Clonagem gênica

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Clonagem Gênica
Utilização da Clonagem Gênica
Genes sem o conhecimento da seqüência
Utilização de fragmento superiores a 40 Kb
Aplicação:
- Obtenção de DNA em grande quantidade
- Separação de fragmentos de DNA em uma mistura
Clonagem Gênica
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Clonagem Gênica
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Clonagem Gênica
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Clonagem Gênica
Produtos de ligação
Clonagem Gênica
- Moléculas de vetor que não foram ligadas
- Fragmentos de DNA que não foram ligados
- Moléculas do vetor recircularizadas sem a 
inserção do DNA
- Moléculas de DNA recombinante portadoras 
de outros fragmentos 
Clonagem Gênica
Todas as moléculas circulares serão clonadas
Clonagem Gênica
- Transformação: incorporação de DNA por 
células bacterianas, fúngicas, animais e 
vegetais
- Células competentes: células submetidas 
ao processo de incorporação do DNA
- Células transformadas: células contendo o 
plasmídeo
Transformação
Como identificar a célula com 
vetor da sem vetor?
Marcador de Seleção
Marcador de Seleção
Como identificar o vetor 
recircularizado contendo a 
inserção do DNA?
Identificação do Recombinante
pBR322
Pbr322 como Recombinante
Seleção de Recombinante
Plaqueamento em réplica
Colônias em meio com ampicilina
pUC8 Plasmídeo LacZ’
pUC8 Sítio de Restrição
pUC8 como Recombinante
lactose glicose + galactose
β-galactosidase
Gene Lac Z‘
A função do gene LacZ’
Identificação do Recombinante
(Seleção Lac)
5-bromo-4cloro-3’indolil-β-D-galactopiranosídeo
isopropiltiogalactosídeo
meio com ampicilina
Seleção de recombinantes de pUC8
Como identificar o clone desejado?
Estratégias para obtenção
do clone desejado
- Seleção direta do gene desejado.
- Identificação do clone a partir de uma 
biblioteca genômica. 
pBR322
Seleção direta
I
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Introdução de fagos em bactérias
- Transfecção: equivalente a transformação
- Infecção (empacotamento in vitro): 
montagem do bacteriófago in vitro com a 
inserção do DNA 
Obtenção das proteínas do fago λ
Empacotamento em linhagem única 
Replicação do fago λ
3’
5’
XXX
X
Obtenção das proteínas do fago λ
Empacotamento em duas linhagens 
Fago λ
componentes do capsídeo integração do profago replicação
Empacotamento do fago λ
Empacotamento in vitro
Visualização da infecção
Placas líticas Placas de M13
Identificação de fagos 
recombinantes
componentes do capsídeo integração do profago replicação
Lac Z’
Identificação de fagos recombinantes
Inativação por inserção do gene Lac Z’
Identificação de fagos 
recombinantes
componentes do capsídeo integração do profago replicação
Identificação de fagos recombinantes
Inativação por inserção do gene cI de λ (posição 38)
	Clonagem Gênica
	Utilização da Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Clonagem Gênica
	Transformação
	Como identificar a célula com vetor da sem vetor?
	Marcador de Seleção
	Marcador de Seleção
	Como identificar o vetor recircularizado contendo a inserção do DNA?
	Identificação do Recombinante
	pBR322
	Pbr322 como Recombinante
	Seleção de Recombinante
	pUC8 Plasmídeo LacZ’
	pUC8 Sítio de Restrição
	pUC8 como Recombinante
	Gene Lac Z‘
	Identificação do Recombinante�(Seleção Lac)
	Como identificar o clone desejado?
	Estratégias para obtenção�do clone desejado
	pBR322
	Slide Number 27
	Introdução de fagos em bactérias
	Obtenção das proteínas do fago λ 
	Replicação do fago λ
	Obtenção das proteínas do fago λ
	Fago λ
	Empacotamento do fago λ
	Visualização da infecção
	Identificação de fagos recombinantes
	Identificação de fagos recombinantes
	Identificação de fagos recombinantes
	Identificação de fagos recombinantes