Aula 3 – Cultura em Células Animais (RESUMO)

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Aula 3 – Cultura em Células Animais (RESUMO)
Células animais em cultura são células cultivadas fora do organismo original e mantidas em laboratório. Tal sistema é complexo sendo capaz de produzir modificações pós-traducionais necessárias para a obtenção de determinados produtos. Para que estas células produzam a substância de interesse, é feita a construção de um DNA híbrido contendo a informação que irá induzir a expressão em algum sistema. Esse modelo pode ser utilizado como ferramenta para pesquisa e desenvolvimento, fabricação de produtos biotecnológicos, terapia celular, dentre outras aplicações. Para manter viva uma cultura com células animais, é necessário que haja nutrição adequada e controle do ambiente. 
O cultivo de células animais deve ser submerso, em meios de cultura com pH e temperatura extremamente controlados e atmosfera com concentração de gases controlada. O uso de estufas com sistema de injeção de CO2 pode resolver a questão do controle de gases atmosféricos. Uma indústria que utiliza células animais como meio de produção possui uma parte industrial e também um ambiente em escala laboratorial. Métodos como utilização de antibióticos para evitar contaminação e utilização de soro fetal como fonte de fatores de crescimento que são comuns em laboratórios não devem ser utilizados em escala industrial, pois não pode chegar traço de antibiótico na população para evitar resistência, e ter um componente de origem animal como o soro fetal não é ideal devido a questão de segurança, pois deve-se garantir que o componente será livre de qualquer contaminante. Com isso, em escala industrial são utilizados fatores de crescimento. O meio de cultura utilizado em escala industrial é comprado pronto que além de filtrado passa por radiação ionizante, então podemos afirmar que está livre de contaminantes. 
Para obtenção de culturas de células podem ser utilizados os métodos de:
Digestão enzimática: dissecação e depois um pedaço do material dissecado é adicionado a um coquetel de enzimas proteolíticas (p.ex. colagenase e elastase) que irão digerir proteínas da matriz;
Cultivo de explant: retira pequenos pedaços dos órgãos e os deixa aderidos ao fundo da garrafa de cultivo esperando que as células migrem para fora do órgão e colonizem o meio;
Dissecação simples: mimetiza a estrutura de um órgão.
As culturas de células animais podem ser ainda finitas as quais crescem, entram em estágio de senescência e morrem ou culturas contínuas que crescem indefinidamente. Estas últimas são interessantes para a indústria, pois não corre o risco de haver perda de células.
As células contínuas podem ser:
Células estabelecidas: crescem, entram em estado de senescência e após um tempo surgem clones que retomam o crescimento (p.ex. CHO e BHK);
Células transformadas: células tumorais sendo, portanto, imortais.
As células estabelecidas, em geral, dependem de adesão, não têm inibição por contato e são imortais. As células transformadas não dependem de adesão, não respeitam limites de contato e são imortais.
Células proliferam de acordo com o aporte de nutrientes e o volume em que são mantidas.
No cultivo de células em adesão, toda vez que for completado todo o espaço, a célula deverá ser retirada e colocada em outro espaço (manutenção cíclica). No cultivo de células em suspensão mantém-se o meio renovado retirando parte da suspensão e colocando mais meio. Células dependentes de adesão podem ser usadas em sistemas de suspensão desde que haja adaptação do sistema aprisionando as células em microcarreadores que estão em suspensão no meio.
Os sistemas de perfusão contínua são os melhores para produtividade. O metabolismo de células animais em cultura é essencialmente anaeróbico utilizando como principais fontes de energia glicose e glutamina. Células tumorais e outras células que se proliferam rapidamente realizam glicólise mesmo na presença de oxigênio gerando como produto final o lactato que pode acidificar o meio atrapalhando o controle do pH. A glutamina entra em um desvio do ciclo de Krebs e ao final gera glutamato e amônia. Lactato e amônia no meio acima de 20 mm inibe a produtividade. Portanto, o sistema de perfusão evita o acúmulo desses produtos.
Na manutenção cíclica, toda vez que as células ocuparem todo o suporte de cultura (confluência), deve ser realizada a remoção da adesão da célula à superfície de cultivo, torna-las em suspensão novamente, determinar a quantidade de células que serão colocadas em um novo frasco de cultura e, então, fechar o ciclo. A tripsina é uma protease inespecífica capaz de digerir as proteínas da matriz que a célula produziu para efetuar a adesão ao suporte de cultura. Utilizando esta protease pelo tempo certo será possível deixar as células antes aderidas, individualizadas e em suspensão.
