Aula 6 - acidos nucleicos

Prévia do material em texto

Transformações Bioquímicas
Ácidos nucléicos
Profa Ana Paula de Mattos Arêas Dau
Centro de Ciências Naturais e Humanas
e-mail: ana.areas@ufabc.edu.br
05/04/2010 e 12/04/2010
Ácidos nucléicos são polímeros
formados por açúcar, base
nitrogenada e fosfato
DNA e RNA diferem no açúcar
Ribose está presente no RNA
(ácido ribonucléico)
Desoxirribose está presente no
DNA (ácido desoxirribonucléico)
DNA e RNA são formados por ligações
fosfodiéster 3’ - 5’
A carga negativa das ligações fosfodiéster repele espécies
nucleofílicas, como íons OH-, tornando DNA e RNA mais
resistentes a hidrólise básica do que outros ésteres. A ausência de
OH no C2 do DNA o torna mais resistente a hidrólise que RNA.
Seqüência de 4
nucleotídeos
Bases constituintes do DNA e do RNA
Presente
somente
no RNA
Presente
somente
no DNA
Equilíbrio tautomérico (ceto-enólico)
Equilíbrio bastante deslocado para a forma ceto.
Nucleotídeos são as unidades
monoméricas de ácidos nucléicos
Nucleosídeos consistem na ribose ligada a uma das bases.
Nucleotídeos são nucleosídeos ligados a grupos fosfato,
principalmente presentes no C 5.
Orientação
padrão é β
Nucleosídeo 5’ fosfato ou 5’
nucleotídeo
Nucleotídeos Adenosina 5’-trifosfato (5’-ATP) e
Deoxiguanosina 3’-monofosfato (3’-dGMP)
Nomenclatura
• Os quatro nucleotídeos do DNA são
chamados de Desoxiadenilato,
Desoxiguanilato, desoxicitidilato e
timidilato.
• Timidilato não contém o prefixo
desoxi, porque dificilmente um
nucleotídeo baseado em timina será
encontrado em RNA.
Uma cadeia de DNA começa no
terminal 5’ livre e termina no 3’ livre
Uma cadeia ACG não é o mesmo composto que uma GCA,
porque por convenção, as cadeias devem ser escritas no
sentido 5’ - 3’.
As cadeias de DNA são longas
• Genoma de E. coli: 4,6 milhões de nucleotídeos ou
4,6 milhões de pares de bases (bp) = 4,6 Mbp
• Devido ao tamanho, o DNA genômico deve ser
altamente compactado.
Descoberta da estrutura do DNA
Figura de difração de
raios-X que mostra uma
formação de estrutura de
hélice.
Obtido por Maurice
Wilkins and Rosalind
Franklin.
Modelo de dupla hélice de James
Watson e Francis Crick, em 1953.
Deduções de Watson e Crick da
difração de raios-X
• Duas cadeias helicoidais polinucleotídicas são enoveladas em
torno de um eixo comum. As cadeias estão dispostas em
direções opostas. Ambas são right-handed.
• Os esqueletos de açúcar-fosfato estão do lado de fora e, desta
forma, as bases purínicas e pirimidínicas estão para dentro da
hélice.
• As bases estão praticamente perpendiculares ao eixo da hélice
e bases adjacentes estão separadas por 3,4 Å. A estrutura se
repete a cada 34 Å, sendo 10 bases por volta com 3,4 Å cada.
• Há uma rotação de 36 graus por base (360 graus por volta / 10
bases por volta).
• O diâmetro da hélice é de 20 Å.
Pareamento de bases
Como se chegou a esta conclusão?
Trabalhos de Erwin Chargaff (1950)
Espécie A:T G:C A:G
Ser humano 1.00 1.00 1.56
Salmão 1.02 1.02 1.43
Trigo 1.00 0.97 1.22
Levedura 1.03 1.02 1.67
Escherichia coli 1.09 0.99 1.05
Serratia marcescens 0.95 0.86 0.70
Somente pós a divulgação do modelo de Watson e Crick, foi
possível entender com clareza os resultados do trabalho de
Chargaff.
