Processo de Transcrição e RNA

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http://www.youtube.com/watch?v=DoSRu15VtdM
http://www.youtube.com/watch?v=icZjgZozkB8
http://www.youtube.com/watch?v=4X8eK15R8yY
http://www.youtube.com/watch?v=kCxQdXX0Dbk
http://www.youtube.com/watch?v=XqBEDVvWn5w
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Fluxo da informação
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Tipos de RNAs produzidos pelas células
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31
21
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33
50
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tRNA
Braço aceptor
Alça TψC 
Alça do aticódon
Alça D
Alça variável 
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Eucariotos: Três RNA polimerases 
Procariotos: Uma única RNA polimerase
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Canal de saída
do RNA
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Fita codificadora X Fita molde
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Estrutura dos genes de procariotos
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TTGACA
TATAAT
AGGAGGT
ATG
TGA
CODONS
ATGCCGCA TGCGGCA TTTTTT
Promotor 
Regiões -35 e -10
Shine-Dalgarno
Janela aberta de leitura
Região de terminação da transcrição
Código de iniciação da tradução
Código de terminação da tradução
Início da transcrição
+1
Estrutura dos genes de procariotos
5’ UTR
3’ UTR
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Transcrição de RNA em procariotos
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RNA Polimerase de Procariotos
Complexo de múltiplas subunidades (α2ββ’ σ)
Subunidade ou fator sigma (σ)
Liga-se fortemente ao promotor
Abre a dupla hélice independentemente de hidrólise do ATP
Reconhece um sinal de terminação
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Promotores de procariotos
Fita codificadora
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Shine-Dagarno
5’ UTR
3’ UTR
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Fita molde
Fita codificadora
RNA Polimerase:
Sinais de iniciação e terminação
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RNA polimerase de procariotos
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Iniciação: Fatores gerais de transcrição
		Ativadores
		Mediadores
		Promotores
		Acetilases de histonas
		Complexo remodelador de cromatina
Etapas da transcrição de RNA em eucariotos
Extensão: Fatores de extensão
		 Topoisomerases		
Processamento: Capeamento da extremidade 5’
			 Splicing 				 		 	 Poliadenilação da extremidade 3’
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Promotores de eucariotos
Inr= seqüência iniciadora
Região onde ocorre a atividade de helicase 
Y= C/T
N= A/C/G/T
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Complexo Basal de Transcrição: Fatores gerais de transcrição + RNA Polimerase II
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TATA-BOX – TBP – TFIIB 
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Iniciação da transcrição
http://www.youtube.com/watch?v=icZjgZozkB8
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Associação da maquinaria de 
processamento com a RNA pol II:
o papel do domínio C-terminal
(CTD) da RNA pol II
 Y-S-P-T-S-P-S
(26 repetições em levedura, 
 52 em mamíferos)
Extensão da transcrição e processamento
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Estrutura dos genes de eucariotos
Inserir imagens
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Estrutura geral de um mRNA de eucarioto
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Adição do CAP 
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Adição da cauda poliA
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Clivagem e poliadenilação de mRNA
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Sequências consenso envolvidas no cis-splicing
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Etapas do cis-splicing
1- clivagem da ext. 5´do íntron e formação do ponto de ramificação (laço)
2- clivagem da ext 3’ do íntron e
 ligação dos éxons
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Spliceossomo
(Complexo de proteínas e RNA que realiza o splicing)
snRNAs envovidos no cis-splicing
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Splicing alternativo
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Transporte de mRNAs para o citosol
http://www.youtube.com/watch?v=J3HVVi2k2No&feature=player_embedded#! 
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As setas na figura da direita indicam o sentido da dobradura das alças do tRNA para formar a estrutura secundária.
Nome das alças: 
1- Braço aceptor – recebe o aminoácido na extremidade 3`
2-Alça D – (base modificada Dihidrouridina)
3- Alça do anticodon (possui o anticondon)
4- Alça TψC também chamado braço T (Possuiu base modificada uma pseudouridina )
5 –Alça variável (alguns t RNAs possuem ainda uma quinta alça variável)
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miRNAs são reguladores pós-transcricionais que se ligam a sequências complementares de RNA mensageiro alvo (mRNAs), geralmente resultando em repressão traducional ou degradação e silenciamento de genes alvo. O genoma humano pode codificar mais de 1000 miRNAs, que podem atingir cerca de 60% dos genes de mamíferos e são abundantes em muitos tipos de células humanas. Existem vários tipos dependendo o tamanho e mecanismo de ação. Ex. siRNA, mi RNA e piRNA.
