Trabalho de Histologia

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Universidade Federal de Sergipe
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Departamento de Morfologia
Curso de Farmácia
Técnicas Histológicas
Trabalho apresentado à disciplina de Histologia, curso de Farmácia, 2009/1, na Universidade Federal de Sergipe, UFS.
Por: Antonio Marques Filho
São Cristóvão
2009 
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO..............................................................................................................02
MICROSCOPIA.............................................................................................................03
 Microscopia Óptica.........................................................................................03
 Microscopia Elétrica.......................................................................................05
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS.......................................................................................08
 Confecção de lâminas histológicas.................................................................08
 Coleta do material...........................................................................................08
 Fixação...........................................................................................................08
 Inclusão..........................................................................................................09
 Microtomia....................................................................................................09
 Montagem das lâminas histológicas..............................................................10
Técnica de Criomicrotomia (= microtomia por congelamento).....................................10
Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos..............................................................10
Técnicas Utilizadas para Confecção de Lâminas Ósseas...............................................13
Técnicas histoquímicas...................................................................................................14
Técnica da contrastação (microscopia eletrônica)..........................................................14
Técnica de imuno-histoquímica......................................................................................15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................16
INTRODUÇÃO
A Histologia é o estudo da estrutura do material biológico e das maneiras como os seus componentes se inter-relacionam, tanto estrutural quanto funcionalmente. O estudo da histologia se iniciou com o desenvolvimento de microscópios simples e de técnicas para preparo de material biológico, tornando-o adequado para exame.
Os primeiros histologistas descobriram muito sobre a estrutura do material biológico, estabelecendo a teoria celular da estrutura dos organismos vivos, onde a célula é a unidade básica da arquitetura da maioria dos materiais biológicos.
A histologia nasceu com os primeiros estudiosos que se utilizaram do microscópio: Robert. Hook, Malpighi, Graw, Ham, Fontana e outros, muito antes que Meyer (1819) desse esse nome à ciência que descreve os tecidos animais e vegetais.
A noção de "tecido" foi, contudo, introduzida por Xavier Bichat sem que este anatomista se tivesse utilizado do microscópio. A anatomia estuda os tecidos, isto é, as agregações de células que têm a mesma forma e a mesma função.
Uma particular especialização da histologia é a citologia, considerada a ciência das células. Estuda ela a célula em si, a qual constitui, em definitivo, a base das ciências biológicas, porque a célula é o elemento fundamental de todos os seres vivos.
Citologia e histologia não estudam somente a estrutura da célula e dos tecidos, mas também as relações entre a estrutura e a função, e, portanto, se integram com a fisiologia, com a física e com a química.
MICROSCOPIA
As técnicas e os métodos empregues no estudo da célula têm evoluído e diversificado desde a invenção do microscópio, no séc. XVII, por Antoine Leeuwenhoek e Robert Hook, antes mesmo, aliás, de ter sido estabelecido o conceito de célula. Foi, com efeito, através da exploração das potencialidades deste recém inventado aparelho óptico que diversos naturalistas convergiram para a concepção de que todos os seres vivos, plantas e animais, são constituídos por unidades morfológicas e funcionais, que designaram por células.
O estudo de preparações citológicas ou histológicas exige sistemas de observação adequados, que permitem observar as estruturas. Para essa finalidade o aparelho mais comumente usado é o microscópio óptico que utiliza a luz transmitida. Já o microscópio eletrônico, que utiliza elétrons ao invés de feixes luminosos, é o aparelho mais para estudos de ultra-estrutura.
Os métodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos baseiam-se principalmente no estudo das estruturas e processos celulares sob as microscopias de luz (ML) e eletrônica (ME), permitindo o reconhecimento da célula como um componente dinâmico e participante do metabolismo corporal. Basicamente, estes estudos utilizam como ferramentas, lâminas com colorações histológicas e histoquímicas, para o estudo à microscopia de luz e telas de cobre contrastadas por metais pesados, para o estudo à microscopia elétrica (de transmissão, de varredura, etc.).
Para se usar o microscópio com eficiência é preciso que ele seja manipulado de modo a reder o máximo de sua capacidade resolutiva, isto é que produza a imagem mais nítida possível.
Microscopia Óptica
À microscopia óptica, mais propriamente designada por microscopia fotónica, seguiu-se a invenção de outras microscopias, nomeadamente da microscopia eletrônica, e de técnicas complementares, como a Histologia, que permitiram prosseguir e aprofundar o estudo da arquitetura estrutural da célula quase até ao nível macromolecular. 
