Aula 4 – Produção Biotecnológica de Anticorpo e Vacinas

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Aula 4 – Produção Biotecnológica de Anticorpo e Vacinas
SITUAÇÃO DO MERCADO DE BIOTECNOLOGIA
Anticorpos monoclonais: Principal produto biotecnológico farmacêutico a venda no mercado;
Vacinas recombinantes: Não tem uma coluna tão expressiva de vendas, porém é um dos mais usados no mundo todo.
Ou seja, a medida que tem anticorpo monoclonal sendo vendido a dose no Brasil por 10, 14 mil reais, uma vacina recombinante é muito subsidiada pelo governo, então tem o preço baixo e o lucro das empresas é relativamente baixo. A tendência é que haja um aumento no mercado desses produtos, pois vários locais estão pesquisando e desenvolvendo.
CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE ANTICORPOS
Repertório de anticorpos humanos varia entre 107-108 moléculas de diferentes tipos de anticorpos. Nosso sistema imune já contém informação para coisas que nunca veremos na vida. Para produzir 107 anticorpos diferentes não significa que temos essa mesma quantidade de genes de anticorpo. 
Rearranjo gênico de imunoglobulina: 
Imunoglobulinas são proteínas do sistema imunológico, receptoras ou reconhecedoras de antígenos. Quando imunoglobulinas desempenham sua função, ou seja, reconhecem o antígeno e se ligam a ele sinalizando para o sistema imunológico, é chamada de anticorpo. Sendo assim todo anticorpo é imunoglobulina, mas nem toda imunoglobulina é anticorpo.
Os anticorpos de dividem em duas regiões, uma constante chamada Fc, e uma variável chamada de Fab. 
O gene de imunoglobulina é composto por segmentos diferentes dentre os quais temos uma região chamada de região VDJ. Para cada linfócito que a gente produz, dentro do conjunto de possibilidades do segmento gênico, a célula vai escolher aleatoriamente uma combinação desse segmento. Então, por exemplo, no segmento V temos até 100 segmentos diferentes, no D temos até 30 segmentos diferentes, no J temos 6 segmentos diferentes. Se fizermos uma análise combinatória desse número, chegaremos em um número de possibilidades muito grande. Além desse, temos um evento pós-combinação chamado de hipermutação somática: são criadas mutações pontuais que vão refletir em diferentes aminoácidos na sequência final da imunoglobulina. O mecanismo de hipermutação somática ainda não está esclarecido, mas sabe-se que aumenta mais 100x a diversidade de anticorpos, levando a um teto de 1010 diferentes Igs. Do ponto de vista imunológico, isso é muito bom, porque uma célula B naive, isto é, que nunca entrou em contato com um antígeno, já tem a informação do anticorpo que ela produz (contida no BCR, receptor de célula B) e ao entrar em contato com o antígeno que é reconhecido pelo BCR ocorre uma expansão clonal, ou seja, uma célula de linfócito B vai produzir cerca de 4 mil células iguais a ela. Em torno de um dia após isso acontecer, essa população de células B ativas vão se diferenciar em plasmócitos, que são as células que efetivamente secretam anticorpos. Então, teremos 4 mil plasmócitos produzindo uma quantidade gigante de anticorpos iguais. O genoma da célula inicial é que determina a sequência de anticorpo que a célula final terá, por isso é uma expansão clonal.
O antígeno possui diversos sítios de ligação específicos que são reconhecidos por um anticorpo chamados epítopos, logo, um antígeno possui vários epítopos. Para cada epítopo que é reconhecido por um determinado linfócito B teremos o evento de expansão clonal acontecendo. No fim, teremos diversas populações oriundas de diversos linfócitos que reconhecem epítopos diferentes de um mesmo antígeno, que vão produzir uma massa de anticorpos contra aquele determinado antígeno. Do ponto de vista de eficiência de defesa, essa opção é muito boa. Isso é o que chamamos de resposta policlonal, ou seja, vários linfócitos diferenciaram-se em vários plasmócitos que produzem vários anticorpos contra diferentes epítopos de um mesmo antígeno.
