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1a ATIVIDADE – OBSERVAÇÃO AO M.O.C. DE LÂMINA OBTIDA A PARTIR DE SANGUE PERIFÉRICO. 1 – Localize na bancada a lâmina de sangue periférico previamente preparada. 2 – Com os procedimentos corretos, observe a preparação com as objetivas de 4, 10 e 40 no M.O.C. e anote o que foi observado. 3 – Com os procedimentos corretos , observe novamente a lâmina, agora com a objetiva de 100 – imersão e anote o que foi observado. 4 – Responda a(s) questão(ões) proposta(s) na folha de respostas. MITOSE MEIOSE n DE CROMOSSOMOS ERROS ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS Formação indivíduo Linhagem celular não-disjunção meiótica/mitótica NUMÉRICAS ESTRUTURAIS CROMOSSOMOS AUTOSSÔNICOS CROMOSSOMOS SEXUAIS AMBOS MITOSE MEIOSE n DE CROMOSSOMOS ERROS ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS Formação indivíduo Linhagem celular não-disjunção meiótica/mitótica NUMÉRICAS ESTRUTURAIS CROMOSSOMOS AUTOSSÔNICOS CROMOSSOMOS SEXUAIS AMBOS Cariótipagem alta resolução – Analise na prófase Metáfase Prometáfase Prófase Estudo cromossômico Citogenética clássica Citogenética Molecular Cariótipo por Bandamento G Metáfases , Núcleos interfásicos Citogenética Molecular Cariotipagem espectral (SKY) Citogenética de tumores t(9;22) Hibridização de ácidos nucléicos FISH Leucemia Mielóide Crônica t(9;22) Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo. Cariotipagem espectral (SKY) Cariótipo por Bandeamento G Método Padrão em CITOGENÈTICA Giemsa Adenina e Timina do DNA Bandas Claras -Eucromatina -Ricas em Guanina e Citosina -Mais genes ativos G + G - Bandas Escuras -Heterocromatina -Ricas em Timina e Adenina -Menos genes ativos Cariótipo por Bandeamento G Material a ser analisado (sangue) Adicionar droga que estimula a divisão celular (no caso dos linfócitos – fitoemoglutinina) Adicionar droga que bloqueia a divisão celular em metáfase (colchicina) Romper as células com uma solução hipotônica Fixar e gotejar sobre as lâminas para o microscópio Coloração (Giemsa) Cariotipagem Microscópio Cariótipo por Bandeamento G Sangue como material biológico Coletar 3 a 5mL de sangue em tubo ou seringa usando heparina sódica como anticoagulante 1. AMOSTRA Meio de Cultura 2. CULTURA LINFOCITÁRIA Enriquecimento: Fitoemaglutinina 10 a 12 gotas de sangue ou Camada de Linfócitos Estufa - 72 horas Colchicinação Interrupção da mitose na Metáfase Estufa 45-60 min Centrifugação Após centrifugação Retirar sobrenadante Adicionar 5ml Hipotônica Estufa por 20 min Hipotonização Centrifugação Fixação Preparação das lâminas Reagentes Banda G Fotomicroscópio Cromossomos-fase metafásica Análise das lâminas CARIOGRAMA Cariótipo por Bandamento G • Morfologia e classificação cromossômica posição do centrômero; • Braço curto (p) orientado para cima; Braço longo (q) para baixo • Organização do Cariótipo GRUPO CROMOSSOMOS CARACTERÍSTICAS A 1 a 3 Maiores 2 metacêntricos 1 submetacêntrico B 4 -5 Pouco menores submetacêntricos C 6 a 12 Similares Ordem decrescente de tamanho metacêntricos a submetacêntrico D 13 a 15 Médio acrocêntricos E 16 a 18 Menores quase metacêntricos F 19 - 20 Menores metacêntricos G 21 - 22 Menores cromossomos acrocêntricos Sexuais X Y Similar ao Grupo C Similar ao Grupo G 2a ATIVIDADE – IDENTIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS – Bandeamento G 1 – A partir da imagem do cariótipo humano obtida a partir da técnica de bandeamento e com auxílio de um lápis realize a identificação e pareamento dos cromossomos. 2 – Caracterize cada par de cromossomos identificados na imagem. 3 – Responda a(s) questão(ões) proposta(s) na folha de respostas. 1 p 1 p p 2p 3 p 3 p 4 p 4 p 5 p 5 p 6 p 6 p 7 p 7 p 8 p 8 p 9 p 9 p 10 p 10 p 11 p 11p 12 p 12 p 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 p 19 p 20 p 20 p 21 21 22 22 X X Método Tipo Características Giemsa induzido por tripsina G Diferencia bandas claras e escuras Fluorocromos específicos A-T (quinacrina) Q Fluorescência clara nas bandas G escuras em regiões centromerica e Yq Bandas reversas R Opostas às bandas G Coloração centromérica C Região centromérica escura Bromodesoxiuridina (BrdU) SCE Diferencia trocas entre cromátides irmãs Distamicina A-DAPI DA/DAPI 15p, Yq, cent 1,9,16 Nitrato de prata NOR p de todos os acrocêntricos Giemsa 11 G11 Cent 11 G C RQ NOR
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