Relatório - DETERMINAÇÃO DE TRICLOROCOMPOSTOS E SEPARAÇÃO DE P-AMINOFENOL EM URINA

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CENTRO UNIVERSITÁRIO – CATÓLICA DE SANTA CATARINA
CURSO DE BIOMEDICINA – DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA – 7ª FASE B
Ana Flávia Antunes De Macedo, Camila Nunes Da Silveira, Helena Caroline Brammer, Laís Quoos Chuquel, Victoria Cunha Farah
DETERMINAÇÃO DE TRICLOROCOMPOSTOS E SEPARAÇÃO DE P-AMINOFENOL EM URINA
Relatório de Aulas Práticas apresentado à disciplina de toxicologia da 7ª fase B, do Curso de Graduação em Biomedicina, do Centro Universitário - Católica de Santa Catarina.
Professor(a): Matheus Vinicius de Oliveira Brisola Maciel 
JOINVILLE
2017
INTRODUÇÃO
A determinação dos triclorocompostos totais objetiva monitorizar os indivíduos expostos no ambiente do trabalho aos solventes tricloroetileno e tricloroetano. O tricloroetano (TCE) e o ácido tricloroacético (TCA) são os principais metabolitos encontrados no sangue e na urina, sendo que a proporção entre as partes eliminadas varia de uma substancia para outra. O processo de eliminação dos hidrocarbonetos alifáticos clorados e relativamente lento, podendo ocorrer certo acumulo destes e de seus metabolitos em caso de exposição frequente. (NAKATA, 2017).
Em decorrência do uso industrial, tanto o tricloroetileno como o percloroetileno encontram-se amplamente distribuídos nos diferentes compartimentos do meio ambiente, e são detectados em água de chuva, águas superficiais e subterrâneas e alimentos, possíveis fontes de exposição para a população geral (PARDINI, 2017).
As principais vias de introdução na exposição ocupacional são a pulmonar e a dérmica. Após sua rápida absorção, esses toxicantes são distribuídos particularmente para o fígado, rim, sistema cardiovascular, Sistema Nervoso Central e tecido adiposo. Tricloroetano, tricloroetileno e percloroetileno apresentam o ácido tricloroacético (TCA) como produto de biotransformação comum, o qual pode ser utilizado como indicador biológico de dose interna na exposição a estes compostos (CHAGAS, 2017). Ambos apresentam ação depressora do sistema nervoso central. A legislação nacional estabelece a dosagem de triclorocompostos totais como indicador biológico da exposição aos solventes tricloroetileno e tricloetano. A dosagem de triclorocompostos totais é realizada em urina recente (IMURA et al., 1973).
A anilina é um dos solventes inseridos na legislação brasileira, sua exposição se deve à variedade de suas aplicações, como fabricação de espumas de poliuretano, produtos químicos, indústria de tintas, látex, herbicidas. É monitorada pela determinação de p-aminofenol na urina e pela presença de metahemoglobina. Sua absorção ocorre pelas vias respiratórias e cutânea. Age como fator do sistema nervoso, e sua exposição pode levar a lesões na córnea, cefaleia, sonolência e perda dos sentidos (OGA et al., 2014). 
OBJETIVOS
Determinar a presença de triclorocompostos em urina para monitoramento de exposição ocupacional
Verificar a presença do metabólito para aminofenol na urina para constatar exposição à solvente anilina
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS
Utilizou-se espectrofotômetro para leitura das absorbâncias, e os outros materiais para preparação das amostras a serem investigadas, como: balões volumétricos (50mL; 100mL; 250mL), pipeta volumétrica (10mL), pipetas automáticas (0,5μL; 1mL; 2mL; 5mL), béquer de 250mL, conta-gotas, chapa aquecedora, tubo de ensaio com tampa e soluções prontas: ácido tricloroacético, cromato de potássio, ácido sulfúrico, hidróxido de potássio, piridina, HCl concentrado; HCl (10%); alfa-naftol (1%) em NaOH (10%); dicromato de potássio (0,0167 M) e Reagente de Nessler PA.
MÉTODOS
Determinação dos triclorocompostos totais na urina (TCT-u)
Iniciou-se pipetando 1mL da amostra de urina para o tubo A1 (amostra 01) e 1mL do branco para o tubo B (branco); acrescentou-se 4mL de água destilada em cada um dos tubos e homogeneizou-se. Transferiu-se 0,5mL dos tubos de A1 e B para outros dois tubos de ensaio. Pipetou-se 1mL de cada uma das soluções padrão de uso para 4 outros tubos, identificados como P1 (solução padrão de concentração à 20 μg/mL), P2 (solução padrão de concentração à 40 μg/mL), P3 (solução padrão de concentração à 80 μg/mL) e P4 (solução padrão de concentração à 100 μg/mL), procedeu-se adicionando 0,5 mL da solução oxidante em todos os tubos. Colocou-os em banho maria por 15 minutos. Após o tempo estipulado adicionou-se 4 mL de piridina e agitou-os no vortex cada um por aproximadamente 1 minuto, levou-se os tubos para o banho maria de novo por mais 30 minutos. Logo, transferiu-se 3mL da camada piridinica para novos tubos de ensaio contendo 0,5mL de agua destilada, homogeneizando após a transferência. Após o procedimento efetuou-se a leitura de todos as amostras no espectrofotômetro, em 530nm, zerando com a amostra B. A leitura das absorbâncias foram anotadas e as amostras descartadas.
Teste de separação na urina para ρ-aminofenol
Teste de nitrito de sódio-alfanaftol
Adicionou-se 3 gotas de HCl 10% a cada 1mL de urina, em seguida, resfriou-se a solução em água corrente; realizou-se uma amostra em branco para controle, com água destilada, usando o mesmo tratamento, um ensaio em branco; adicionou-se 3 gotas de solução de nitrito de sódio 1% na amostra e no branco; logo, colocou-se 3 gotas de solução alfanaftol a 1% na amostra e no branco.
Teste pelo ácido clorídrico com dicromato de potássio
Aqueceu-se lentamente, por 3 minutos, 3 gotas da amostra junto com 2 mL de HCl concentrado; preparou-se um tubo para o controle, utilizando água destilada no lugar da amostra, com 2 mL de HCl concentrado; resfriou-se os dois tubos em água corrente; diluiu-se com 3 vezes o volume com água destilada; logo, adicionou-se 3 gotas de solução de dicromato de potássio 0,0167 M nos dois tubos.
Teste pelo reagente de Nessler
Adicionou-se 1 mL de amostra e 1 mL do reagente de Nessler em um tubo; preparou-se uma amostra branco nas mesmas condições utilizando água destilada no lugar da amostra; aqueceu-se os dois tubos por cerca de 3 minutos a 80°C.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DETERMINAÇÃO DOS TRICLOROCOMPOSTOS TOTAIS NA URINA (TCT-u)
Para o coeficiente de cada uma das substâncias preparou-se uma sequência de cinco diluições da concentração inicial para fazer uma curva de calibração. Ao preparar cada uma das baterias de diluições, leu-se as absorbâncias no espectrofotômetro e anotou-se, para posterior confecção do gráfico 01.
Tabela 01 – Determinação da absorbância das amostras em suas respectivas concentrações
	