Anticorpos policlonais: Resultantes da ativação de vários linfócitos B diferentes por apenas um agente antigênico. Todos os anticorpos irão atuar contra o mesmo antígeno, porém irão reagir contra epítopos diferentes.
Anticorpos monoclonais: Anticorpos iguais originados de um único tipo de Linfócitos B ativado (plasmócito). Possuem a mesma estrutura e especificidade, ligando-se, portanto, no mesmo epítopo.
O produto farmacêutico é um anticorpo monoclonal. Por que não policlonal? Porque maior será a possibilidade de haver um efeito que não dá para controlar, então, trabalhar com um produto com uma grande combinação de anticorpos seria um problema. 
Essa ideia de usar anticorpos como ferramenta terapêutica não é muito nova: em torno de 1900 ocorreu o desenvolvimento da primeira terapia baseada em anticorpo, que nesse caso era policlonal. 
Em que momento seria interessante usar uma terapia policlonal? Envenenamento por animais peçonhentos. Usamos o soro do animal exposto aquele antígeno: injeta o veneno (p. ex., de cobra) em dose subletal em um animal (p. ex., cavalo) que irá responder de forma policlonal e retira o soro dele e injetamos no indivíduo. Alguns indivíduos deixam de responder a sucessivas doses de soro antiofídico. Por quê? Porque ele cria anticorpos contra o soro.
Em 1975 se iniciou a segunda era de terapia com anticorpos e foi quando se desenvolveu a primeira terapia com produção de anticorpos monoclonais. Essa terapia foi se desenvolvendo até a atualidade.
Qual é a farmacodinâmica de um anticorpo monoclonal?
A ideia de usar um anticorpo contra um tumor é para que ele pare de crescer ou morra. 
Sabemos que as células proliferam mediante sinais que em partes são extracelulares. Vamos supor que temos um determinado ligante que quando encontra o seu receptor na célula X irá ativar a proliferação dessa célula. Como podemos pensar em uma terapia a base de anticorpo para perturbar esse sistema inibindo a via que promove a proliferação celular? Podemos pensar em um anticorpo anti o ligante. Então, se é um hormônio ou um fator de crescimento qualquer, podemos fazer um anticorpo anti-ligante. Uma vez o ligante capturado pelo anticorpo, ele não se torna mais acessível ao receptor. Essa é a opção mais direta que podemos pensar.
Podemos pensar também em um anticorpo que liga no receptor obstruindo seu sítio de ligação parando a sinalização. Podemos pensar em outras coisas mais interessantes: Por exemplo, se tivermos um anticorpo que ativa um receptor que induz a morte da célula, ao usarmos um anticorpo que se liga nesse receptor estaremos induzindo a morte celular. 
Podemos pensar em um anticorpo que se liga a um antígeno da célula e que essa ligação faz com que tenhamos a ativação da imunidade citotóxica. Podemos ter também a ativação do sistema complemento baseado na terapia anticorpos. E podemos pensar também em uma outra coisa: vamos supor que temos uma toxina letal para a célula; não podemos injetar toxina na corrente sanguínea da pessoa porque senão todas as células acabarão morrendo; mas se a gente conjuga o anticorpo com uma toxina letal? Essa toxina, agora, será direcionada para células que forem alvos desse anticorpo. Então podemos fazer o direcionamento dessa toxina para a célula que se quer matar.
Para isso tudo acontecer, temos que dar um jeito de produzir anticorpos de forma controlada. Aí, entramos na parte da biotecnologia.
Então, vamos entender como produzimos anticorpos de forma controlada.
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS (MABS) POR HIBRIDOMAS
Essa produção não é exatamente biotecnológica, mas é a base do conhecimento da produção industrial de anticorpos monoclonais e, além disso, embora não usemos mais esse tipo de anticorpo para terapia, eles ainda têm uma importância comercial muito grande no que diz respeito a diagnóstico e como ferramenta de pesquisa. Então como ocorre?
