Relatório - PESQUISA DE DROGAS DE ABUSO POR MEIO DE TESTE RÁPIDO E DETERMINAÇÃO DO 11-NOR-9-CARBOXI-THC EM URINA POR CCD

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CENTRO UNIVERSITÁRIO – CATÓLICA DE SANTA CATARINA
CURSO DE BIOMEDICINA – DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA – 7ª FASE B
Ana Flávia Antunes De Macedo, Camila Nunes Da Silveira, Helena Caroline Brammer, Laís Quoos Chuquel, Victoria Cunha Farah
PESQUISA DE DROGAS DE ABUSO POR MEIO DE TESTE RÁPIDO E DETERMINAÇÃO DO 11-NOR-9-CARBOXI-THC EM URINA POR CCD
Relatório de Aulas Práticas apresentado à disciplina de toxicologia da 7ª fase B, do Curso de Graduação em Biomedicina, do Centro Universitário - Católica de Santa Catarina.
Professor(a): Matheus Vinicius de Oliveira Brisola Maciel 
JOINVILLE
2017
INTRODUÇÃO
O exame toxicológico de urina é rápido e indolor. Ele é realizado para detectar a presença de algumas drogas ilegais e medicamentos prescritos na urina. O exame toxicológico de urina geralmente analisa a presença de álcool, anfetaminas, benzodiazepínicos, maconha, cocaína e opióides (narcóticos) e pode também identificar possíveis problemas de abuso de drogas. Uma vez que esses problemas sejam identificados, os médicos poderão ajudar a iniciar um plano de tratamento. A realização de exames toxicológicos de urina durante todo o tratamento pode ajudar a verificar se o plano está funcionando e se o paciente não está mais fazendo uso de drogas (HEALTHLINE, 2017).
Existem dois tipos de exame toxicológico de urina. O primeiro, chamado de imunoensaio, tem boa relação custo benefício e fornece o resultado rapidamente. No entanto, tem algumas desvantagens. Por exemplo, não avalia todos os opióides (narcóticos). Em alguns casos, também fornece resultados falsos positivos. Um falso positivo ocorre quando o resultado do exame é positivo para o uso de drogas, mas não houve uso da droga (HEALTHLINE, 2017).
Se o primeiro exame for positivo, mas a pessoa negar o uso de drogas, um segundo tipo de exame será realizado: uma cromatografia gasosa ou uma espectroscopia de massa. O procedimento para obtenção da amostra não é diferente do procedimento para o imunoensaio descrito acima. Esses exames são mais caros e demoram mais para fornecer os resultados, mas raramente produzem um falso positivo. Outros pontos fracos comuns aos dois tipos de exame incluem: falsos negativos (o resultado do exame é negativo mesmo que o uso da droga tenha ocorrido); vulnerabilidade para burlar o sistema; e falha para capturar a utilização de droga no mesmo dia da coleta (HEALTHLINE, 2017).
Os imunoensaios, o tipo mais comum de exame toxicológico de urina, não dosam diretamente as drogas. Ao contrário, avaliam a maneira como o uso de drogas interfere na capacidade de o organismo formar complexos antígeno-anticorpos (HEALTHLINE, 2017).
Os resultados desse exame são expressos em ng/mL (nanogramas por mililitro) e é baseado em um ponto de corte, de maneira que qualquer valor abaixo do corte é registrado como negativo e qualquer valor acima do ponto corte é interpretado como positivo. A pessoa que administrar o exame toxicológico geralmente fornecerá os resultados como positivo ou negativo e não em valores numéricos. Muitos exames de imunoensaio nem mesmo mostram os valores em ng/mL. Os resultados são mostrados em uma fita de teste que fica de cores diferentes para indicar a presença ou ausência de várias substâncias. Se os resultados forem positivos para o uso de drogas ilegais que não tiverem sido usadas, a pessoa deverá solicitar imediatamente uma cromatografia gasosa (HEALTHLINE, 2017).
