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Bacteriologia Clínica – aula 17-03 Continuação Em geral a cultura é considerada como método de referencia, sensibilidade e especificidade, como método bom é a cultura. Os métodos de biologia celular, especificamente o PCR podem ter uma sensiblidade maior daí deve ser substituído. O que se baseia uma cultura? PRIMEIRO local de coleta, as bac vai fazer com que elas cresçam para que depois vc possa identificar, as bac tem diante de seu crescimento tem algumas fases, a primeira fase lag, o numero de bac ao longo do tempo nesse período lag não vai haver aumento, a bac esta ativamente respondendo ao meio ambiente, fzdo transdução de sinal, transcrição e tradução. A partir daí que monta sua resposta, produz enzimas, transportadores começa a crescer de forma exponencial ela já esta usando os substratos daquele meio, então é um processo dinâmico, metabolizando e catabolizando, jogando fora o lixo metabólico com isso o meio vai sendo alterado, até que esses nutrientes sejam exauridos, e tenham produtos tóxicos, então vai chegar um momento que chega na fase estacionaria o numero permanece constante e vai chegar um momento que ocorre decréscimo pq não tem condições mínimas no meio. Para cultivar as bac em lab ela precisa de nutrientes, eles estão presentes nos meios de cultura, e chamamos de fonte de C, fonte de nitrogênio, em meios complexos outros elementos tem que estar presentes. Obvio Agar fundamental, tem que haver ph adequado, na maioria das bac o ph sempre esta em torno da normalidade, 7-7.2-7.4, temperatura na grande maioria cresce na faixa de 36°C, atmosfera é um ponto importante, pq alguns patogenos importantes tem: aeróbias obrigatórias: Mycobacterium tuberculosis anaeróbias obrigatórias: Clostridium tetani facultativas: Enterobacterias Dependendo de qual tipo de cultura, alem do meio, conseguir uma atm adequada, e lembrar que tem co2 e o nível é de ½ %, as capnofílicas precisam de co2 alto. Dependendo da qtde de água: liquido, semi solido, solido. Dependendo da composição podem ser simples basicamente fonte de C e N. Enriquecidos alem da base que conhecos um agente que não permita o crescimentos de outras bacs. Agentes seletivos que variam de antibióticos a corantes. Que meio eu vou usar? Vai depender de onde veio essa amostra (sangue, urina, escarro). Tbm depende do sitio anatômico da amostra se há uma microbiota normal, ou ele é estéril. E por fim quais são os principais patógenos associados a infecção nesse sitio anatômico. A partir do momento que já fez a cultura, cresceu um ou mais tipo de colônia, se o crescimento é discreto devolve pra estufa pra ter mais tempo de crescer, principalmente as coletas são feitas durante todo dia. Então se já tem um cresc razoável, ver qtos tipos de colônias cresceram – VER A MORFOLOGIA COLONIAL- só por morfologia não da pra dizer oq é. Primeira coisa escolher a COLONIA ISOLADA, e daí faz a coloração de gram. HÁ DUAS SITUAÇÕES QUE FAZEMOS O GRAM: quando recebe a amostra do pcte e o gram da cultura. A partir então do resultado do gram, vamos escolher que tipo de prova vamos usar. Se tem um bacilo gram negativo, é uma bac aeróbia ou anaeróbia, se cresceu na estufa: é aeróbio, ou anaeróbio facultativo, agora se só cresce na jarrinha, na presença de agentes que eliminem o oxigênio, então é um anaeróbio obrigatório. O grupo de provas é diferente. Se cresceu ao ar os testes envolvem fermentação de glicose, se cresce MC, em Agar sangue. Quais são os métodos alternativos? Agt tem meios que se baseiam em substratos cromogênicos, são meios que a cor dele é bege, e tem na composição um substrato cromogênico que identifica determinados patógenos. Ex.: CPS-ID3 para cultura de urina, se cresce uma E. coli fica vermelho, se formadas colônias grandes azuladas isso corresponde a uma Klebisiella. Se forem colônias pequenas tem que fazer o gram, que envolve a gram positivos pode ser enterococos. ISSO TUDO é baseada no uso de substratos degrados por enzimas presentes de forma especifica. O mais importante na microbiologia é a redução de tempo, pq numa infecção é crucial, e pra fazer antibiograma tem que saber qual é a bac, ou a qual grupo ela pertence. Atenção: tem situações que pode ter um e. coli que não produz o pigmento, daí tem que fazer todo o sistema de identificação, eles são ótimos, mas não são perfeitos. Outras alternativas, são os testes bioquímicos, com concentração ajustada eles vem liofilizados e reconstitui com a suspensão de bac, incuba e existem softwares. VANTAGENS: estabilidade (dura de 1 a 2 anos) espaço na geladeira, mais caros. Microbiologia automatizada: pega a amostra, plaqueia em meio de inoculação primaria, cultiva a bac, pega a colônia isolada faz a suspensão e dependendo do aparelho vão carregar as bandejas e coloca dentro do incubador que lê, pode ser fluorimetrico, ou colorimétrico. O aparelho lê e já da o resultado, qual é a bac, ou se não consegue identificar, e muitos problemas surgem quando não tem colônias isoladas. Sistemas baseados em crescimento. Teste sorológico: grupos particulares de bac, restrito a alguns grupos, reação antígeno anticorpo. Outras metodologias: cromatografia, espectro de massas do tipo maldi-tof. Cromatrografia: trab com a bac e identificar as estruturas presentes na membrana, pq existe bancos de dados. A partir dos ac graxos, ac micolico, o metabolismo que a bac lança no meio de cultura. A grande novidade da bac é espectro de massa maldi-tof: no momento ainda depende de cresc bacteriano, pode trabalhar a bac direto e coloca numa placa especifica do espectro junto com a matriz ou pode fazer uma extração previa dos elementos dessa bac (resultado melhor), lisa a celula bacteriana mistura com uma matriz coloca a mistura sobre a placa que vai ser inserida no aparelho, e esse aparelho gera um espectro. Ao invés de ter tubos bioquímicos com resposta ou capacidade de usar substratos,tem se va ter um pico com massas e intensidades, tem lá aquela mistura de bac e matriz dentro da plaquinha vai incidir um laser e as moléculas ionizadas vão então percorrer um campo e dependendo da massa vão atingir mais ou menos rápido o detector que vai gerar aquele espectro, e com base nesse espectro, cada um vai ser comparado e vai analisar oq é. Faz isso em questão de 10 minutos, os resultados são melhores com a extração então umas 2 horas. Dependendo do resultado, ele te da um score se esse score for superior que 2 vc vai ter gênero e espécie, se tiver 1,7-1,99 vc tem gênero, abaixo de 1,7 não tem resultado. Oq se acredita, é que essa metodologia, possa a ser usada diretamente da amostra, essa metodologia, tem potenciais na bq na hemato, então fiquem atentos . ANTIBIÓTICO Aqui a importante pq vamos fazer antibiograma, importante que recordamos os principais grupo de atb. Discutimos estrutura da célula bacteriana O QUE É UM ANTIBIOTICO? Síntese biológica. O QUE É UM ANTIMICROBIANO? Síntese em laboratório, exemplo à partir de sulfas. Todos são antimicrobianos, todos tem efeito inibitório. BACTERICIDA: se for retirado a bac não cresce mais. BACTERIOSTÁTICO: inibe crescimento, se for retirado a bac volta a crescer. Primeiro grupo de atb foram os β lactamicos, passaram a ser usados durante a 2ª guerra mundial, depois as sulfas, em 1970 muitos outros foram descobertas. O grupo mais novo são as quinolonas. Mecanismo de ação: Inibição da síntese da Parede Celular: -Penicilinas, Cefalosporinas, Monobactâmicos, Carbapenens (PBP) Vejam só: como atuam os atb, inibição da síntese da parede celular aqui pode sintetizar um grande grupo os beta lactamicos, que inclui toda essa família aqui. -Glicopeptídeos (precursores) Segundo são os glicopeptideos, a vancomicina, então por favor, NÃO é beta lactamico, embora o alvo seja síntese de parede celular. Inibição da síntese de proteínas: Outros inibem síntese de proteína: chuta síntese de ptna que a chance de acertar é grande. Aminoglicosideos, tetraciclinas, glicosamidas, todos eles inibem síntese de ptna, mecanismo especifico que diferencia um dooutro, mas saber que inibe síntese é suficiente. -Aminoglicosídeos, Spectinomicina, Tetraciclinas, Glicilciclinas (30S) -Macrolídeos, Cetolídeos, Lincosamidas, Streptograminas, Oxazolidinonas, Cloranfenicol (50S) Inibição da DNA girase/topoisomerase: quinolonas atuam sobre a DNA girase que essencial para a replicação de DNA, se ela é inibida não vai haver replicação. -Quinolonas Inibidores da via do folato: No caso das sulfas inibem a via do folato é essencial para a síntese de alguns precursores para a síntese de DNA, então acaba afetando síntese de ácidos nucléicos. -Sulfonamidas, Trimetoprim Inibição da RNA polimerase: vai haver inibição da síntese de DNA -Rifamicinas Ligação (inserção) à membrana: extremamente tóxico, se inserem na membrana citoplasmática, sua integridade é essencial para a permeabilidade bacteriana, pq? Transmissão de sinal, armazenamento de energia, e toda a resposta das condições ambientas, polimeximas atuam se inserindo e alterando a integridade na MB. -Daptomicina, polipeptídeos
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