Relatório - Carboidratos

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IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS NA URINA
 Jaqueline da Silveira; Laís Quoos Chuquel, Victoria Farah 
Centro Universitário Católica de Santa Catarina – Campus Joinville 
Biomedicina – Turma B – Bioquímica Animal
 
1 OBJETIVO 
Caracterização e identificação de diferentes carboidratos que devido sua estrutura sofrem modificações participando de várias reações em nosso organismo e liberam grupos por hidrólise, além da detecção dos mesmo e corpos cetônicos em amostra de urina desconhecida. 
2 INTRODUÇÃO 
Carboidratos são as moléculas mais abundantes a natureza e tem uma grande importância. Uma vez que exercem inúmeras funções vitais para as células e para os organismos como um todo. Os carboidratos são polihidroxi-aldeídos e cetonas, ou substancias que os produzem por hidrolise em sua maioria, são solúveis em agua, sendo os monossacarídeos mais solúveis que os polissacarídeos, com exceção do glicogênio, que é solúvel em agua. 
Alguns testes preliminares podem ser utilizados para o reconhecimento qualitativo de carboidratos em amostras, sendo que estes testes baseiam nas propriedades químicas e comportamento dos carboidratos frente a reagentes diversos. Os testes são os seguintes: Teste de Molisch, identifica carboidratos em geral; Teste de Bial, identifica pentoses (aldopentoses ou cetopentoses) em forma livre ou combinada; Teste de Seliwanoff, utilizado para identificar cetoses através da coloração avermelhada recorrente da condensação furfural com resorcinol; Teste de Benedict, identifica açucares redutores; Teste de Barfoed, identifica monossacarídeos; Teste de iodo, serve para identificar os amidos.
Em condições fisiológicas normais, os açúcares presentes no filtrado glomerular, são reabsorvidos nos túbulos renais, determinando uma ausência quase total de carboidratos na urina. Entretanto, uma série de condições patológicas pode levar ao aparecimento de açúcares na urina excretada.
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
3.1 MATERIAIS
1 frasco com 110 mL de solução 1% de cada um destes carboidratos: glicose, frutose, arabinose, sacarose, lactose;
1 frasco com 110 mL de solução 1% de acetona;
1 frasco com 110 mL de urina A;
1 frasco com 110 mL de urina B;
1 frasco com 10 mL de reativo de Molish;
1 frasco com 50 mL de reativo de Benedict; 
1 frasco com 25 mL de reativo de Barfoed; 
1 frasco com 10 mL de reativo de Bial; 
1 frasco com 45 mL de reativo de Seliwanoff; 
1 frasco com 25 mL de reativo de Imbert; 
25 mL de H2SO4 concentrado; 
5 mL de HCl 3,0 M; 
15 mL de solução de NH4OH 10%; 
1 béquer com 50 mL de água destilada; 
Estante com 49 tubos de ensaio de 20 mL; 
10 conta-gotas; 
1 pipeta graduada de 1 mL; 
2 pipetas graduadas de 2 mL;
13 pipetas graduadas de 5 mL; 
Pipetador automático; 
1 tripé com tela de amianto e bico de Bunsen (ou placa de aquecimento); 
1 béquer de 500 mL com água da torneira (para banho-maria); 
Pinça (ou luva térmica) para retirar tubos aquecidos em banho-maria; 
Papel toalha.
3.2 MÉTODOS
	REAÇÕES EM MEIOS ÁCIDOS
Teste de Seliwanoff tem como objetivo distinguir cetoses de aldoses. A reação baseia-se na formação de furfural e hidroximetilfurfural por ação do HCl concentrado e calor sobre as cetoses e aldoses com a conseqüente formação de um complexo de cor vermelha pela reação entre o resorcinol e estes derivados furfúricos. O controle do tempo é fundamental, pois o aparecimento da coloração vermelha é mais rápido para as cetoses que para as aldoses. Neste caso, a frutose aquecida na presença HCl diluído, perde três moléculas de água formando um complexo de cor vermelha.
