa - 2 min. p/ equilíbrio
		44000 kDa - 30 min. p/ equilíbrio
		60000 kDa - não entra por difusão
	Transporte ativo
		Dilatação do poro em até 26 nm
		Sinalizado por sequências de peptídeo
		Controla a direção do transporte
		A alteração do final 5’ou 3’do RNA altera o seu 		transporte
*
*
Porque RNA?
	Proteção do DNA do ambiente citoplasmático
	Ampliação da informação
	Maiores meios de controle da expressão genética
Procariotas
	Transcrição e tradução simuntâneas (não tem núcleo)
	Mensagens policistrônica
	Rápida adaptação ao meio - aumento da quantidade de RNA
Eucariotas
	Regulcção da atividade genética é muito mais complexa
*
Síntese sempre ocorre 5’ para 3’
RNA Pol E. coli - vistas da holoenzima
	2 subunidades alfa e 2 beta
	se liga a uma variedade de proteínas regulatórias - fatores sigma
	dentro do canal se acomoda o DNA
	1 Pol para todos os genes
RNA Pol de levedura (RNA Pol II)
	Canal de DNA - se bifurca em canal mais fino - fita simples de 	DNA
	
*
Promotor
	Direciona a RNA Pol.
	Presente em alguma forma em todos os genes
	-10 (Probnow box) e -35
	RNA Pol estica a fita dupla e inicia a transcrição de uma das 	fitas
	Fita de onde copia - Antisenso
	Fita complementar - Senso
*
Região de iniciação - promotor
	região de ligação do repressor (maioria)
	Pol interage com o operador (5’ do promotor)
	desenrolamento do DNA
	orienta a Pol - qual fita é transcrita
Promotor
	sequência consenso
	se inicia com uma purina
	transcritos têm um trifosfato a 5’
Fator de Transcrição Sigma
	se liga específicamente ao promotor
	forma a holoenzima para o reconhecimento do promotor correto
*
Lac Operon
	Ativar os genes para a metabolização de lactose caso não haja 	glicose no meio
	Operon regulado por catabólito - produção de genes necessários 	para a utilização de energia
	Aplicação de um estímulo (lactose) induz nova atividade 		enzimática (B-galactosidase, Lac permease e tiogalactosidase 	transacetilase) - maior transcrição do gene, regulação a nível 	transcricional
	Genes em um operon são expressos lado a lado (mensagem 	policistrônica)
	Regulação da expressão pelo operador e o promotor
	Repressor (gene i) se liga ao operador inibindo a transcrição
	A mol. Efetora (indutora) se liga à inibidora mudando sua 		atividade biológica
	Regulação alostérica- mudança na região que liga ao DNA
	Regulação negativa
Regulcção Positiva em Procariotas
	Aumento de cAMP, cAMP se liga a CAP, complexo se liga ao 	promotor induzindo a expressão do operon
Controle da expressão das proteínas regulatórias
	Falta da controle Lac I
	Repressor é parte do operon que ele regula
	Controle por outro sistema de repressão
	
*
Operon atenuado - genes cujos produtos são necessários para a biosíntese de 	moléculas
	Gene que participa da biosíntese to triptofano
	Triptofano é corepressor - aumenta a afinidade do repressor 	pela região regulatória
Região atenuadore - localizada a 3’do promotor na região transcrita
	controla após a ligação da RNA Pol
*
*
Região atenuadora
	localizada a 3’do promotor na região transcrita
	Altas quantidades de tRNA carregados favorece a formação do 	stem loop 3-4 que termina a transcrição do gene inibindo a 		síntese de triptofano
	também presente em operons que controlam a síntese de vários 	outros aminoácidos
*
Polimerases e fatores de transcrição são altamente conservados 		evolucionáriamente
Pol II - mRNAs, snRNAs (splicing) - controle mais complexo
Velocidade - 30 nt por segundo (DNA Pol 1000 nc/seg)
Fidelidade - baixa
alpha-amanitina distingue as polimerases
	baixa [] afeta mRNAs e tRNAs
*
Promotores diferentes têm eficiências diferentes
Promotores básicos - CCAAT e TATA (-20 a -30) boxes 
	TATA - TFIIA, B e C
	CAAT - C/EBP