O microscópio fotónico comum, também designado por microscópio de câmara clara, é um sistema óptico capaz de fornecer, de um objeto, uma imagem ampliada, permitindo a observação de detalhes invisíveis a olho nu.
 É constituído basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular. A objetiva dá do objeto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida. 
A ampliação da objetiva, Aob, é dada pela fórmula:
Aob = A’B’/AB
A ampliação é uma das características ópticas essenciais da objetiva. A ocular, por sua vez, fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, através do cristalino, se projeta na retina do globo ocular. A ampliação da ocular é função da distância focal (foc) em milímetros: 
Aoc = 250/foc
Entre outras, destacam-se, nos microscópios, três características principais: a ampliação, a abertura numérica e o poder de resolução.
Simultaneamente, foram surgindo outras técnicas analíticas, umas que fracionam a célula permitindo isolar por centrifugação alguns dos seus componentes; outras que descem ao nível molecular e perscrutam a composição e o funcionamento da maquinaria química subjacente à vida.
Microscópio fotónico e esquema óptico de formação de imagem
Microscopia Elétrica
O desenvolvimento concomitante da microscopia eletrônica e da melhoria nas técnicas de preparação dos tecidos ampliaram consideravelmente o campo de estudo da histologia, pois o microscópio eletrônico é aproximadamente 1000 vezes mais poderoso que o microscópio óptico.
Existem vários tipos de microscópios eletrônicos. Nos reteremos a descrição do microscópio eletrônico de transmissão (MET) e do microscópio eletrônico de varredura (MEV). 
A diferença básica entre as duas modalidades de microscopia, consiste no fato de na primeira, a imagem ser produzida por fótons e na segunda,por elétrons. Daí decorrem necessariamente, conseqüências, quer a nível de concepção física dos aparelhos, quer a nível da preparação do material, quer a nível da natureza da imagem e ou ainda da performance da técnica.
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
O alto poder de resolução do microscópio eletrônico de transmissão, juntamente com o grande aumento, permitem a obtenção de imagens com uma grande riqueza de detalhes.
 
As imagens no microscópio eletrônico de transmissão são formadas pela excitação de uma tela fluorescente ou um filme fotográfico por elétrons. Esses elétrons são produzidos graças ao aquecimento de um filamento no vácuo. Essas partículas são aceleradas devido a uma diferença de potencial de 60 a 100 Kv existentes entre o cátodo e o ânodo. Esse feixe é defletido por lentes eletromagnéticas, de maneira parecida ao que acontece com a luz no microscópio óptico. O condensador focaliza o feixe de elétrons no plano do objeto, e a objetiva forma sua imagem. Esta imagem é ainda ampliada por uma ou duas lentes que a projetam numa tela fluorescente ou filme fotográfico.
A espessura dos cortes precisa estar entre 20 a 100 nm. Para isso, desenvolveram-se métodos especiais de microtomia, que consistem em fixar os tecidos em aldeído glutárico e tetróxido de ósmio, desidratar e incluir em resinas duras a base de Epóxi, como, por exemplo, as resinas Epon e Araldite.
Os cortes são feitos em ultramicrótomos, nos quais são usados navalhas de vidro ou diamante. 
Trajeto dos elétrons (em amarelo) no microscópio eletrônico de transmissão
Então, simplificadamente, o funcionamento do microscópio eletrônico de transmissão se baseia na propriedade que as estruturas têm de desviar ou deixar passar por si os elétrons.
 As estruturas que desviam os elétrons são chamadas de elétrons densas e aparecem escuras na imagem, já que os elétrons não chegam até a tela fluorescente. Já as estruturas que são atravessadas pelos elétrons (elétron lúcidas) aparecem claras na imagem, pois os elétrons que incidiram sobre a estrutura conseguem excitar a tela fluorescente ou o filme fotográfico que fica abaixo do corte.
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
No microscópio eletrônico de varredura a imagem é formada por elétrons refletidos sobre o objeto. Entre a lente eletromagnética e o objeto, é interposta uma bobina de varredura que provoca um desvio do feixe de elétrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobre o objeto ponto a ponto, numa seqüência determinada. 