Teste de Bial tem como objetivo verificar se há pentose na urina. Baseia-se na formação de furfural pela desidratação de pentoses pelo HCl em presença de calor. A condensação do orcinol com o furfural na presença de íons férrico (tricloreto férrico) forma complexo de coloração verde e azul intensa.
REAÇÕES DE REDUÇÃO
Teste de Benedict baseia-se na reação do íon cúprico que é reduzido a óxido cuproso por açúcares redutores que são oxidados, formando precipitado, cuja coloração varia do esverdeado, passando pelo amarelo, até o vermelho tijolo. Diversos reativos são usados para demonstrar a presença de grupo redutor em açúcares. Todos os monossacarídeos e alguns dissacarídeos se comportam como açúcares redutores. 
Os carboidratos formam compostos pela união de duas ou mais moléculas de monossacarídeos, sendo classificados como DISSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS e POLISSACARÍDEOS. Nesses compostos, quando o carbono C1 apresenta a hidroxila livre o carboidrato apresenta poder redutor quando aquecido. Esta característica é utilizada em reações de identificação. Com alguns dissacarídeos, como a sacarose e a treatose, isso não ocorre, pois não apresentam grupo redutor livre.
Os açúcares redutores em solução fortemente alcalina e em presença de íons metálicos como o Cu, Bi, Fe e Ag se oxidam e os íons metálicos se reduzem produzindo um precipitado de cor variada. Apesar de qualquer agente redutor dar reação positiva, geralmente são os carboidratos os principais agentes redutores encontrados na urina. O carboidrato redutor mais comum é a glicose, porém outros açúcares, como frutose, galactose, lactose, também dão resultados positivos.
DETERMINAÇÃO DE CORPOS CETÔNICOS
Quando o uso de carboidrato como principal fonte de energia fica comprometido e os estoques de gorduras são então metabolizados para fornecer energia, pode-se detectar corpos cetônicos na urina. O acetato e acetona presentes na urina reagem com o nitroprussiato de sódio em meio alcalino produzindo um composto de cor roxa púrpura. Usa-se o reativo de Rothera para identificar corpos cetônicos na urina.
Teste de Molish
REAÇÃO DE MOLISCH – Detecção de glicídios em geral.
Adicionar 10 gotas de cada solução de urina nos respectivos tubos de ensaio;
Adicionar 2 mL de água destilada a cada tubo;
Adicionar duas gotas do reativo de Molish em cada um dos tubos. Agitar;
Inclinar cada tubo de ensaio e adicionar cuidadosamente, 3 mL de ácido sulfúrico concentrado, formando uma fase abaixo da solução de açúcar. 
Teste de Benedict
Adicionar 2 mL de cada solução de urina no respectivo tubo de ensaio;
Adicionar 5 mL do reagente de Benedict a cada tubo. Agitar;
Colocar todos os tubos em banho-maria a 100 ºC por 5 min;
Deixar esfriar e observar os resultados;
Anotar qualquer mudança de cor na solução, turbidez ou cor do precipitado para cada tubo de ensaio.
Hidrólise ácida da sacarose
Adicionar 3 mL de solução de sacarose a um tubo de ensaio; 
Adicionar 3 gotas de solução de HCl 3,0 M ao tubo;
Aquecer em banho-maria a 100 ºC por 5 min;
Adicionar 5 mL do reagente de Benedict à solução acidificada;
Colocar o tubo em banho-maria por mais 5 minutos. 
Teste de Barfoed
Adicionar 3 mL de cada solução de urina no respectivo tubo de ensaio;
Adicionar 3 mL do reagente de Barfoed a cada tubo. Agitar;
Colocar todos os tubos em banho-maria a 100 ºC por cerca de 3 min;
Durante este tempo, anotar qualquer mudança de cor na solução, turbidez ou cor do precipitado para cada tubo de ensaio.
Teste de Bial
Adicionar 2 mL de cada solução de urina no respectivo tubo de ensaio;
Adicionar 1 mL do reagente de Bial a cada tubo. Agitar;
Colocar os tubos em banho-maria a 100 ºC por 5 min.