Sequências regulatórias localizadas upstream do início de transcrição
Tipos celulares exibem fatores de transcrição característicos
*
Gene composto de 2 exons e 1 intron
TFIIB - liga à TATA box
Outras sequências regulatórias são mostradas
*
Observar a fosforilação da RNA Pol II pelo TFIIF
*
Domínios
	Ligação ao DNA - sequência específicos
	Ativação - interage com outros fatores de transcrição
*
*
Enhancers - Elementos distais dos promotores, regula os promotores
	Em geral não essenciais, mas aumentam muito a trañscrição
	Proteínas que se ligam ao enhancer fosforilam fatores de 		transcrição regulando sua atividade
	pode estar de 4,5 a 50 kb do promotor, como ele chega ao 		promotor não é conhecido), pode estar em qualquer orientação
Receptor células T alfa
	ATF/CREB - leucine zipper
	Lef-1- HMG - induz uma torção no DNA, promovendo o 		contato entre as outras proteínas
*
Fatores de transcrição comuns - CP1
Fatores de transcrição específicos (precursores de eritrócitos) - GATA-1
GATA-1 pode se ligar em regiões que também são ocupadas por outros fatores de transcrição
*
*
*
Baixos níveis - vários fatores de transcrição podem se ligar e ativar os genes
Altos níveis - ativação na presença de glucocorticóides
*
Em procariotas o sistema é bem descrito
	auxílio do fator rho que reconhece a sequência específica
	sequências capazes de formar um stem loop - desestabiliza a associação com a RNA Pol
*
Lembrar também do papel da cromatina na expressão genética
	Alguns fatores de transcrição se ligam ao DNA quando ele está 	enrolado em nucleosomos (TFIIA), outros não (gene PHO2 - 	levedura)
Ativação requer síntese proteica
	Necessária a síntese de fatores de transcrição
Modos de regulação
	Transcricional - o mais importante
	Processamento
do transcrito - edição diferencial
	Transporte do RNA - precisa ser levado ao citoplasma
	Estabilidade do transcrito - RNAs mais estáveis que os 		procariotas. Existem sinais para degradação rápida
	Iniciação da tradução - início do codon correto
	Modificações pós-traducionais
	Transporte proteico - chegar ao sítio de ação
	Estabilidade proteica - vida média varia muito e pode ser 		regulada por aa específicos 
*
*
Introns grupo I - nuclear, mitocôndria e cloroplastos de rRNA
Introns grupo II - genes de mitocôndria e cloroplasto
Muitos introsn são auto-editáveis
Introns grupo III - a maioria
	Forma uma estrutura de loop interna - estrutura Lariat
	Splicing é catalizado por SNRNPs (small nuclear ribonuclear 	protein)
	SnRNPs - U1, U2, U4, U5 e U6 - altamente conservados
	U1 - complementar ao fim 5’do intron
	U2 - complementar ao fim 3’do intron
	Com os outros SNRNPs um spliceosomo é formado que remove 	o intron e junta os 2 exons
Introns grupo IV - requerem endonucleases específicas, encontrado em tRNAs
Doenças causadas por splicing errado - Beta talassemias- gene da beta globina
	problema de mutação nas regiões de edição do intron
	Várias doenças do tecido conjuntivo
	Lupus - anticorpos contra o U1
*
Ligação de dois finais 5’ pelos grupos fosfato 3’G-PPP-N3’
	Adição de um grupo metil à guanina
*
Adicionada ao final 3’do RNA
	Só realizada pela RNA Pol II por causa de fatores que formam a 	holoenzima
	Realizada pela poliadenilato polimerase- cliva 11-30 resíduos 	do final 3’e adiciona 20-250 resíduos de adenina
*
Processamento diferencial
	Início em 2 introns distintos
	Fatores de transcrição distintos são responsáveis pelos 		diferentes locais de iniciação
	Transcrito 1 - desenvolvimento dorso-tórax
	Transcrito 2 - desenvolvimento ventral-tórax
*
Produção de proteínas com funções diferentes, mas com semelhanças
	todas participam do desenvolvimento embrionário, mas 	algumas determinam linhagens celulares específicas e outras 	não
*