O objeto não se deixa atravessar pelo feixe devido sua espessura e a uma película feita por um jato de material refletor, como ouro, por exemplo. Desse modo, o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (chamado feixe primário) sofre reflexões originando elétrons secundários, que são captados por detectores especiais, que geram um sinal elétrico transferido para um monitor de vídeo, formando uma imagem tridimensional da superfície da estrutura.
Trajeto dos elétrons no microscópio eletrônico de varrimento
 	
Microscópio eletrônico de varrimento
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
A correta observação do material biológico, em microscopia óptica, implica uma série de procedimentos técnicos prévios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamente por técnicas histológicas.
A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.
Muitas são as técnicas utilizadas em histologia. Algumas técnicas freqüentemente são utilizadas em rotinas de laboratórios que proporcionam a visualização das microestruturas dos tecidos.
Confecção de Lâminas Histológicas
Para a análise sob microscopia óptica é necessária a confecção de lâminas delgadas dos tecidos que formam os órgãos. Estas lâminas podem ser permanentes ou provisórias.
Coleta do Material 
Partes de órgãos são retiradas com o auxílio de um bisturi, pinça ou lâmina de barbear. Não é indicada a extração de porções grandes, uma vez que o objetivo final é a obtenção de uma camada fina que possa ser analisada em um microscópio óptico.
Fixação do material
Esta etapa consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para suportar as demais etapas. Além disso, os fixadores retardam os efeitos pos-mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal. 
Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin. Ambos fixam as proteínas evitando sua degradação.
O formol, por ser mais acessível e de uso simples, é o fixador mais utilizado nas técnicas histológicas. Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios. Por essa razão é recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).
O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h. É recomendado que, sempre que possível, não ultrapasse a 3 mm de espessura.
Inclusão
Este procedimento consiste na impregnação do tecido com uma substância de consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-lo em camadas delgadas. Pelo fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste procedimento. Como ela não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a desidratação, quando ocorre a retirada da água dos tecidos e a sua substituição por álcool.
 A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos, por xilol. Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60° em pequenos blocos. Neste momento a catalogação do bloco é importante para a posterior identificação da peça.
Microtomia
Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrótomo para obter cortes
sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peças incluídas. Este aparelho é formado por uma lâmina (fixa ou descartável) de aço, afiada, e um braço ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.
Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte
É difícil obter cortes abaixo de 3 a 4 micrômetros de espessura dos materiais incluídos em parafina. De um modo geral, são obtidos cortes entre 5 e 7 micrômetros.
Montagem das lâminas histológicas
As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas para um banho-maria, com o auxílio de uma pinça, para serem distendidas (Fig. 1 B). A água deve estar entre 3° e 8º abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada.
Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Após a distensão, os cortes são separados individualmente ou em grupos, conforme a conveniência, utilizando se lâminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em álcool 80% e previamente secas. Antes da utilização das lâminas, é necessário revestir suas superfícies com uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça.
Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60º para secagem entre uma e 24 horas.
Técnica de Criomicrotomia (= Microtomia por Congelamento)
A técnica descrita acima, sem dúvida, é a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, esta técnica é contra-indicada, como, por exemplo, no estudo da distribuição dos lipídios, em técnicas histoquímicas avançadas ou quando são necessários cortes urgentes, como em exames patológicos. Nestes casos, os tecidos são endurecidos através do congelamento. Os aparelhos utilizadospara os cortes podem ser de dois tipos: micrótomos de congelamento ou criostatos (Junqueira e Junqueira, 1983).
O criostato é um aparelho mais aperfeiçoado que o anterior. Permite a obtenção de cortes muito mais finos de tecidos não fixados (até dois micrômetros), facilitando a visualização das células (Junqueira e Junqueira, 1983).
Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos
A coloração consiste numa etapa muito importante para a visualização das estruturas do tecido. Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessário, deste modo, a remoção da parafina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lâmina de vidro. 
Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em três classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):
Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das células;
Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular;
Sais metálicos que precipitam nos tecidos.
Os corantes mais utilizados nos procedimentos histológicos são a Hematoxilina e a Eosina (HE). 
A Hematoxilina é uma base que cora, preferencialmente, componentes ácidos das células em um tom azulado escuro. Como os componentes ácidos mais abundantes são o DNA e o RNA, tanto o núcleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes são chamados de basófilos. 
A Eosina, ao contrário, é um ácido que cora as estruturas básicas da célula de rosa. Estas estruturas são abundantes no citoplasma e são chamadas de acidófilas (Gartner e Hiatt, 1999).
