2 aula NOVA Tecnologia da biologia celular

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Tecnologia da Biologia 
Celular e MolecularCelular e Molecular
Os conhecimentos sobre as células progridem
paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de
investigação. O aparecimento de numerosas técnicas de
uso comum e os diversos ramos da pesquisa biológica
levaram ao surgimento do que se costuma chamar delevaram ao surgimento do que se costuma chamar de
biologia celular e molecular, que é o estudo integrado das
células, através de todo o arsenal técnico disponível.
Nesta aula serão incluídas apenas algumas técnicas que
têm contribuído para o progresso da biologia celular e
molecular.
TIPOS DE MICROSCOPIA
MICROSCOPIA ÓPTICA (MO):
• Campo claro;
• Campo escuro;
• Contraste de fase;
• Contraste interferencial;
MICROSCOPIA ELETRÔNICA (ME):
• de varredura (MEV)
• de transmissão (MET)
• Contraste interferencial;
• Polarização;
• Fluorescência;
• Microscópio invertido;
• Microscópio estereoscópico;
• Confocal a laser.
ALGUMAS PROPRIEDADES DAS LENTES 
DOS MICROSCÓPIOS
Limite de Resolução (LR) e Poder de Resolução
Limite de resolução: é a menor distância
entre dois pontos que permite distinguí-losentre dois pontos que permite distinguí-los
separadamente.
Poder de resolução: é a capacidade de
fornecer imagens nítidas. Quanto menor o LR
melhor poder de resolução.
Fórmula para o cálculo do LR
LR = K.λ/AN
LR = Limite de Resolução
K = constante experimental
estimada em 0,61
λ = comprimento de onda da
radiação
AN = Abertura Numérica
n = índice de refração do meio
AN = n.sen α
n = índice de refração do meio
α = metade do ângulo de abertura
da lente objetiva (ângulo
formado entre o eixo óptico da
lente objetiva e o raio de luz
mais externo utilizado na
formação da imagem).
Comprimento de onda da luz varia de 400 – 700 nm.
Comprimento de onda do elétron é de 0,005 nm.
Dica:
relação entre as unidades apresentadas abaixo:
1 mm = 1000 µm (micrômetro); 1 µm = 1000 nm
(nanômetro); 1 nm = 10 A (angstrom)
Aspectos comparativos do LR
Olho humano 0,2 mm
Microscópio de luz 200 nm (0,2 µm)
MEV 10 A (1 nm)
MET Ao redor de 1 – 2 A (0,1 – 0,2 nm).
Microscópio óptico (MO)
LENTES NO MO
Ex: Considere que em um laboratório, um técnico, está analisando uma
amostra de células em um microscópio equipado com o seguinte sistema
de lentes:
Lentes oculares de 10XLentes oculares de 10X
Lentes objetivas
Agora responda as questões:
a) Qual o aumento final da imagem quando o técnico utiliza cada
combinação de lentes?
b) Qual o limite de resolução de cada lente objetiva?
c) Em qual(is) lente(s) o técnico consegue observar duas estruturas
celulares separadas a uma distância de 0,5 µm?
MEV
MET
MOMO
TÉCNICAS DE 
PREPARO DE 
MATERIAIS PARA MATERIAIS PARA 
MICROSCOPIA
Animais de laboratório
Eutanásia
Anestésicos
Câmara de 
CO2 ou de 
anestésicos 
por inalação
Obtenção do material biológico
Lavagem em solução fisiológica
Fígado em solução
fisiológica NaCl a
0,9% (m/v)
Fixação
Desidratação
InclusãoInfiltração
- Navalhas
Aço
Vidro (1950)
Diamante e safira (1959)
- Navalhas
Aço
Vidro (1950)
Diamante e safira (1959)
PREPARO DAS NAVALHAS DE VIDRO
MICROTOMIA
BLOCO DE PARAFINA COM MATERIAL 
INCLUSO E LÂMINA CONTENDO CORTE
- Navalhas
Aço
- Navalhas
Aço
- Navalhas
Vidro 
- Navalhas
Vidro 
NAVALHA DE DIAMANTE
3000 US$3000 US$3000 US$3000 US$3000 US$3000 US$3000 US$3000 US$
Coloração Montagem
Técnica de contrastaçãoTécnica de contrastaçãoTécnica de contrastaçãoTécnica de contrastação (Dupla contrastação)Dupla contrastação)Dupla contrastação)Dupla contrastação)Técnica de contrastaçãoTécnica de contrastaçãoTécnica de contrastaçãoTécnica de contrastação (Dupla contrastação)Dupla contrastação)Dupla contrastação)Dupla contrastação)
Acetado de uranila
Solução a 2%
de 3 a 10 min.
e lavar 3
vezes em água
destilada.
Acetado de uranila
Citrato de chumbo
Solução a 3% com
mesmo processo
anterior.
Somente PbSomente Pb Uranila + PbUranila + Pb
Fígado de camundongo
Processamento: MO MET MEV
Dimensão/corte Variável 1mm Variável
Fixação Aldeídos, 
Bouin
Aldeídos Aldeídos 
Pós-fixação OsO4 OsO4
Desidratação Álcool, 
acetona. 
Álcool, 
acetona.
Álcool, 
acetona.acetona. acetona. acetona.