OBJETIVOS
Identificação de drogas de abuso em urina por meio de teste rápido de imunocromatografia;
Conhecer uma das técnicas de análise preliminar para pesquisa de drogas de abuso;
Identificar o metabólito 11-nor-9-carboxi-THC em urina por CCD.
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS
Utilizou-se para preparação das amostras a serem investigadas, materiais como: recipiente de plástico para coleta de amostra de urina, luvas descartáveis, termômetro, kit para teste rápido, cromatoplacas de CCD (sílica gel 60 F254 – 10x10cm), solução-estoque de referência contendo 100μg de THCCOOH em 1mL de metanol, solução de KOH (11,8N), solução aquosa de Fast Blue BB (0,1%), reagentes e solventes grau P.A (hexano, heptano, metanol, clorofórmio, butanol, dietilamina, ácido acético glacial). 
MÉTODOS
Pesquisa de drogas de abuso por meio de teste rápido
Em temperatura ambiente manuseou-se as amostras de urina e os componentes do kit, iniciou-se removendo um dispositivo do teste do envelope laminado e identificou-se a respectiva amostra de urina. Retirou-se a tampa protetora das tiras e mergulhou sua extremidade do dispositivo na amostra por 10 segundos. Após, removeu-se o dispositivo da amostra de urina e a colocou-o sobre uma superfície plana. Finalizou-se o teste lendo o resultado após 5 minutos da adição da amostra.
Determinação do 11-nor-9-carboxi-thc em urina por CCD
Para o preparo da amostra, colocou-se 5 mL de urina em um tubo de ensaio, após adicionou-se 0,5 mL de solução de KOH 11,8N. Reservou-se em temperatura ambiente por 5 minutos. Para a extração, acidificou-se a amostra adicionando ácido acético glacial aos poucos até o pH alcançar um valor de 4 e 5. Após, acrescentou-se 5mL de hexano e agitou-se suavemente, por inversão, durante 7 minutos. Centrifugou-se a 3400 rpm por 5 minutos e transferiu-se a camada orgânica para um tubo afunilado de 10mL. 
Para a obtenção do resíduo para análise, em banho-maria à temperatura de 60 °C, deixou-se evaporar o solvente orgânico. Analisou-se o resíduo seco imediatamente após a evaporação do solvente, ressuspendeu-o com 50μL da mistura clorofórmio:metanol (3:1) e aplicou-o na cromatoplaca com auxílio de um capilar. Logo aplicou-se a solução-estoque de referência contendo 100μg de THCCOOH. 
5mL de urina
+ 0,5mL KOH 11,8N
Reservar - 5min
+ 1,4 mL CH₃COOH
+ 5mL hexano
Agitar por inversão - 7min
Centrifugar a 3400 rpm – 5min
B.M. à 60 °C – 15min
Solvente orgânico
Aquoso
Evaporar
Resíduo seco
Descartar
+ 50μL CHCl₃:MeOH 3:1
CCD
Desenvolveu-se a cromatoplaca no sistema heptano:butanol:ácido acético glacial (90:9:1). Marcou-se o ponto final antes de medir a distância percorrida pela fase móvel, anotou-se o valor da distância a partir do ponto de aplicação. Após o desenvolvimento, deixou-se a cromatoplaca secar na capela, à temperatura ambiente e eluir em tolueno:hexano. Após, nebulizou-se a placa com dietilamina e deixou-se secar na capela, à temperatura ambiente. Finalizou-se com a nebulização do revelador com a solução de Fast Blue BB 0,1% recém-preparada. O THCCOOH aparece como banda cor de rosa a ± 3cm do ponto de aplicação.