Teste de Seliwanoff
Adicionar 3 gotas de cada solução de urina no respectivo tubo de ensaio;
Adicionar 5 mL do reagente de Seliwanoff a cada tubo (na capela). Agitar;
Colocar os tubos em banho-maria a 100 ºC por 1 minuto. 
Teste de Imbert
Adicionar 4 mL de cada solução de urina no respectivo tubo de ensaio;
Adicionar 6 gotas do reagente de Imbert a cada tubo. Agitar levemente;
Inclinar cada tubo de ensaio e adicionar, lentamente e cuidadosamente, 1,5 mL de solução NH4OH 10%, formando uma fase abaixo da solução de açúcar. 
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES	
Primeiramente para a realização de todos os testes, necessitamos de sete tubos de ensaios e os mesmos já estavam organizadosna respectiva ordem: Glicose, frutose, arabionse, sacarose, lactose, acetona, urina A e B. 
Para o Teste de Molish, pegamos os sete tubos de ensaio com a ordem acima descrita e aos mesmo, já haviam sido adicionados as 10 gotas de urina desconhecida. Seguidamente, adicionamos 2 ml de água desligada à cada tubo de ensaio, e duas gotas do reativo pronto de Molish. Os tubos foram agitados e inclinados, lentamente foram colocadas 3 mL de ácido sulfúrico. O que pode se observar que após adição do ácido, formou-se uma fase abaixo da solução de açúcar.
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Molish
	Formação de anel púrpura +
	Formação de anel púrpura +
	Formação de anel púrpura +
	Formação de anel púrpura +
	Não há formação de anel -
	Não há formação de anel -
	Formação de anel púrpura +
Compreende-se que este teste emprega a detecção geral de glicídios com soluções de ácidos fortes onde um polissacarídeo sofre hidrólise gerando desidratação dos açucares formando aldeídos com característica incolor que dão origem ao anel púrpura. A formação deste anel indica a presença de carboidrato na urina desconhecida. 
A ação desidratante energética do ácido sulfúrico concentrado provoca a formação do furfural e derivados. Estes compostos podem condensar com fenóis ou aminas cíclicas produzindo substancias coradas. Soluções concentradas de compostos carbonados podem formar por simples ação do ácido sulfúrico concentrado, um produto avermelhado (carbonização parcial), o que não deve ser confundido com o teste positivo. 
A realização do Teste de Benedict, nos sete tubos, 2 mL de solução de urina desconhecida já estavam adicionados. A equipe utilizou o reagente de Benedict adicionando 5 mL em cada tudo de ensaio e os mesmos foram colocados em banho-maria a 100ºC por 5 min dentro da capela. Após retirados os tubos da capela, podemos observar suas características.
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Benedict
	Vermelho tijolo
	Vermelho tijolo
	Azul
	Azul
	Azul
	Verde
	Verde
Este teste é semi-quantitativo e identifica açúcares redutores. Entende-se que algumas moléculas de carboidratos possuem em suas estruturas OH- livres o que resulta em uma ótima redução, ou seja, são bons redutores. 
Esta reação é feita em meio básico e os íons metálicos nestas soluções baseiam-se na redução de Cu²+ a Cu+. Esta redução resulta na cor vermelho-tijolo e mostra a presença de um açúcar redutor em amostra de urina desconhecida indicando que a frutose, lactose e glicose são bons redutores devido sua estrutura. A cor azul, em sacarose e acetona, mostra negatividade da presença das mesmas na amostra, enquanto a urina A e B de cor característica verde mostram a confirmação de açúcares redutores presentes. 
Para o método de Hidrólise ácida da sacarose, utilizamos um tubo apenas onde 3mL de solução de sacarose foram adicionadas além de mais 3 gotas de solução de HCl 3,0 M. Seguidamente levamos o tubo para o banho-maria a 100ºC durante 5 minutos. Depois ao tubo, adicionamos 5 mL do reagente de Benedict à solução acidificada, como o reagente é básico, neutralizamos a solução preparada dentro do tubo. Deixamos em temperatura ambiente para observar os resultados. 