Piwi-interacting RNA (piRNA) é a classe dentre os small RNA, de maior tamanho e é expresso em células animais. Os piRNA formam complexos de RNA-proteinas interagindo com as chamadas proteínas Piwi. Estes complexos piRNA estão envolvidos no silenciamento transcricional de genes de transposons e retrotransposons além de alguns outros elementos genéticos de células germinativas, em especial daquelas envolvidas na espermatogênese. A maior parte das sequências já identificadas de piRNAs são antisenses de transposons. Os piRNAs diferem dos miRNA quanto ao tamanho (têm 26–31 nt no lugar de 21–24 nt), não têm sequências conservadas e são mais complexos. Não está claro como os piRNAs são gerados, mas aparentemente a origem difere dos miRNAs e siRNA. Os rasiRNAS parecem ser subespécies dos piRNAs. Os piRNAs formam clusteres no genoma podendo variar de 10 a milhares de cópias em regiões que variam de 1 a 100 kb. Os clusteres são conservados nas espécies e podem estar ou não em regiões próximas a regiões codificadoras, mas as sequências não são conservadas. Em mamíferos os piRNAs são encontrados nos testículos, mas em invertebrados podem ser observados tanto em células germinativas femininas quanto masculinas. Podem ser observados tanto no núcleo quanto no citoplasma.
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Cerca de 17 bases da dupla hélice de DNA é desnaturada e desenrolada no sítio ativo da RNA polimerase de cada vez, sendo que 12 pares DNA-RNA são formados na região.
Ao contrário da DNA polimerase a RNA polimerase não requer um iniciador, mas usualmente inicia a fita com um GTP ou ATP. 
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Subunidade sigma- reconhece a região promotora (tem sigmas diferentes para conjuntos diferentes de genes, que reconhecem promotores relativamente diferentes) 
Ex. Sigma 70 – reconhece promotores de genes constitutivos
 Sigma 32 –reconhece promotores de genes heat-shock
Cerne α2ββ’ – contém o sítio catalítico
β’ – liga ao DNA molde e β - liga os ribonucleotídeos trifosfatos e forma as ligações fosfodiester.
α2 – tem papel estrutural.
 
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Promotor de procariotos está presente no DNA e não no RNA
Região -10 = Pribnow box
Região -35 
Elemento UP
As sequencias dadas acima referm-se a fita codificadora, mas a subunidade β’ se liga na fita molde.
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Sinais de iniciação e terminação de Transcrição no DNA de E. coli 
(A) A RNA polymerase se liga a uma região promotora no DNA que apresenta as sequências mostradas (regiões -10 e -35). Uma vez que a polimerase está ligada, a transcrição se inicia em um sinal ATG na fita molde (correspondente a sequência CAT na fita codificadora e CAU no mRNA) e procede até que o sinal de terminação seja encontrado. (B) O sinal de terminação consiste em uma sequência auto-complementar seguida de 4 a 8 adeninas (correspondendo a timinas na fita codificadora). (C) Neste ponto a cauda do mRNA nascente forma um grampo curto de dupla-hélice que paralisa a síntese do RNA pela polimerase. Note que a RNA polimerase insere uracilas onde a DNA polimerase iria adicionar timinas.
O sinal de terminação tem dois componentes. Primeiro: existe uma região cuja sequência de bases permite o auto anelamento da cauda do mRNA em forma de grampo. Segundo, as bases do grampo são seguidas por 4 a 8 adeninas. Quando copiados, o mRNA forma o grampo que juntamente com o pareamento AU formado entre as ademinas do DNA molde e as correspondentes uracilas do mRNA, não é estável o suficiente para manter o híbrido DNA: RNA. A RNA polimerase. 
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- Para iniciar a transcrição a RNA polimerase precisa da ajuda de um grande conjunto de proteínas chamadas de FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO , que precisam estar na região promotora do gene, junto com a RNA polimerase, antes que a RNA polimerase inicie a transcrição. (Este conjunto RNA polimerase II + fatores de transcrição é chamado de complexo basal da transcrição). 
Os FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO ajudam a posicionar a RNA polimerase corretamente na região promotora do gene,
ajudam a separar as duas fitas de DNA para a transcrição começar e liberam a RNA polimerase da região promotora do gene até o modo de alongamento onde a transcrição começa. 
Essas proteínas são ditas gerais porque se posicionam em todos os promotores usados pela RNA polimerase II. São chamados FT II (Fatores de Transcrição para a RNA polimerase II).
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O Tata box é reconhecido pelo FTIID e ou FTIIA (FTIID contém a TBP Tata binding protein, FTIA estabiliza a ligação do TBP ao promotor)
2) Isto permite o recrutamento do FTIIB, que por sua vez recruta o FTIIF que juntos posicionam a RNA polimerase II com exatidão no sítio de iniciação.
