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Disciplina de Bioquímica Estrutural Curso de Biologia Aula 12: Enzimas – Introdução e Cinética Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Enzimas GRANDE maioria formada por proteínas (algumas enzimas são formadas por RNA) Composto A (substrato) Composto B (produto) Centro ativo ou sítio catalítico de uma enzima é a porção da molécula onde ocorre a atividade catalítica. Observe que não há consumo ou modificação permanente da enzima Reação catalisada pela enzima Enzimas Função: Catalizadores de reações químicas (aceleração das reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em diversas condições de temperatura e pH) Enzimas + + Enzima holozima Apoenzima parte proteica Parte Não proteica (cofator) metal coenzima . Enzimas apoenzima holoenzima Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação grupo prostético Enzimas Classificação das Enzimas Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Urease – hidrolisa a uréia DNA-polimerase – polimeriza DNA Agora…. Nomenclatura oficial das enzimas é dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - é uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contém fosfato..........3.6.1 - esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3 1. Óxido-redutases ( Reações de óxido- redução). Transferência de elétrons Se uma molécula se reduz, há outra que se oxida. 2. Transferases (Transferência de grupos funcionais) •grupos aldeído •gupos acila •grupos glucosil •grupos fosfatos (quinases) 3. Hidrolases (Reações de hidrólise) •Transformam polímeros em monômeros. Atuam sobre: •Ligações éster •Ligações glicosídicas •Ligações peptídicas •Ligações C-N 4. Liases (Adição a ligações duplas) •Entre C e C •Entre C e O •Entre C e N 5. Isomerases (Reações de isomerização) 6. Ligases (Formação de laços covalentes com gasto de ATP) •Entre C e O •Entre C e S •Entre C e N •Entre C e C enzima sítio ativo (catalítico) substrato Como as enzimas funcionam... Como as enzimas funcionam... Como as enzimas funcionam... como a reação progride mudança de energia durante a reação variação de energia livre padrão (bioquímica) energias de ativação Como as enzimas funcionam... ... e não aqui! É aqui que as enzimas agem!!! Como as enzimas funcionam... energia de ativação SEM catalizador energia de ativação COM catalizador Como as enzimas funcionam... intermediários da reação Como as enzimas funcionam... passo limitante da reação Como as enzimas funcionam... Enzimas + + A energia de ativação é monstruosa!!! Enzimas acelaram reações várias ordens de grandeza Enzima Velocidade na ausência de enzima “Reações/segundo” Velocidade da reação catalisada “Reações/segundo” Poder catalítico Anidrase carbônica Triosefosfato isomerase Carboxipeptidase A AMP nucleosidase Nuclease de estafilococos 1.3 X 10 –1 4.3 X 10 –6 3.0 X 10 –9 1.0 X 10 –11 1.7 X 10 -13 1.0 X 106 4.300 578 60 95 7.7 X 106 1.0 X 109 1.9X 1011 6.0 X 1012 5.6 X 1014 Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa o ciclo da reação em um segundo Compare esses números ! moles de S catalisado por segundo moles de enzima Número de turnover = Como as Enzimas Funcionam... enzima sítio ativo (catalítico) substrato formação de ligações covalentes transientes com o substrato! Como as Enzimas Funcionam... Intermediário ES (E e S ligados covalentemente) energia de ligação Maior fonte de energia livre usada por enzimas para abaixar as energias de ativação das reações Como as enzimas funcionam... Como as Enzimas Funcionam... enzima sítio ativo (catalítico) substrato formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES! sítio de ligação Como as Enzimas Funcionam... Como as Enzimas Funcionam... + formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES! Modelo chave-fechadura Nesse modelo, o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela. Modelo de encaixe induzido Nesse modelo, o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacio-nais na enzima, que otimizam as intera-ções com os resíduos do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje em dia. Modelo Chave-Fechadura Modelo de encaixe induzido Como as Enzimas Funcionam... Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase) Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A. Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270. A B Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase) Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A. Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270. Como as Enzimas Funcionam... Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais – abordagem central para estudar o mecanismo de reações catalisadas por enzimas. Cinética Enzimática Uma abordagem à compressão do mecanismo Equação de Michaelis-Menten: Cinética Enzimática V0 = Vmax [S] Km + [S] Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar como a concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação . V0 = Vmax [S] Km + [S] Para se chegar à equação da hipérbole do gráfico V x S… [S] muda com o passar do tempo em uma reação enzimática in vitro. E daí? Cinética Enzimática tempo [S ] 1 2 3 4 5 6 Cinética Enzimática [S] [E] Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é mínima durante o estágio inicial da reação. tempo [S ] 15 30 45 60 É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0) Cinética Enzimática Praticamente linear; ou seja, quanto mais substrato, maior a V0 Cinética Enzimática Saturação! Não adianta adicionar substrato, a V0 não muda significativamente. [S] [E], portanto [ES] é favorecido Cinética Enzimática [S] [E], portanto [E] é favorecido [S] [E], portanto [ES]é favorecido Cinética Enzimática [S] [E], portanto [E] é favorecido Cinética Enzimática Cinética Enzimática y = m . x + b equação de reta Cinética Enzimática Cinética Enzimática Cinética Enzimática Km = k-1 = Kd k1 Nesta condição, Km mede a afinidade da enzima pelo substrato Interação Proteína-Ligante concentração do ligante porcentagem dos sítios de ligação ocupados concentração constante da proteína Cinética Enzimática kcat descreve a taxa do passo limitante da reação equivalente ao número de moléculas de substrato convertidas a produto em uma unidade de tempo em uma molécula de enzima, quando a enzima está saturada com substrato Cinética Enzimática moles de S catalisado por segundo moles de enzima Número de turnover = Eficiência catalítica Kcat/Km - Parâmetro mais adequado para comparações cinéticas Condições do meio que afetam estabilidade protéica • pH • temperatura % a ti v id a d e e n z im á ti c a m á x im a pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9 O pH ótimo de uma enzima reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do sítio ativo. Fatores que afetam a atividade enzimática 1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas • Variações de pH: pH ótimo • Variações de temperatura: temperatura ótima 100- 50- 0- % a ti v id a d e e n z im á ti c a m á x im a Temperatura ótima Desnaturação térmica da proteína Pouca energia para a reação acontecer Ao contrário da curva em forma de sino no caso da atividade enzimática versus pH, a enzima só está desnaturada em temperaturas acima da temperatura ótima. Fatores que afetam a atividade enzimática Disciplina de Bioquímica Estrutural Curso de Biologia Próxima aula: Enzimas (continuação)
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