A molécula de sacarose é um dissacarídeo, estes sofrem hidrólise separando-se nos seus monossacarídeos fundamentais que no caso da sacarose em prática é composta por frutose + glicose. A cor foi modificada para vermelho-tijolo indicando teoricamente a presença de glicídios redutores na amostra. Porém a sacarose em sua estrutura não possui glicídios redutores, ou seja, a cor neste caso indica que houve a hidrólise da mesma separando-a em glicose e frutose. 
O Teste de Barfoed, foi realizado novamente com sete tubos de ensaio, aos mesmos foram adicionados 3 mL de urina + 3 mL do reagente de Barfoed. Os tubos foram agitados e colocados em banho-maria por cerca de 3 minutos. Durante o tempo que estava dentro da capela, podemos observar a mudança de cor dos tubos. Houve formação de precipitado.
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Barfoed
	Azul
	Azul
	Azul
	Azul
	Azul
	Verde com ppt
	Verde com ppt
O princípio da reação de Barfoed é semelhante ao de Benedict. Entende-se que este teste serve para distinguir os monossacarídeos redutores de dissacarídeos. Os dissacarídeos teoricamente são redutores mais fracos fazendo com que a reação seja lenta em relação aos monossacarídeos. O que acontece, é que o Cu2+ sofre redução a Cu+ em meio ácido. Esta redução é caracterizada pela formação de precipitado vermelho-tijolo na amostra de frutose, devido a estrutura da mesma ser monossacarídeo. 
Nas amostras de urina, observou-se formação de precipitado, da cor vermelho tijolo, que indica positividade de açucares em amostra de frutose, porém houve um erro nos resultados finais de nossa equipe. O tubo com característica azul e com precipitados vermelho-tijolo indicam positividade de frutose em amostra desconhecida, o que deveria ter acontecido em nossa amostra na prática, ou seja, as amostras da equipe ainda detectaram dissacarídeos não formando precipitado característico. 
Sete tubos de ensaio foram utilizados para o teste de Bial, e em cada tubo já haviam sido adicionados a solução de urina desconhecida. A equipe colocou 1 mL do reagente e em seguida os tubos foram levados a capela por 5 minutos em banho-maria.
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Bial
	Amarelo claro
	Amarelo claro
	Amarelo claro
	Amarelo claro
	Amarelo claro
	Laranja Ferrugem
	Laranja Ferrugem
O teste de Bial é utilizado para identificação de pentoses e certos ácidos urônicos que se decompõem durante o aquecimento em presença de H+, formando pentoses. Compreende-se que as pentoses na presença de ácidos como o HCl e quando aquecidas, formam furfural que reage com orcinol. Esta reação é caracterizada pela cor verde e azul intenso e as hexoses pelo amarelo que vai alterando para uma cor marrom.
 
Para o Teste de Seliwanoff os sete tubos foram adicionados 3 gotas de urina desconhecida + 5 mL do reagente Seliwanoff. Os tubos foram agitados e levados ao banho-maria por 1 minuto.
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Seliwanoff
	Incolor
	Incolor
	Incolor
	Incolor
	Incolor
	Incolor
	Incolor
 	Seliwanoff diferencia cetoses e aldoses. Uma cetose origina pela ação desidratante do HCl um derivado furfúrico com muito maior facilidade do que uma aldose. Este derivado furfúrico se condensa rapidamente com resorcinol. Entende-se que as cetoses quando aquecidas juntamente com a presença de um ácido diluído, formam hidroximetil furfural que reagem com o resorcinol. Caracterizando esta reação podemos observar uma coloração avermelhada. Aldoses reagem mais lentamente desenvolvendo uma coloração rosa bem claro. Durante o tempo que as cetohexoses são desidratadas e reagem com o resorcinol, fornecendo a cor vermelha, as aldohexoses dão apenas a coloração rosada. No teste de Seliwanoff realizado, não se obteve coloração.