 Temos um determinado antígeno e queremos fazer um anticorpo conta ele. Se injetarmos esse antígeno em um animal, ele naturalmente irá responder a esse antígeno. Se pegarmos as células do baço desse animal, teremos um enriquecido de linfócitos B que entraram em contato com esse antígeno.O grande problema é que esses linf B não podem ser usados diretamente para a produção industrial, porque uma vez que esse linf B se diferenciou em plasmócito, o único destino que ele terá é a morte. Então, conseguiríamos fazer uma produção baseada em linfócitos de animais? Não, porém essas células possuem uma característica que desejamos que é produzir anticorpo contra o que injetamos no animal. Então temos uma característica boa, mas não temos outra fundamental: imortalidade. Logo, precisamos dar um jeito de essa célula ganhar imortalidade. Como poderíamos fazer isso? Nesse sistema de hibridomas, iremos usar uma linhagem de células de mieloma derivadas de camundongos. O que essa célula tem de bom? Ela é um tumor, um câncer hematológico, logo, é imortal. O que ela tem de ruim? Não produz anticorpo contra o que a gente quer. Se temos dois grupos de células com características que interessam e que não interessam, não podemos juntar as duas? 
Então, se pegarmos as duas populações (linfócitos B e células de mieloma) e colocarmos em um tubo com um agente fluidificante de membranas (PEG) vamos propiciar que as membranas das células se fundam e temos, então, uma célula que é um híbrido: metade linf B, metade mieloma. Esse híbrido celular carrega as duas informações que queremos: é imortal e produz anticorpo. O que queremos é a fusão de linfocito com mieloma, mas a natureza pode fundir também linfócito com linfócito e mieloma com mieloma ou não fundir ninguém. Então, como faremos pra saber onde estão as fusões que interessam para a gente? Uma vez que fizemos a fusão e deu certo, teremos que dar um jeito de selecionar os hibridomas e desse conjunto de hibridomas temos que selecionar aquela célula que produz o anticorpo que se quer. Uma vez chegando nesse ponto, podemos fazer expansão de escala com o tipo industrial que a gente quer produzir.
Como podemos selecionar somente os híbridos mieloma com linfócito?
A célula de mieloma é deficiente de uma via metabólica fundamental que é a via timidina cinase (TK). A cinase pega timidina, monofosforila e forma a timidina monofosfato que em sequência é fosforilada a difosfato e em sequência a trifosfato. O que TTP (timidina trifosfato) faz em uma célula? É um nucleotídeo precursor de DNA, logo, toda célula tem que fazer. Então, como uma célula deficiente de TTP consegue sobreviver? Toda célula tem uma via chamada de via de salvação de nucleotídeos que faz com que possamos reciclar uma parte dos nucleotídeos que temos. Então, não precisamos necessariamente seguir a via da TK para fazer os nucleotídeos necessários para a produção de DNA. As células de mieloma só sobrevivem porque tem a via de salvação ativa. O linfócito que vem do camundongo é selvagem e, portanto, tem a via TK e a via de salvação. Acontece que quando fundimos as duas populações e plaqueamos em um meio que inibe a via de salvação, o mieloma irá morrer e o linfócito B morre com o tempo. Quem consegue sobreviver nessas condições será apenas a fusão linfócito B e mieloma. Esse meio de seleção é chamado de meio HAT e com ele podemos dar a chance de apenas células fundidas linfócito com mieloma sobreviverem. 
Agora, então, o que teremos é um infinidade de hibridomas e o próximo passo será selecionar individualmente cada uma dessas células. O método mais simples para fazermos isso é o chamado de diluição limitante: vamos diluindo a suspensão celular até que se tenha uma célula a cada 100 μL e iremos plaquear. A partir disso iremos pesquisar qual é o hibridoma que tem o anticorpo que a gente quer.