 Outros corantes são também utilizados em procedimentos de rotina em laboratórios, tais como (Gartner e Hiatt, 1999):
Tricrômico de Masson - cora o núcleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o músculo de vermelho e o mucigênio e o colágeno de azul claro;
Orceína - cora as fibras elásticas de marrom;
Weigert - cora as fibras elásticas de azul;
Prata - cora as fibras reticulares de preto;
Hematoxilina férrica - cora as estriações dos músculos, os núcleos e os eritrócitos de preto;
Ácido periódico reativo de Schiff – cora as moléculas ricas em glicogênio e carboidrato de magenta;
Wright e Giemsa - especializado em células sangüíneas, cora de rosa os eritrócitos e os grânulos eosinófilos, de púrpura o núcleo dos leucócitos e grânulos basófilos e de azul o citoplasma dos monócitos e dos linfócitos.
 Para corar peças incluídas em parafina é necessária a retirada da parafina e a hidratação da peça.
 Este procedimento é realizado a partir de uma seqüência de banhos em xilol, álcool e água, inversamente ao procedimento executado na etapa de inclusão.
Após a hidratação, os cortes são corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a análise que será realizada posteriormente.
Aqui serão abordadas as etapas do método da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e por ter um resultado final satisfatório.
Técnica da hematoxilina-eosina (HE)
a) Material necessário para a solução de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira, 1983):
- Hematoxilina ______________________ 2,5g
- Álcool 100% _____________________ 25ml
- Alúmen de amônio ou potássio ______ 50g
- Água destilada ___________________ 500ml
- Óxido vermelho de mercúrio _______ 1,25g
- Ácido acético _____________________ 20ml
Inicialmente, a Hematoxilina deve ser dissolvida no álcool e o alúmen na água destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas soluções devem ser misturadas e aquecidas até a fervura.
O óxido de mercúrio é adicionado à solução que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em água fria. O ácido acético é então colocado na solução fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta solução é entre dois e três meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e não reage adequadamente com o tecido.
b) Material necessário para a Eosina (Junqueira e Junqueira, 1983):
- Eosina solúvel em água _______________ 1g
- Água destilada ___________________ 100ml
c) Procedimentos para a coloração:
Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das soluções dos corantes. Deste modo, poderá ser observada nas etapas abaixo uma variação muito grande em relação ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratório. 
De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas são:
1º) desparafinar e hidratar os cortes;
2º) corar em hematoxilina entre 5 e 15min;
3º) lavar em água corrente por 10min;
4º) corar em eosina entre 1 e 10min;
5º) lavar em água e desidratar em álcool 70% rapidamente;
6º) diafanizar e montar em resina.
d) Montagem Final da Lâmina:
Este processo consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre o corte que está aderido à lâmina de vidro e cobri-lo com uma lamínula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocação da lamínula. Finalmente a lâmina é catalogada. 
A resina depois de seca garantirá uma lâmina permanente que poderá durar anos.
Técnicas Utilizadas para Confecção de Lâminas Ósseas
Para a confecção de lâminas ósseas são utilizadas duas técnicas: a primeira consiste no desgaste do osso através do polimento com lixa.
Confecção de lâminas ósseas por desgaste
Inicialmente, é retirado um fragmento do osso a ser analisado. Esse fragmento é colado com bálsamo do Canadá sobre uma superfície de madeira plana. Em um bloco de madeira é colada uma lixa de granulometria grossa para o primeiro polimento. 
O polimento final é feito com uma lixa mais fina, com movimentos firmes e no mesmo sentido, até que se tenha obtido uma camada de osso delgada. O osso é retirado da madeira com xilol e aderido à superfície da lâmina de vidro. Sobre ele é colocada uma lamínula e fixada com resina (Amaral et al. 1994; Timm, 1996 a, b). 
Confecção de lâminas ósseas por descalcificação 
A segunda técnica implica na descalcificação do osso.
Este procedimento tem por objetivo retirar o fosfato de cálcio do tecido ósseo para que possa ser seccionado posteriormente. A descalcificação pode ser feita através da imersão em ácidos ou compostos quelantes. 
Os quelantes capturam os íons metálicos (entre os quais o cálcio), removendo-os dos tecidos com um mínimo de alteração. Embora de ação mais lenta, agridem menos o tecido, e são mais utilizados nos procedimentos histológicos.