A acidificação da amostra foi feita com ácido acético glacial, pois somente um pequeno volume (1,4mL) bastava para produzir o pH desejado (pH 4). Para a extração liquida de canabinóides usou-se hexano, pois produz extratos com menos interferentes, sem necessidade de purificação posterior, o que permite sua aplicação direta em cromatografia em fase gasosa. Apesar do volume utilizado tenha sido maior que o recomendado em tal método, o volume do solvente do extrator não foi alterado. A emulsão formada na fase de agitação mecânica é facilmente quebrada na etapa de centrifugação à 3400 rpm por 5 min. A parte superior que contém o hexano é retirada com auxílio de pipeta de Pasteur. Após evaporação do solvente em banho maria e sua ressuspensão, as placas foram deixadas para evaporação do solvente. A reação colorimétrica mais especifica para identificação de canabinóides por CCD envolve a reação dester com o corante Fast Blue BB. A basicidade do cromógeno é importante para o desenvolvimento da cor, a dietilamida possui vantagens a outros álcalis, sendo aplicada antes e depois do Fast Blue BB. Depois de secos, os cromatogramas são nebulizados com dietilamida, em seguida aplica-se a solução de Fast Blue BB.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
PESQUISA DE DROGAS DE ABUSO POR MEIO DE TESTE RÁPIDO
Para validação do resultado do teste é necessário o aparecimentode faixa de cor lilás em todas as áreas do controle (C). Se não ocorrer o aparecimento da faixa de cor lilás em qualquer área do controle (C), descartar o dispositivo e re-testar a amostra com um novo dispositivo.
Positivo: Ausência de uma faixa de cor lilás em qualquer das seis tiras (AMP, BZD, COC, MET, MOR, THC) indica um resultado positivo para a droga correspondente.
Negativo: A presença de uma faixa de cor lilás, de qualquer intensidade, em qualquer tira indica que o nível da droga correspondente ou seu metabólito está abaixo do limite da sensibilidade. 
Inválido: Se a linha na área Controle (C) não aparecer num intervalo de 5 minutos, repetir o ensaio com um novo dispositivo.
DETERMINAÇÃO DO 11-NOR-9-CARBOXI-THC EM URINA POR CCD
Os resultados obtidos com a análise de adicionados de 100μg de THCCOOH permitiram uma avaliação visual, ainda que subjetiva, do método. Na cromatografia em camada delgada, obtivemos valores diferentes, para a distância percorrida pelo solvente estimou-se um valor de 8,4cm e a distância percorrida pelo padrão alcançou um valor de 4,1cm. No entanto, a distância percorrida pela amostra foi ausente.
CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS
OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Fundamentos de Toxicologia. 4° ed. São Paulo: Atheneu Editora, 2014.
SPINELLI, E. Cannabis sativa: Determinação do 11-nor-9-carboxi-tetraidrocanabinol em urina por cromatografia em camada delgada de alta eficiência. In: MOREAU, R. L. M.; SIQUEIRA, M. E. P. B. Toxicologia Analítica. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan LTDA, 2014. p.228-231
SPINELLI, E. Identificação de usuários de Cannabis por cromatografia em camada delgada de alta eficiência. Universidade de São Paulo – Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Curso de pós-graduação em farmácia – Área de análises toxicológicas. São Paulo, 1994. 111p.
HEALTHLINE. Exame toxicológico de urina, 2017. Disponível em: <http://pt.healthline.com/health/exame-toxicologico-de-urina#Overview1>. Acesso em: 14 jun. 2017
ANEXOS
QUESTÕES – PRÁTICA 07
Explique, qual a importância da realização do teste preliminar?
Sendo o teste rápido um ensaio preliminar. Descreva qual é o procedimento seguido para confirmação e quantificação das substâncias encontradas?
QUESTÕES – PRÁTICA 08
Esta análise em uma rotina laboratorial se enquadra em qual etapa do processo analítico?
Explique, qual seria a sequência em caso de confirmação da presença da substância identificada?
Além da CCD qual outra técnica você recomendaria para esta análise qualitativa? Justifique.