Resumidamente, o que acontece no meio HAT é: se o genótipo é TK negativo, é imortal, mas irá morrer em meio HAT; se é TK positivo, é mortal e morre com o tempo; se é TK positivo e negativo, sobrevive no meio HAT.
Por que não usamos mais anticorpo monoclonal derivado de hibridoma pra clínica?
Porque é um anticorpo de espécie não humana e, por isso, não pode ser usada em humanos sucessivas vezes, pois irá perder a eficiência. 
ESTRATÉGIAS DE HUMANIZAÇÃO DE MABS
Temos duas classes de anticorpos monoclonais humanizados:
Anticorpos quiméricos:
A parte que interessa do anticorpo é a fração variável (Fab). Se pegarmos a informação de um anticorpo de uma outra espécie e clonar essa informação em fusão com a informação da fração constante de um anticorpo que é humano iremos gerar uma ptn com informação predominantemente humana e uma parte da informação oriunda de outra espécie qualquer. Com isso, teremos formado um anticorpo quimérico.
Anticorpo humanizado: 
Toda fração Fab de um anticorpo é necessária para a interação com os antígenos? A interação da Fab com os antígenos se dá por determinados pontos da estrutura. Esses pontos específicos são chamados de regiões CDR que são as regiões determinantes de complementariedade. Na realidade, o que precisamos é só do CDR, o restante da porção Fab não interessa. Então, se clonarmos essas informações em um vetor de expressão que já contém todo o esqueleto do anticorpo humano, teremos o chamado anticorpo humanizado, ou seja, tem cerca de 98% de informação derivada de humano e cerca de 2% derivada de outra espécie qualquer. 
Com isso, podemos começar a pensar em fazer coisas que a natureza não pensou. Será que precisamos ter a estrutura do anticorpo inteiro para fazer uma molécula para diagnóstico, por exemplo? Não, o que interessa para a gente é só a fração Fab do anticorpo e poderíamos fazer uma molécula com apenas uma fração Fab.
Precisamos ter as duas perninhas Fab? Não, podemos ter uma só.
Podemos ter uma molécula, também, com a fração Fab de um anticorpo ligado a fração Fab de outro anticorpo, ou seja, uma molécula bivalente.
Mas qual a aplicação para tudo isso? Vamos pensar em um tumor epitelial que passa pela transição epitélio-mesênquima ganhando a capacidade de metastatizar. Esse caminho muda o padrão de expressão gênica inteiro da célula, mas em determinado momento haverá marcadores de célula epitelial juntos com marcadores de célula mesenquimal. Como podemos fazer o diagnóstico disso? Se colocar o anticorpo marcador de célula epitelial, vai marcar o tumor e todas as células epiteliais, se for mesenquimal, marca todas as células mesenquimais, mas só no tumor haverá marcadores de células epiteliais e mesenquimais juntos.
PHAGE DISPLAY (VARREDURA DE FAGOS)
Essa técnica se baseia na seguinte premissa: 
Pegamos o animal e imunizamos com o antígeno de interesse. Então, retiro os linfócitos desse animal (extrai o baço e retira). Dentro dessa população de linfócitos está a informação que queremos. Se eu extraio o RNAm dessa população de linfócitos, a informação para a produção do anticorpo que eu quero está nessa mistura de RNAm. Se fizermos transcrição reversa desse RNAm vamos gerar uma biblioteca de cDNA que representa a população de linfócitos originalmente. Com essa biblioteca iremos fazer um PCR apenas para as regiões que nos interessa. Sabemos que as regiões que estão do lado da fração Fab são comuns a todos, então, se fizermos um PCR onde os primers flanqueiam a fração Fab iremos gerar produtos do PCR com o mesmo tamanho, porém cada produto será diferente a um cDNA que é referente a um linfócito retirado do camundongo. A partir desses pedaços de DNA gerados pela técnica de PCR, iremos clonar esses pedaços em um vetor de expressão, e essa sim será uma clonagem randômica, pois serão clonados o maior número possível de pedaços sem saber quem é quem. O vetor de expressão tem a informação para uma proteína estrutural de fagos (fagos são vírus que infectam apenas bactérias). Qual a ideia disso? Quando expressar essa proteína e for montar o vírus, teremos um vírus perfeitamente igual ao fago, porém uma das perninhas do fago vai ser uma parte a proteína original e na ponta haverá a fração Fab de um anticorpo qualquer. No fim, temos uma biblioteca de fagos. 