O Teste de Imbert foi o último a ser realizado, e 4ml de urina já haviam sido adicionados aos sete tubos que a equipe utilizou. 6 gotas do reagente de Imbert foram adicionados além de mais 1,5 mL de NH4OH. O que pode se observar que após a adição de NH4OH formou-se uma fase abaixo da solução de açúcar. 
	
	Glicose
	Frutose
	Sacarose
	Lactose
	Acetona
	Urina A
	Urina B
	Imbert
	Amarelo Claro
	Amarelo Claro
	Amarelo Claro
	Amarelo Claro
	Rosa Claro
	Amarelo claro
	Amarelo Claro
Este teste e muito utilizado para a identificação de corpos cetônicos. O que se entende é que os corpos cetônicos em meio alcalino produzem um complexo de cor roxa a púrpura quando reagem como nitroprussiado de sódio, ou seja, quando há a formação de um anel roxo, indica que há presença de corpos cetônicos na amostra de acetona no teste. Porém observou-seapenas uma coloração rosada com um anel pouco visível.
Aldose
Molisch	Positivo
Seliwanoff	Negativo
Benedict	Positivo
Barfoed	Positivo
Iodo		Negativo
Cetose
Molisch	Positivo
Seliwanoff	Positivo
Benedict	Positivo
Barfoed	Positivo
Iodo		Negativo
Dissacarídeo redutor contendo aldose
Molisch	Positivo
Seliwanoff	Negativo
Benedict	Positivo
Barfoed	Negativo
Iodo		Negativo
Dissacarídeo não redutor contendo cetose
Molisch	Positivo
Seliwanoff	Positivo
Benedict	Negativo
Barfoed	Negativo
Iodo		Negativo
Polissacarídeo
Molisch	Positivo
Seliwanoff	Negativo
Benedict	Negativo
Barfoed	Negativo
Iodo		Positivo
5 QUESTIONÁRIO
Explique o que é um açúcar redutor.
É um açúcar, quando em sua solução básica forma-se um aldeído, assim tornando-se um agente redutor, como na reação de Benedict, alguns dos açúcares redutores são, Frutose, Maltose, Lactose e Glicose.
Como você classificaria a urina A (normal ou alterada)? Justifique. 
Normal, no teste de Molish deu negativo, não se observou formação do anel púrpura na zona de junção dos dois líquidos do qual encontra-se presente em urinas com polissacarídeos.
O teste de Bial reage dando uma coloração alaranjada indicando cetohexoses e metilpentoses, das quais fornece tal coloração na solução. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage dando uma cor diferente (amarelado ao marrom).
O teste de Benedict é feito em meio básico e os íons metálicos nestas soluções baseiam-se na redução de Cu²+ a Cu+. Esta redução resulta na cor vermelho-tijolo e mostra a presença de um açúcar redutor em amostra de urina desconhecida indicando que a frutose, lactose e glicose são bons redutores devido sua estrutura. A cor azul, em sacarose e acetona, mostra negatividade da presença das mesmas na amostra, enquanto a urina A de cor característica verde mostra a confirmação de traços de glicose, ou seja, açúcares redutores presentes. 
O teste de Barfoed detectou dissacarídeos, sendo negativo, pois não se formou precipitado característico azul e precipitado vermelho-tijolo do qual indicaria positividade de frutose na amostra.
O teste de Seliwanoff realizado não obteve resultados para comparação.
Como você classificaria a urina B (normal ou alterada)? Justifique. 
Alterada, no teste de Molish deu positivo, ou seja, quando um polissacarídeo sofre hidrólise, gera desidratação dos açucares formando aldeídos com característica incolor que dão origem ao anel púrpura. A formação deste anel indica a presença de um hidrato de carbono na amostra. 
O teste de Bial reage dando uma coloração alaranjada indicando cetohexoses e metilpentoses, das quais fornecem tal coloração na solução. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage dando uma cor diferente (amarelado ao marrom).