Após a fixação, o material é lavado para retirar o excesso de fixador e transferido para um descalcificador. Não é recomendado utilizar fragmentos maiores do que 3 mm de diâmetro. Devem-se usar, no mínimo, 40 vezes o volume do tecido, agitando o frasco várias vezes ao dia e trocando o descalcificador a cada 2 ou 3 dias. 
Os tecidos descalcificados não devem ser transferidos diretamente ao álcool 70%, e sim, lavados em água corrente por algumas horas.
Para a confecção das lâminas histológicas de ossos descalcificados seguem-se as etapas rotineiras citadas anteriormente.
Técnicas Histoquímicas
A histoquímica é uma técnica histológica que tem por objetivo a identificação da natureza química de constituintes celulares.
 Consiste na coloração específica desses constituintes, recorrendo basicamente a substâncias que, reagindo com os componentes celulares, dão origem a produtos corados.
Esta técnica contrasta com a coloração histológica comum, acima referida, na medida em que esta última se baseia na absorção, pelas estruturas, de substâncias coradas (os corantes), enquanto que na histoquímica, as cores são propriedades de produtos que se formam in sito.
Um dos exemplos clássicos é o método de Feulgen que se destina a identificar o DNA. 
O princípio da reação baseia-se no fato de que o DNA, após hidrólise ácida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff , dar lugar à formação de um produto que se cora em vermelho arroxeado.
São processos de coloraçãoque conferem especificidade, pois expõem os grupamentos e radicais químicos que compõem as estruturas, para que os mesmos sejam especificamente evidenciados pelos corantes histoquímicos. 
Ex: carboidratos, ácidos nucléicos, aminoácidos, íons, lipídeos, etc.
 
- Localização de ácidos nucléicos: método de Feulgen. 
- Localização de carboidratos: técnica do PAS (Periodic Acid-Schiff). 
Técnica da Contrastação (Microscopia Eletrônica)
A microscopia eletrônica expõe estruturas que ao selecionar a passagem de elétrons pelas mesmas, tornam-se elétron-densas ou elétron-lúcidas.
 São duas as substâncias contrastantes mais usualmente aplicadas para a microscopia eletrônica: o acetato de uranila e o citrato de chumbo. 
Técnica de Imuno-Histoquímica (IHC)
As técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) detectam moléculas (antígenos) teciduais, sendo de grande valor nos diagnósticos anátomo-patológicos e na investigação científica. O mecanismo básico é o reconhecimento do antígeno por um anticorpo (Ac primário) associado a diversos tipos de processos de visualização. 
Atualmente há disponibilidade de grande número de anticorpos para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina, permitindo o estudo de blocos arquivados por longos períodos. 
A técnica de IHQ mais usada é a indireta, associada ao complexo avidina-biotina-enzima. O complexo é formado pela ligação de uma molécula de (strept) avidina com várias de biotina associadas a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como função a conversão de um cromógeno incolor em um produto final que pode conferir diversas cores aos antígenos teciduais marcados. As cores mais comuns são a castanha (peroxidase+ diaminobenzidina-DAB) e a vermelha (fosfatase alcalina + fast red).
Indicações:
Em diversos casos é necessário utilizar o exame imuno-histoquímico, procedimento sensível de detecção molecular que pode auxiliar no diagnóstico de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplasias, ou ainda fornecer dados mais precisos e individualizados sobre o melhor tratamento e provável evolução do câncer. 
A imuno-histoquímica pode auxiliar em diversas situações, tais como: 
- Diagnóstico de tumores indiferenciados;
- Diagnóstico diferencial entre tumores e estados reacionais;
- Diagnóstico de diversas doenças infecciosas;
- Determinação de fatores preditivos de neoplasias;
- Determinação de fatores prognósticos de neoplasias;
- Determinação / sugestão de sítio primário de adenocarcinoma;
- Determinação de tipo / subtipo de linfomas e leucemias.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995.
JUNQUEIRA, Luis Carlos U.; JUNQUEIRA, Luiza Maria M. S. Técnicas básicas de citologia e histologia. São Paulo: Santos, 1983.
STEVENS, Alan; LOWE, James. Histologia. São Paulo: Manole, 1995.
BECAK, Willy. JORGE PAULETE. Técnicas de citologia e histologia. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1976.
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