Se eu pegar essa população de fagos e infectar uma cultura de bactérias E.coli, o fago irá começar o seu ciclo biológico. Se plaquearmos essa população de E. coli infectada teremoso crescimento de colônias onde cada colônia representa uma célula que foi infectada por um fago diferente. Temos uma placa com várias colônias e cada uma produzindo um fago que recebeu. Se eu pego uma membrana onde tenho meu antígeno imobilizado e colocar essa membrana em cima dessa placa, quem ficará grudado nessa membrana? Os fagos que tem a sua estrutura com Fab que reconhece essa membrana. Mas a membrana não é a imagem especular da minha placa? Se eu tenho a coordenada certa da membrana, terei a coordenada certa da placa. Então, a informação para produzir o pedacinho de proteína Fab que reconhece o antígeno está na bactéria que está produzindo fago. Então, eu vou na placa, pego a colônia de bactérias, expando, extraio o DNA plasmidial e mando sequenciar. Quando sequencio terei a sequência da fração Fab que reconhece o antígeno que quero. Isso vai acontecer com diversas colônias diferentes e uma vez que tenho essa informação, clono o pedaço de DNA em um vetor de expressão, mas dessa vez com a produção do anticorpo que eu quero. Portanto, cada fago é resultado da expressão de um vetor clonado com um pedaço de Fab aleatoriamente, resumidamente, cada fago representa um linfócito da população original.
Será que precisamos trabalhar com uma população de linfócitos que foi, de fato, previamente exposta ao antígeno? Não, pois os linfócitos do animal já possuem toda a informação para a produção de anticorpos para antígenos aos quais ele ainda não foi exposto.
Existem outras variações do Phage Display como, por ex., ao invés de usar uma membrana embebida no antígeno, utiliza-se uma bead (partícula magnética) que já tem o antígeno imobilizado. Ao colocar em contato com os fagos, quem interagir com a bead magnética vai ficar grudado e, então separamos com o uso de um imã; faz-se uma purificação magnética e procura quem são os que ficam grudados. (FIGURA NA PÁGINA SEGUINTE)
Será que vale a pena humanizarmos um anticorpo?
Sim. Se olharmos os parâmetros farmacocinéticos, o tempo de meia-vida de um anticorpo murino é de 30 a 40 h, isso significa que uma terapia baseada nesse tipo de anticorpo terá que ser feita pelo menos diariamente. O tempo de meia-vida de um anticorpo quimérico é de 200 a 250 horas, quase dez vezes mais que o outro. Um anticorpo humanizado tem um tempo de meia-vida semelhante à de um anticorpo natural: 14 a 21 dias.
A resposta anti-anticorpo também acontece com anticorpos recombinantes, mas a probabilidade e a intensidade são extremamente menores.
CARACTERÍSTICAS DA PRODUÇÃO DE MABS EM CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS
(Por que células animais? Um anticorpo é constituído por 4 cadeias proteicas: duas pesadas e duas leves, que são arranjadas por pontes dissulfeto e é glicosilado, então, não tem outro jeito a não ser produzir em células animais.)
A alta produtividade de um sistema baseado em células animais resulta da combinação de 3 fatores:
1) Eficiência da transcrição do gene do anticorpo
2) Eficiência da tradução e montagem do anticorpo
3) Capacidade de atingir e manter altos níveis de células viáveis
As células que normalmente usamos para fazer anticorpos são as células CHO (células de ovário de hamster chinês) e BHK (células de rim de neonato de hamster), se elas puderem não fazer anticorpo, elas não irão fazer, pois são moléculas grandes e complexas. Então, tanto para a transcrição como para a tradução, precisamos forçar a célula a fazer.