	ABSORBÂNCIA (nm)
	CONCENTRAÇÃO (μg/mL)
	B
	A1
	P1
	P2
	P3
	P4
	0
	0
	0,035
	
	
	
	
	20
	
	
	0,099
	
	
	
	40
	
	
	
	0,201
	
	
	80
	
	
	
	
	0,418
	
	100
	
	
	
	
	
	0,504
	Em vista dos resultados referentes as respectivas concentrações, relata-se resultados satisfatórios, pois os números obtidos das absorbâncias aumentaram crescentemente de acordo com o aumento das concentrações. 
Gráfico 01 – Concentração em relação a absorbância de cada amostra
	Utilizou-se o programa Microsoft® Excel para montar o gráfico, no estilo dispersão de pontos, tendo como eixo X as concentrações em miligrama por litro e no eixo Y as absorbâncias em nanômetros registradas em cada concentração. A partir do gráfico, o próprio programa gerou uma linha de tendência sobre os pontos da reta, uma equação da reta e o R2. 
Fator de correção = 5
Fator de diluição = 1000
Valores de referência: 
Não definido pela NR-7, 2013, MT/Br.
IBMP (Índice Biológico Máximo Permitido)
IBMP: Exposição ao Tricloroetano
Triclorocompostos totais: 40,0 mg/g creatinina (NR-7, 2013, MT/Br).
IBMP: Exposição ao Tricloroetileno
Triclorocompostos totais: 300,0 mg/g creatinina (NR-7, 2013, MT/Br).
	Em vista dos resultados obtidos dos cálculos realizados, afirma-se uma concentração de creatinina acima do referencial definido pelo IBMP em relação a exposição ao tricloroetano, do qual a máxima seria 40 mg/g,no entanto, de acordo com o cálculo realizado, obteve-se um resultado de 88,36 mg/g de creatinina, acima do referencial. Todavia, as concentrações para tricloroetileno estão abaixo do referencial do IBMP, estando satisfatórias, não estando em risco de exposição indevida.
TESTE DE SEPARAÇÃO NA URINA PARA Ρ-AMINOFENOL
Amostra 01: Tubo A – Vermelho + Positivo. 
 Branco: Tubo B – Marrom.
Interpretação:
A cor vermelha se desenvolveu, indicando a presença de ρ-aminofenol na amostra 01. Sabe-se que o ρ-aminofenol é um metabólito da fenacetina/paracetamol. No entanto, este teste pode ser positivo quando uma amina aromática primária estiver presente ou quando o alfa-naftol alcalina em quantidades excessiva, dando falsos resultados.
Amostra 02: negativo. 
 Branco: presença de cor amarelada.
Interpretação:
A coloração indicaria a presença de paracetamol, no entanto, não se observou tal coloração, indicando ser negativo a amostra 02.
Amostra 03: positivo, cor verde, indicação de presença de paracetamol.
 Branco: positivo.
Interpretação: 
Observou-se na amostra 03 uma coloração esverdeada, indicando a presença de paracetamol. No entanto, normalmente, para o aminofenol, não é encontrado na urina de indivíduos não expostos.
Referência:
IBMP/NR7: 50,0 mg/g de creatinina
CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos nos cálculos, as concentrações de tricloroetileno estão dentro do referencial de acordo com o IMBP, não ocorrendo exposição indevida, pois se estivessem acima do padrão poderiam causar ao indivíduo depressão do Sistema Nervoso Central, assim como dermatite. Na segunda prática, observou-se que apenas a amostra 03 indicou resultado positivo, indicando a presença de paracetamol, porém como o material analisado foi a urina, a presença de aminofenol pode não ser encontrada.
REFERÊNCIAS
CHAGAS, C. Exames: Triclorocompostos Totais. LabClin – Laboratório de análises clinicas, 2017. Disponível em: <http://www.labclinbh.com.br/exames.php>. Acesso em: 25 mai. 2017
IMAMURA, T.; IKEDA, M. Int. Arch. Abbeitsmed, v.31, p.333-338, 1973.
NAKATA, R. Triclorocompostos, totais, urina. Laboratório de análises clinicas, 2017. Disponível em: <http://labnakata.com.br/exm_exibir.php?id=308>. Acesso em: 25 mai. 2017
OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Fundamentos de Toxicologia. 4° ed. São Paulo: Atheneu Editora, 2014.
PARDINI, H. Help de Exames - Triclorocompostos Totais [TRICLO]. Laboratórios Hermes Pardini, 2017. Disponível em: <http://www.labhpardini.com.br/scripts/mgwms32?MGWLPN-HPHOSTBS&App=HELPE&EXAME=U%7C%7CTRICLO>. Acesso em: 25 mai. 2017
ANEXOS
QUESTÕES – PRÁTICA 04
Quais são os principais efeitos deletérios ao organismo dos indivíduos expostos aos solventes tricloroetileno e tricloroetano?
Os três hidrocarbonetos alifáticos clorados contemplados pela NR-7 atual (tetracloroetileno, tricloroetano, tricloroetileno) são absorvidos tanto por via respiratória quanto pela pele integra. O tricloroetano (TCE) e o ácido tricloroacético (TCA) são os principais metabólitos encontrados no sangue e na urina, sendo que a proporção entre as partes eliminadas varia de uma substância para outra. O processo de eliminação dos hidrocarbonetos alifáticos clorados é relativamente lento, podendo ocorrer certo acúmulo destes e de seus metabólitos em caso de exposição frequente. Os efeitos locais devido à exposição ao agente químico são: dermatites, severa irritação nos olhos e trato respiratório superior. Os efeitos sistêmicos são depressão do SNC, problemas hepáticos, fibrilação ventricular, arritmias cardíacas, problemas renais e morte anestésica. A exposição excessiva pode acarretar narcose, cefaléia, sonolência, vômitos, náuseas e diarréia. O tricloroetano está presente principalmente nas atividades de lavagem a seco, removedor de manchas, propelentes, limpeza de máquinas. O tricloroetileno em operações de fosfatização, solventes, desengraxantes e lavagem a seco.