Inclusão Parafina ou
Historesina
Epon, Spur 
ou Araldite
Secagem
Microtomia Micrótomo Ultra-
microtomo
Coloração ou 
Contrastação
Coloração Contrastação
(Pb, U e etc)
Evaporação 
com ouro
Etapas da 
preparação preparação 
das amostras 
para MO. 
Etapas da 
preparação 
das amostras das amostras 
para a MET
Imagens ao MET
Célula de camundongo em 
apoptose mediada por LTC
Raiz (glutaraldeído seguido por
tetróxido de ósmio).
Pâncreas de rato (glutaraldeído
(2,5%), cacodilato (0,1M),
acetato de uranila/citrato de
chumbo.
apoptose mediada por LTC
Imagens ao MEV
CITOQUÍMICA
Citoquímica: compreende técnicas diversas para a identificação e
localização das moléculas que constituem as células.
Ácido desoxirribonucléico (DNA): O DNA é demonstrado
citoquimicamente pela reação de Feulgen. Etapas:
• Mergulha-se as lâminas em solução aquecida de ácido clorídrico, o
que promove hidrólise das bases púricas, deixando livre asque promove hidrólise das bases púricas, deixando livre as
extremidades da desoxirribose, que possuem radicais aldeídicos;
• Trata-se o preparado pelo reativo de Schiff (solução de fucsina
básica descorada pelo anidrido sulfuroso), que, ao se combinar com
os grupamentos aldeídicos da desoxirribose, forma um complexo de
cor vermelha.
Polissacarídeos: um exemplo é a técnica para evidenciar o glicogênio
conhecida como técnica do PAS (periodic acid Schiff).
• A reação baseia-se na oxidação pelo ácido periódico, de
grupamentos OH vizinhos, formando grupamentos aldeídicos que dão
cor vermelha ao reativo de Schiff.
• A reação não é específica para glicogênio, de modo que se aplica um
artifício: tomam-se duas lâminas com cortes do mesmo tecido, uma
das quais é previamente tratada pela enzima alfa-amilase. Essa enzima
hidrolisa e remove o glicogênio. Portanto, a estrutura que aparecer
corada pelo PAS na lâmina não tratada pela alfa-amilase mas não
aparecer corada na lâmina tratada pela enzima é glicogênio.
A microscopia de fluorescência é geralmente aplicada com técnicas
citoquímicas
• A principal aplicação da microscopia de fluorescência ocorre em
combinação com métodos imunológicos, nas técnicas
imunocitoquímicas que utilizam anticorpos conjugados a compostos
fluorescentes.
• A imunocitoquímica se baseia na reação antígeno-anticorpo, esta
técnica pode ser realizada aplicando-se a imunocitoquímica diretatécnica pode ser realizada aplicando-se a imunocitoquímica direta
(pouco sensível, e por isso, pouco usada atualmente) ou a
imunocitoquímica indireta (maior sensibilidade, permitindo a
demonstração de quantidades mínimas de antígeno, sendo a mais
usada na prática).
• Algumas substâncias podem ser utilizadas para marcar os
anticorpos, dentre elas: peroxidase, ferritina, anticorpo fluorescente,
complexo de ouro coloidal + proteína A (extraída das bactérias
Staphylococcus aureus).
Filtro de luz
Espelho difusor 
Filtro emissor
Fonte de luz
Espelho difusor 
do feixe
Lente 
objetiva
Objeto
Gavagem da suspensão 
com bactérias para o rato.
Retirada do fígado
Coleta do sangue e 
centrifugação
Soro contendo 
Bactéria
Inoculação da suspensão com 
bactérias no coelho.
Inoculação do soro
do coelho Coleta do sangue e 
Cortes do fígado
sobre a lâmina
Soro contendo 
anticorpos primários
Y
Gotas do anticorpo 
primário com corante 
fluorescente
do coelhona cabra.
1°) Gotas do 
anticorpo 
primário sem 
corante 
fluorescente
2°) Gotas do 
anticorpo 
secundário 
com corante 
fluorescente
Coleta do sangue e 
centrifugação
Soro contendo 
anticorpos secundários
Lâmina 2: Imunocitoquímica indiretaLâmina 1: Imunocitoquímica direta
Técnica imunocitoquímica direta: O composto (precipitado) formado pela ação da
peroxidase sobre a 3-3’-diaminobenzidina é de cor marrom-clara e elétron-denso.
Por isso, a técnica pode ser aplicada tanto à microscopia óptica como à eletrônica.
Imunocitoquímica direta com anticorpo
fluorescente
Etapas da imunocitoquímica indireta: Na etapa 1, o antígeno cuja localização se
deseja determinar combina-se com o anticorpo específico, formando um complexo
que não é visível nem no microscópio óptico, nem no eletrônico. A finalidade das
etapas seguintes é tornar esse complexo visível. Na etapa 2, agrega-se
antigamaglobulina marcada com peroxidase ao complexo já formado. Na etapa 3,
por meio da técnica citoquímica para peroxidase, forma-se precipitado visível nos
microscópios óptico e eletrônico, revelando-se assim o local onde está presente o
antígeno cuja localização era desejada.
Esquema para demonstrar a maior sensibilidade da imunocitoquímica
indireta (direita). Pela técnica direta (esquerda), esse antígeno celular
fixaria quatro moléculas do anticorpo; pela técnica indireta, ele fixou
20 moléculas de antigamaglobulina.
Anticorpo fluorescente
Esfregaço da bactéria Klebsiella pneumoniae vista ao microscópio de fluorescência