FATORES A SEREM CONSIDERADOS NA PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE MABS
1) Linhagem celular e sistema de expressão
2) Modo de operação do processo
3) Processo de purificação
4) Métodos de controle de qualidade
1) Linhagem celular e sistema de expressão
Principais linhagens celulares utilizadas:
- Aderentes e adaptáveis: CHO e BHK
- Não aderentes: NS0 e Sp2/0
No meio industrial, como irá se atingir altas densidades celulares, a tensão de cisalhamento do biorreator passa a ser uma característica que deve ser pensada. Em geral, usa-se algum agente redutor de tensão de cisalhamento, especialmente na produção de anticorpo monoclonal. Os mais utilizados são o Pluronic e a carboximetilcelulose.
Principais sistemas de expressão utilizados na produção de Mabs:
- Sistema Dihidrofolato redutase (DHFR);
- Sistema Glutamina Sintetase (GS)
Se clonar a informação do anticorpo em um vetor de expressão de célula animal, qualquer célula animal, quando recebe uma informação como essa, se o promotor estiver certo, ela irá produzir isso por um determinado tempo. Mas a célula animal sabe quando está fazendo algo que não precisa e, então, ela vai silenciar esse gene. Isso acontece comumente. Logo, precisamos dar um jeito de forçar a célula a continuar produzindo anticorpo independentemente de qualquer coisa. Como podemos fazer isso? 
Para sobreviver a célula precisa expressar diversas coisas constantemente, porém se clonarmos alguma coisa no local de algo que ela precisa expressar, consequentemente, a célula deixar de expressar aquilo que deveria. 
Pensando nos sistemas acima: 
As células que usamos são deficientes dessas duas vias: DHFR e GS.
Uma célula GS negativa é deficiente da via de glutamina sintetase e para sobreviver precisa receber constantemente glutamina, ou seja, precisa ficar em um meio rico em glutamina para que não morra. Posso mudar a célula geneticamente colocando no vetor de expressão do anticorpo de interesse, a informação do anticorpo em combinação com a informação da complementação da deficiência seja da glutamina sintetase ou para a síntese de dihidrofolato redutase. Se eu colocar esse segmento gênico dentro da minha célula e colocar ela em um meio onde ela só sobrevive se produzir isso, ela só terá a opção de continuar expressando esse segmento gênico para continuar sobrevivendo. Enquanto mantiver a célula em um meio seletivo há a garantia de que o gene de interesse está sendo expresso.
2) Modo de operação do processo (Esquema de produção de Mabs)
 A produção de anticorpo tradicional era feita em tanques de fermentação de batelada alimentada. Anticorpos são moléculas estáveis, então pode-se manter esse processo acontecendo em um tempo determinado e com uma densidade celular muito alta. Essa é uma especificidade dessa produção.
Uma vez produzido em tanques, toda a produção é escoada para uma primeira etapa que é basicamente centrifugar e ficar com o sobrenadante. Uma vez com o sobrenadante separado, vamos aplicar em uma rotina de purificação que hoje em dia é completamente online. Como é uma produção baseada em célula animal, não podemos esquecer que a partir do momento que se retira a célula do banco de células até chegar no fermentador de produção é necessário escalonar, então, temos que ir aumentando a quantidade de células até chegar na quantidade necessária para a produção industrial.
3) Processo de purificação
 A primeira etapa é a clarificação. Teremos duas ou três etapas de purificação. A primeira técnica que iremos usar será sempre uma coluna de afinidade seguida de uma etapa intermediária onde utilizaremos uma técnica convencional de cromatografia. Uma vez purificado haverá a etapa de cleaning da endotoxinas.
Duas grandes vertentes da purificação de anticorpos: A primeira é a vertente de três colunas, então são industrias que trabalham com uma primeira etapa de afinidade seguida de pelo menos duas etapas de cromatografia e, por fim, haverá o produto em um grau de pureza muito elevado; a segunda vertente é a de duas colunas, então, primeiro haverá captura por afinidade seguida de uma troca iônica normalmente.