O estágio de confluência total é quando não há mais espaço para as células crescerem. Células como a 3T3 (linhagem de fibroblasto de camundongos) ao passarem pelo estágio pós-confluência sofrem alterações irreversíveis, mudando até mesmo o fenótipo da célula. Logo, a manutenção cíclica é importante também para se manter a identidade da célula.
Em escala industrial, não é viável realizar manutenção cíclica e, com isso, após passarem pelo processo produtivo as células são eliminadas.
A contagem de células é realizada através da câmara de Neubauer em laboratório e através de computadores de contagem de células em escala industrial.
As células animais são guardadas através de criopreservação: técnica de preservação de espécies biológicas em baixas temperaturas. Para congelar essas células e evitar danos são utilizados crioprotetores como glicerol e DMSO que são capazes de diminuir o estresse osmótico durante o congelamento e formar cristais amorfos sendo esses menos danosos para a membrana. A criopreservação garante a obtenção de lotes de trabalho e, com isso, por mais que sejam feitos vários ciclos, o lote de cultura que está sendo introduzido será sempre muito parecido com o lote inicialmente comprado.
Toda produção industrial baseada em células animais é feita com escalonamento de inócuo: área e volume do inócuo são aumentados progressivamente até se obter a massa de células ideal para se colocar em um grande meio de cultivo. Alguns fatores devem ser considerados na ampliação de escala: células necessitam de meio de cultura complexo, células com alta sensibilidade a tensão de cisalhamento, necessidade de condições assépticas, manutenção da homogeneidade de temperatura, pH e gases.
Os biorreatores para células animais podem ser homogêneos (taque agitado, air-lift, de ondas) ou heterogêneos (leito empacotado ou fluidizado, fibras ocas). Os modos de operação dos biorreatores pode ser batelada alimentada ou perfusão.
Na produção de biofármacos, as principais células utilizadas são a CHO e a BHK, ambas oriundas de hamster. Estas são usadas para expressão transiente (expressão de um transgene por um breve período), mas também podem ser usadas para expressão estável (capacidade de expressão mantida pelo longo do tempo). Esses modelos são utilizados basicamente para a produção de proteínas recombinantes como enzimas, hormônios, fatores de crescimento, fatores de coagulação e anticorpos monoclonais.
Para a produção de biofármacos é necessário passar por fases de desenvolvimento. São elas:
Desenvolvimento da linhagem celular: clonagem e expressão do gene de interesse, seleção do clone mais adequado;
Cultivo celular: formação do meio de cultivo, tipo de biorreator e modo de operação;
Purificação: técnicas a serem empregadas, número de etapas e combinação entre elas, maximização do rendimento x grau de pureza;
Formulação e envase: adjuvantes, novas formas de administração.
Permeando todas as fases estão o registro de dados, controle de qualidade de matérias-primas e produtos, garantia de qualidade, aspectos regulatórios.
Para induzir a célula a produzir o que queremos basta clonar a informação desejada encontrada na célula original e colocar em um vetor que irá carregar esse inserto. Essevetor precisa ter regiões promotoras que serão reconhecidas por células eucarióticas. Daí será feita ou a expressão transiente em que a informação não é integrada, mas dividida com a célula-filha e com o tempo vai perdendo a expressão (dura no máximo 4 dias), ou a expressão estável em que a informação é recombinada no genoma da célula. Em geral isso é feito por transdução viral em que o vírus carrega a informação de interesse e ao infectar uma célula ele integra essa informação no genoma da célula e com isso a informação passa para as próximas gerações. A expressão estável é a mais apropriada para escala laboratorial, mas como possui alto custo, em geral, toda a etapa de desenvolvimento é feita com expressão transiente e em seguida utiliza-se a expressão estável.
Como exemplos de biofármacos produzidos em cultura de células animais, podemos citar:
Citocinas: o interferon alfa pode ser produzido em bactérias, pois a glicosilação não interfere em sua atividade. Já os interferons beta e gama, se produzidos em bactéria, por não haver glicosilação não serão ativos biologicamente. Logo, atualmente são produzidos em células CHO recombinantes em biorreatores com microcarreadores;
Eritropoietina: cerca de 40% da massa molecular da eritropoietina decorre de suas glicosilações. Produzida atualmente em células CHO;
Fatores de coagulação sanguínea: possuem diferentes tipos de modificações pós-traducionais (além da glicosilação) que não conseguem ser realizadas por fungos e bactérias sendo produzidas em células CHO e BHK.