Visão axial da dupla hélice
Bases são empilhadas ao longo do eixo, estabilizando a
estrutura por forças de Van der Waals (efeito hidrofóbico).
As bases estão em azul (claro e escuro) e em amarelo.
Os açúcares e grupos fosfato se projetam para fora da
estrutura. Estão em rosa.
B-DNA e A-DNA
B-DNA é a forma
descrita por Watson
e Crick. Quando o
grau de hidratação
da molécula é
menor que 75%, a
forma A começa a
ser formada. Ela é
mais larga e mais
compacta que a B.
Ambas são right-
handed.
Z-DNA é uma
estrutura left-
handed, onde
os grupos
fosfato estão
em zigue-zague
Estrutura pode ser
formada por
oligonucleotídeos.
Grupos fosfato
estão circulados
em preto e
vermelho.
O DNA sofre replicação
semi-conservativa
O processo de replicação é
dirigido pela hidrólise de PPi
A dupla hélice pode ser
reversivelmente separada
A separação das fitas pode ser acompanhada por
espectrofotometria. Bases empilhadas absorvem menos luz.
Efeito chamado hipocromismo.
Tm: T onde metade da estrutura de hélice é perdida.
Algumas moléculas de DNA são
circulares e superenoveladas
Forma relaxada Forma super-enovelada
Estruturas de simples fita de DNA
e RNA, loops
Estrutura complexa de uma
molécula de RNA
Dogma da Biologia Molecular
Do gene à proteína
RNA mensageiro e
ribossomos
(ribonucleoproteínas)
Estrutura
secundária
e terciária
de um
ribossomo
Estrutura do RNA transportador
Moléculas de RNA (tRNA) podem
funcionar como catalisadores
A estrutura da cromatina é mantida
por interações com proteínas
(histonas)
A acetilação e desacetilação de histonas muda a interação
destas proteínas com o DNA, fazendo com que a atividade
transcricional seja ativada ou desativada.
DNA eucariótico é enrolado em volta de histonas
para formar Nucleossomos - primeiro nível de
condensação da cromatina
Os nucleossomos
se organizam em
uma hélice com 6
nucleossomos
por volta
O Nível de compactação do
DNA varia de 7 a 104 vezes,
sendo este último, na
metáfase, onde o DNA está
mais condensado. O DNA
(vermelho) se enrola em
octâmeros de histonas (azul).
Para que a transcrição ocorra, o
DNA deve ser desenovelado
Mutagênese e mecanismos de
reparo de DNA
Luz ultravioleta pode gerar dímeros
de pirimidinas.
Tradução
PCR (Polymerase
chain reaction -
reação em cadeia
da polimerase)
As polimerases utilizadas
fazem a amplificação no
sentido 5’ - 3’ e algumas
possuem atividade de
proofreading, que faz a
verificação do correto
pareamento no sentido 3’
- 5’.
Múltiplos ciclos de PCR
Eletroforese de DNA
Por causa dos grupos fosfato, o DNA
possui carga negativa e quando sujeito a
um campo elétrico, em eletroforese, ele
migra para o pólo positivo.
Seqüenciamento pelo método de
Sanger (método dideoxinucleotídeo)
Cromatograma com 4 canais de
Fluorescência
Cromatograma com os 4 canais
somados mostram a seqüência
completa amplificada
DNA na área forense
DNA foi isolado de manchas de sangue
da calça jeans e da camiseta de um
suspeito e amplificado por PCR. O DNA
foi comparado com o da vítima
utilizando eletroforese. DNA das
manchas bateram com o da vítima mas
não com o do suspeito. A freqüência de
um padrão de DNA coincidir com outro
sem ser da mesma fonte, é de
aproximadamente 1 em 33 bilhões.
Canais: DNA padrão λ, 1kb, e TS =
DNA controle das amostras; D = DNA
do suspeito; jeans = DNA isolado das
manchas na calça do suspeito;
camiseta = DNA isolado das manchas
da camiseta do suspeito (duas
diferentes quantidades analisadas); V =
amostra de DNA do sangue da vítima.
Tecnologia do DNA recombinante -
produção de proteínas. Construção
de vetor recombinante a partir de
mRNA
Como construir uma molécula
recombinante a partir de DNA