Por que a primeira etapa é de captura? As ptns A e G são de alta afinidade pela fração Fc do anticorpo, então, uma coluna de ptn A, G ou com as duas só irá reter moléculas com a fração Fc, logo, só retém anticorpo.
Para a cromatografia devem haver sempre tanques para ajuste do tampão.
Precisamos que o método de purificação seja eficiente: rendimento e pureza. Essas colunas cromatográficas proporcionam um rendimento superior a 95% e com grau de pureza superior a 95%.Temos diversas aplicações para anticorpos monoclonais. As principais aplicações estão relacionadas a câncer.
VACINAS RECOMBINANTES 
Modelo usado para a aula: Vacina viral recombinante.
Componentes Moleculares Dos Vírus
Os vírus possuem dois componentes básicos: 
Componente nucleico – que carrega a informação
Componente proteico – capsídeo ideal
Vírus não envelopados só tem capsídeo e componente nucleico.
Vírus envelopados possuem envelope lipídico (bicamada lipídica) oriundo da membrana de células infectadas que protege o capsídeo viral com o ácido nucleico. O envelope viral tem em sua superfície ptns virais.
Independente da classe de vírus que se tem (fita simples de DNA ou RNA, fita dupla de RNA, etc.), todos, para cumprirem seu ciclo biológico, precisam passar necessariamente pela etapa de transcrição de RNAm porque precisam produzir ptn para manter seu ciclo biológico.
Vacinas clássicas: 
- Vírus atenuado
- Vírus inativado
Para produzir esse tipo de vacina, necessariamente, precisa-se conhecer o ciclo biológico do vírus. Entretanto, além de conhecer o ciclo biológico, precisa-se ter a capacidade de produzir esse vírus em laboratório. Os vírus tem tropismo, então, eles gostam de infectar determinados tipos de célula, sendo difícil desenvolver um sistema in vitro que sirva para qualquer um.
Sistema para produção de vacina clássica:
- Uso da linhagem celular (células de rim de macaco)
- Sistema embrionário (ovos de galinha)
Então, para produção de vacinas clássicas é necessário conhecer o ciclo biológico do vírus e ter uma tecnologia de produção que precisa ser extremamente segura para os trabalhos, meio ambiente e para o produto final.
Quais são os determinantes antigênicos de um vírus? O componente proteico.
Se determino uma proteína do vírus capaz de iniciar uma resposta imune, encontramos uma boa ideia alternativa para a produção de vacinas se livrando do problema da segurança.
Vacinologia reversa: Não é necessário isolar o vírus. A partir do genoma de determinado vírus, vai se determinar a estrutura, totalmente in silico, e, então, será possível saber se essa estrutura é um bom agente imunogênico ou não.
Exemplos de produção de vacinas recombinantes:
Vacina contra hepatite B
O vírus da HB tem em sua superfície uma proteína extremamente imunogênica chamada HBsAg. Essa ptn isoladamente já consegue gerar uma resposta imunocompetente no animal em que foi injetada. A sequência gênica da ptn pode ser encontrada em qualquer banco de dados. Clona-se essa sequência em um vetor de expressão que não precisa ser muito complexo (p. ex., levedura), essa levedura carregando o vetor de expressão começa a produzir HBsAg, e, uma vez purificada essa ptn, basta envasar e está pronta a vacina. Em nenhum momento usamos vírus, apenas a levedura que é muito mais fácil de ser aprovada, e gera uma vacina totalmente eficiente.
Logo, temos como vantagens para a produção de vacinas recombinantes:
Produção rápida
Produção em larga escala (por não ter agente infeccioso)
Livres de partículas virais infecciosas
Vacina contra influenza vírus
O que mais muda no vírus influenza é uma das suas ptns de superfície, a hemaglutinina (HA), então, em cada temporada, esse vírus muda. Se sabemos isso, colocamos essa informação, purificamos, produção em escala industrial e, então, a vacina é uma ptn HA purificada. Se surge um vírus novo com mutação na HA, só precisamos trocar a informação do vírus antigo para o vírus novo.