O demais fatores se ligam na sequência: FTIIE e FTIIH, o penúltimo é uma helicase (hidrolisa ATP e abre a dupla helice de DNA) e o último uma fosforilase (usa ATP para fosforilar a cauda C terminal da RNA polimerase).
A fosforilação da cauda c terminal da RNA polimerase a libera dos demais fatores permitindo a extensão da transcrição.
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Ocorrre fosforilação do domínio C-terminal da RNA pol II liberando a subunidade maior da RNA Pol II que escapa do promotor iniciando a transcrição
Y-S-P-T-S-P-S = Tirosina-Serina-Prolina-Treonina-Serina-Prolina-Serina
Estrutura de genes de eucariotos
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A estrutura genérica de um mRNA eucariótico, ilustrando alguns elementos de regulamentação pós-transcricional que afetam a expressão do gene. Abreviações (de 5 'para 3'): região 5’UTR região 5’ não traduzida; M7G, cap 7-metil-guanosina; hairpin, estruturas secundárias hairpin like; uORF, janela aberta de leitura a montante; IRES, sítio de entrada interna do ribossomo; CPE, elemento de poliadenilação citoplasmática; AAUAAA, sinal de poliadenilação nuclear. uORF (upstream Open reading frame) codifica um pepitídeo em geral de menos de 25 aa, que impede a libertação do mRNA do ribossoma no códon de parada. Isso configura um bloqueio do escaneamento do ribossomo que minimiza tradução do mRNA jusante.
Zip Code (ou Cep em português) é um sistema de códigos postais utilizado pelo United States Postal Service (USPS) desde 1963. Aqui por analogia refere-se a sequencia no RNA que dirigem a expressão gênica em determinadas organelas.
Especificamente, as sequências em UTR 3 'do mRNA atuam como um "código postal" para o transporte. O código postal ou "cis-acting elemento" associados com uma RBP específica ou "factor de trans-acting", que medeia o transporte do mRNA para o local da tradução. O mRNA é transportado como uma partícula ribonucleoproteína contendo uma maquinaria completa de síntese de proteína: RBP, proteínas "motoras" de translocação, ribossomos, e fatores de tradução.
Mignone et al. Genome Biology 2002 3: reviews0004.1 doi: 10.1186/gb-2002-3-3-reviews0004
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Processo de adição do CAP
1) Um dos grupos fosfatos terminais é removido (por uma fosfatase do RNA do terminal), deixando dois fosfatos terminais. 2) Um GTP é adicionado aos fosfatos terminais (por uma guanilil transferase), há perda de dois grupos de fosfatos (a partir do GTP) no processo. Isto resulta na direção de ligação 5 'para 5’. 3) O nitrogênio 7 da guanina é metilado (por uma metil transferase). 4)  Se a segunda base do terminal é adenina, ela pode ser metilada. A terceira base do terminal é metilada em 10-15% do das vezes
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Durante a fase final da transcrição proteínas envolvidas com a terminação da transcrição são associadas a cauda CTD fosforilada da POLII. Entre estas proteínas se encontram aquelas envolvidas coma clivagem e poliadenilação do mRNA. Este processo:
- Inclui a adição de uma série (+- 200) de AAAAAAAAAAs - Depende sequência no pré-mRNA AAUAAA que é o sinal de poliadenilação - É realizado por poli-A polimerase - PAP - Várias outras proteínas também estão envolvidas incluindo: CPSF - Fator de especificidade de clivagem e poliadenilação CStF - Fator de estimulação de clivagem 
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Em Drosophila, a determinação do sexo é alcançada por um balanço de determinantes do sexo feminino no cromossomo X e determinantes do sexo masculino nos autossomos. Normalmente, as moscas têm um ou dois cromossomos X e dois conjuntos de autossomos. Se há apenas um cromossomo X em uma célula diplóide (1X: 2A), a mosca é do sexo masculino. Se existem dois cromossomos X em uma célula diplóide (2X: 2A), a mosca é do sexo feminino. Esse balanço é sentido através de um conjunto de 3 genes que sofrem splicing alternativos, um dos quais é o gene dublesex.
A primeira fase da determinação do sexo em Drosophila envolve a leitura da relação X:A. Que elementos no cromossomo X são "contados", e como essa informação é usada? Parece que altos valores de X:A ativam o gene feminilizante Sex-letal (SXL). Em células X0, SXL permanece inativo durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Em Drosophilas XX, SXL é ativado durante as primeiras duas horas após a fertilização, e este gene transcreve um tipo embrionário particular de mRNA SXL que é encontrado por apenas cerca de 2 horas. Uma vez ativado, o gene SXL permanece ativo porque seu produto de proteína é capaz de ligar e ativar seu próprio promotor e ativar o splicing alternativo feminilizante.