O teste de Benedict é feito em meio básico e os íons metálicos nestas soluções baseiam-se na redução de Cu²+ a Cu+. Esta redução resulta na cor vermelho-tijolo e mostra a presença de um açúcar redutor em amostra de urina desconhecida indicando que a frutose, lactose e glicose são bons redutores devido sua estrutura. A cor azul, em sacarose e acetona, mostra negatividade da presença das mesmas na amostra, enquanto a urina B de cor característica verde mostra a confirmação de traços de glicose, ou seja, açúcares redutores presentes. 
O teste de Barfoed detectou dissacarídeos, sendo negativo, pois não se formou precipitado característico azul e precipitado vermelho-tijolo do qual indicaria positividade de frutose na amostra.
O teste de Seliwanoff realizado não obteve resultados para comparação.
Quais carboidratos você espera encontrar em uma amostra de urina normal? 
Não se espera encontrar nenhum tipo de açúcar na urina normal, pois em condições normais os carboidratos são reabsorvidos nos túbulos renais. 
Quais componentes seriam encontrados na urina de um paciente diabético que não faz controle da glicemia? Explique por que. 
Urina Normal – Benedict (-)
Glicose – Benedict + 
Frutose – Benedict ++
Arabinose – Benedict +
Acetona – Acetona só é detectado com o teste de Rothera
Urina Normal – Seliwanoff negativo (-)
Glicose – Seliwanoff - 
Frutose – Seliwanoff +
Arabinose – Seliwanoff -
Acetona – Acetona só é detectado com o teste de Rothera
Urina Normal – Bial - 
Glicose – Bial -
Frutose – Bial -
Arabinose – Bial +
Acetona – Rothera +
Quais testes você esperaria encontrar positivos na urina de pacientes com galactosemia? Justifique
O teste de Bial. Justamente pela identificação de pentoses e certos ácidos urônicos que quando há presença de H+ formam pentoses. Encontraríamos em testes positivos para açúcares redutores, no qual não iriam reagir na glicose oxidase, e poderíamos encontrar outros tipos de açúcares. 
A galactosemia é um erro inato do metabolismo, na qual não se consegue converter galactose em glicose da maneira normal. E como resultado imediato tem-se acúmulo de metabólitos da galactose no organismo, como galactose 1P e galactitol. A deficiência enzimática pode ser na β galactosidase, na galactose 1-P uridiltransferase ou galactoquinase. Os metabólitos resultantes da não conversão de galactose em glicose são tóxicos e podem causar lesões hepáticas, renais, assim como retardo mental e catarata.
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 Entende-se que por meio das aulas práticas o estudo de em geral, se torna mais complexo uma vez que podemos aperfeiçoar nossos conhecimentos adquiridos nas aulas teóricas. Além de analisar a importância da realização de tais testes, bem como o conhecimento de seus fundamentos para que entendamos todo o princípio baseado nas reações em nível biológico em nosso organismo e, especificamente neste experimento, para que saibamos realizar os testes e identifiquemos possíveis distúrbios metabólicos relacionados com os açúcares que azem parte de nossa dieta.
Portanto esta prática foi importante, pois como profissionais da área da saúde, biomédicos, somos responsáveis e precisamos ter o conhecimento de como identificar carboidratos na urina, utilizado em rotinas laboratoriais. 
REFERÊNCIAS
ABC.MED.BR, 2012. Qual a importância do exame de urina? Disponível em: <http://www.abc.med.br/p/vidasaudavel/306855/qual+a+importancia+do+exame+de+urina.htm>. Acesso em: 7 jun. 2015.
CHAMPE, P.; HARVEY, R.A.; FERRIER, D.R. Bioquímica ilustrada. Tradução Carla Dalmaz et al. 4ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2009.
CISTERNAS, J. R., MONTE, O., VARGA, J. Fundamentos de bioquímica experimental. 2ª ed. São Paulo: Atheneu, 2001. 276p
 
NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.