Essa lógica de vacina recombinante não funciona para tudo. 
ORGANISMOS CARREADORES RECOMBINANTES
Se pegarmos um agente não-patogênico e colocarmos em um indivíduo, o sistema imune irá responder a esse agente. Vamos pensar em uma ptn de um patógeno que isoladamente não é muito imunogênica. Pegamos, então, a sequência dessa ptn e clonamos no papel genético do vírus não-patogênico para humanos (vírus vaccínia), de modo que agora teremos um vírus não-patogênico que carrega a ptn de um vírus que não tem nada a ver com ele. Ao injetar esse vírus não-patogênico modificado em um animal, a resposta imune que ele irá produzir contra o não-patogênico irá proteger também contra o vírus que se quer imunizar. A isso, damos o nome de estratégia de organismos carreadores. Então, a ideia é pegar um organismo não-patogênico, modificá-lo com uma proteína do organismo patogênico e este, quando processado pelo sistema imune, vai gerar uma resposta contra o vírus patogênico também. O limitante dessa estratégia é que essa ptn não pode ser um determinante da patogenicidade do vírus. Então, a ptn deve ser não patogênica e sua imunogenicidade será aumentada ao ser inserida em um vírus não-patogênico.
Vacina contra Papiloma vírus
É composta pelo vírus vaccínia carregando ptns do papiloma.
As vacinas recombinantes mais atuais usam geralmente a cepa do vírus vaccínia (cepa Ankara). A etapa de desenvolvimento de uma vacina recombinante é de cerca de 12 semanas, muito mais rápido do que qualquer vacina convencional. Até chegar ao mercado, uma vacina demora cerca de 5 anos. Em caso de surto, a etapa de ensaio clínico é reduzida, ganhando licença temporária.
E se o sistema imune precisa reconhecer um conjunto de ptns do vírus que estão organizadas de uma forma própria?
VÍRUS LIKE PARTICLES (VLPS)
O que faz um vírus ser patogênico? Seu material genético!
Partículas vírus-like são partículas semelhantes ao vírus sendo estruturalmente igual (capsídeo igual), porém não possui o material genético.
Se pegamos essa partícula vírus-like e injetamos em um animal, haverá resposta contra o vírus sem que nenhuma infecção ocorra. Isso pode ser ainda melhor como, por exemplo, a vacina Gardasil que consiste em uma vacina tetravalente contendo os componentes do capsídeo de 4 vírus diferentes de HPV relacionados com o câncer.
A produção é semelhante à de uma ptn recombinante. O que muda é que ao invés de estar trabalhando com uma só ptn, trabalha-se com um complexo proteico. A produção será feita em sistema de batelada utilizando leveduras, seguindo para a etapa de purificação e filtração.
“VACINAS” DE DNA
Usada quando é necessário gerar uma resposta citotóxica e não humoral, pois estimula a produção de linfócitos. É uma resposta pontual e não gera memória (não gera imunidade). A ideia dessa vacina é induzir a expressão de uma proteína antigênica do próprio organismo. Muito utilizada para o tratamento de tumores ou patologia que induzem uma resposta baixa. Eficiente quando se quer imunizar contra um patógeno intracelular.
Pega-se a célula normal e dá a informação para ela expressar em sua superfície o antígeno que a marca como infectada. Ao colocar a célula de volta na corrente sanguínea, o sistema imune irá reconhece-la desencadeando uma resposta citotóxica para a destruição das células infectadas. Independentemente de estar expressando muito ou pouco, o sistema imune estará ativo e em algum momento irá alcançar o sítio alvo.
Usar o termo vacina é errado já que nessa situação a intenção é eliminar algo que já está instalado não gerando uma imunização, mas sim uma resposta imunológica contra um patógeno.