A exposição a estes compostos ocorre em quais atividades ocupacionais e por quais vias de exposição? Cite e diferencie as vias de exposição envolvidas.
Os efeitos tóxicos do tricloroetileno estão fortemente relacionados com a formação de metabólitos, para isso o estudo da farmacocinética destes torna-se muito útil qualitativamente para associar as espécies químicas com o efeito observado. O tricloroetileno é um solvente lipossolúvel facilmente absorvido por pulmões, trato gastrointestinal e pele e distribuído no tecido adiposo, músculos, cérebro, rins, fígado e o próprio pulmão. A sua biotransformação pode acontecer por duas vias distintas: via citocromo P450 e via de conjugação com GSH, sendo que parte pode ser eliminado na respiração sem sofrer metabolização. 
O tricloroetileno é utilizado como solvente e desengraxante na limpeza de peças metálicas, na produção de borrachas, na extração de óleo e de gorduras de produtos vegetais, no líquido de limpeza de lentes de contato, em produtos para lavagem a seco (roupas, automóveis, etc.), em produtos de limpeza, como removedores e fluidos para carpetes, e nas indústrias química e têxtil; já o tricloroetano (metilclorofórmio) é usado como desengraxante na limpeza de peças metálicas e como solvente de tintas e colas, além de entrar na composição de aerossóis e de produtos para lavagem a seco.
A porção de tricloroetileno retida no organismo por meio de inalação, aproximadamente 55%, tem um metabolismo lento, sendo excretada em 3 semanas. O ácido tricloroacético, um de seus principais metabólitos, possui uma meia-vida de cerca de 4 dias. Em torno de 15% do solvente é exalado inalterado. O tricloroetano apresenta meia-vida de aproximadamente oito horas e meia e exalação inalterada em grande proporção (70%). Ao ser metabolizado, esse composto se transforma em tricloroetanol e, posteriormente, em ácido tricloroacético.
Na primeira via, todas as etapas do metabolismo acontecem principalmente no fígado e os ácidos formados causam promoção do crescimento de células mutadas, portanto apresenta um efeito carcinogênico. A segunda via é mais lenta, exigindo uma maior concentração do solvente para acontecer, e os metabólitos s-(1,2-diclorovinil)-glutationa e s-(1,2-diclorovinil)-L-cisteína gerados apresentam nefrotoxicidade. Nos pulmões, cloral/hidrato de cloral são estáveis, causando toxicidade. Os efeitos agudos sobre o sistema nervoso central são caracterizados por duas fases sequenciais - excitação e depressão e são geralmente reversíveis. Os efeitos neurológicos da exposição ao tricloroetileno dependem do tempo e concentração do mesmo durante a exposição. De uma maneira geral são semelhantes aos efeitos do álcool. 
Comente sobre o resultado encontrado na amostra analisada
De acordo com os resultados obtidos da prática, pode-se afirmar serem satisfatórios pois o valor referencial de tricloroetileno pelo IBMP (Índice Biológico Máximo Permitido) seria 300mg/g, e o resultado obtido foi de 88,36mg/g, indicando, no entanto, fora de risco para a saúde, não ocorrendo exposição indevida. Em relação ao tricloroetano, o valor referencial pelo IBMP seria de 40mg/g, sendo, no entanto, acima do máximo permitido, apresentando exposição aos efeitos tóxicos de tal composto.
QUESTÕES – PRÁTICA 05
O p-aminofenol é o metabólito formado da exposição à anilina. Qual outro marcador poderia ser utilizado para monitorar a exposição a este tipo de solvente?
Outro marcador que poderia ser utilizado é a metahemoglobina. A metahemoglobina é formada pela oxidação do ferro da hemoglobina do estado ferroso (Fe2+) para férrico (Fe3+). É incapaz de transportar o oxigênio, levando à cianose. A meta-hemoglobina constitui um indicador de exposição à anilina, embora não seja específica, pois também é indicador de exposição a outros aminos ou nitro compostos ou do uso de certos fármacos. A anilina produz ação local no tecido cutâneo e mucosas e, após absorvida, depressão no Sistema Nervoso Central. O primeiro sintoma, comumente, é a cefaléia,que tende a se tornar mais intensa, na medida em que se agrava a metahemoglobinemia. O seu metabólito, a fenilhidroxilamina é o responsável, em grande parte, por suas ações metahemoglobinizantes.
Em relação ao marcador respondido na questão anterior. Na sua opinião qual dos dois marcadores é mais adequado para exposição à anilina? Justifique a sua resposta. 
P-aminofenol é mais indicado pois, a metahemoglobina é também um indicador de exposição de outros aminos ou nitro compostos e de certos fármacos. Como a metahemoglobina aparece no sangue mais tardiamente que o p-aminofenol na urina e a determinação de baixas concentrações de metahemoglobina apresenta algumas dificuldades.