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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Departamento de Química Disciplina de Bioquímica I Estudo dirigido enzimas Prof. Lilia Bender Enzimas são proteínas ou RNA com atividade catalítica, isto é, aceleram velocidade de reações químicas. Sem estas moléculas não existiria vida. Além das enzimas necessárias para o metabolismo e seu controle, podemos destacar algumas de importância industrial e, conseqüentemente de grande valor econômico. Por exemplo, a amilase, altamente utilizada na industria têxtil para deixar a calça jeans mais “lisa”. Temos ainda a “limpolase”, presentes no abão em pó (apesar do sufixo ase designar enzimas, trata-se apenas de um nome fantasioso, já que não existem enzimas especializadas na limpeza). Na verdade a limpolase é um coquetel de enzimas, envolvendo um conjunto de proteases (enzimas que quebram proteínas), lípases (enzimas que degradam lipídeos) e amilases (enzimas que quebram carboidratos complexos, como o amido). Desta maneira podemos limpar praticamente qualquer tipo de mancha, sangue, gordura, graxa, etc.... Outras enzimas apresentam grande interesse médico. Como por exemplo enzimas exclusivas de alguns vírus, que possibilitam o desenvolvimento de drogas altamente seletivas. Talvez o exemplo mais importante seja a Transcriptase Reversa do Vírus HIV. Hoje, diferentes drogas são empregadas na tentativa de bloquear a atividade desta enzima, como o AZT, Nevirapine e Enfavirez. No entanto, a possibilidade do surgimento de cepas (variante de HIV) resistentes a estas drogas e o efeito colateral destes compostos torna a busca de moléculas antivirais mais seletivas extremamente necessária. Sendo assim, grupos multidisciplinares, envolvendo químicos, biólogos, médicos, agrônomos, políticos etc. buscam através de novos produtos naturais de plantas, algas e cianobactérias da flora brasileira novas substancias bem sucedida para este propósito. Atualmente, encontram-se em fase de testes clínicos algumas substancias naturais de ervas chinesas, moléculas proveniente de veneno de cobra e até mesmo derivado do sangue dos Dragões de Cômodo Na figura 1 podemos observar a estrutura da transcriptase reversa. Observando esta enzima podemos concluir que a sua estrutura protéica é 1ária, 2,ária 3 áriaou 4 ária Reconheça também as estruturas secundárias que compõe esta enzima. Figura 1 – Estrutura da Transcriptase Reversa do HIV formada pelo heterodímero p66 e p51. Já nas figuras 2, 3 e 4 podemos notar a atividade enzimática na presença ou na ausência de Uréia (agente desnaturante), de diferentes pHs e de diferentes temperaturas. Explique o que está acontecendo! Figura 2 – TR- somente a enzima, TR+UREIA – enzima maiso agente desnaturante. Figura 3 – Atividade da TR em diferentes pHs Figura 4 – Atividade da TR em diferentes temperaturas. Na natureza a enzima TR apresenta os seguintes substratos: o primeiro, é o Templete/primer, que consiste de uma mistura da RNA viral (templete) e RNAtLys(primer); e as bases que compõe o DNA(dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Experimentalmente, utilizamos apenas dois substratos, o Templete/primer e [3H]-dTTP. Podemos, então, induzir uma cinética de primeira ordem para a captação de [3H]-dTTP se colocarmos o Templete/primer sobre condições saturantes. Sob estas condições experimentais, e sob as condições de ótimas de temperatura e pH. Resolvemos testar o efeito de diferentes drogas. Na tabela abaixo apresentamos diferentes elocidades iniciais, na ausência e na presença de diferentes inibidores. Identifique os valores de Km e Vmax (com suas respectivas unidades). Além disso, trace os gráficos de duplo-reciprocos (urk) e, a partir da equação: E + S ES E + P, proponha o mecanismo de ação dos inibidores. Velocidades Iniciais (pmol/min/mg) dTTP [M] Controle AZT Nevirapine Hupcl Qupcl 1 98 25 67 90 89 3 200 55 100 110 107 6 250 81 134 145 120 9 298 100 198 180 199 18 315 125 204 187 240 36 400 200 200 178 239 50 401 201 203 180 241 Compare as estruturas dos compostos com o substrato dTTP. Faça a correlação entre grau de analogia ao substrato e tipo de inibidor. Apenas com base no gráfico de Michaelis Menten é possível determinar o tipo de inibidor Aparentemente o inibidor Neirapine se liga no aminoácido numero 235 da cadeia p66, uma histidina. Isto somente ocorre porque a histidina em pH fisiológico apresenta carga positiva em seu grupamento R. Para testarmos a importância deste aminoácido duas metodologias diferentes foram empregadas. Sabendo que o pKr da hisidina é em torno de 6,7. Incubou-se a TR na presença ou na ausência de Nevirapine em pH 6.5 e pH 8. Explique porque os autores utilizaram esta abordagem e qual a interpretação da figura abaixo. Para seguir nossos verificações foi realizado mutações na cadeia p66, ou seja em uma proteína o resíduo de histidina, da posição 235, foi trocado por um resídio N (o qual não possui carga) e noutra o resíduo de histidina, da posição 235, foi trocado por um resídio E (o qual possui carga negativa). Qual conclusão final. Outros exercícos para fixação do assunto abordado em sala de aula. 1.A aspirina é um ácido fraco com pKa = 3,5 (H ionizável em negrito). Ela é absorvida pela corrente sanguínea através das células do estômago e do intestino. Essa absorção requer que a aspirina passe através das membranas celulares. Sabendo-se que o pH no estômago é 1,5 e no intestino é cerca de 6, em qual desses compartimentos deve ocorrer maior absorção de aspirina? Explique. 2. Os anestésicos locais usados na clínica são derivados da cocaína. A cocaína é um alcalóide, éster benzóico obtido das folhas de coca, que tem uma amina terciária protonável. Sabendo-se que o seu pK é 8,0 faça a curva de titulação da cocaína, indicando em que valores de pH ela está mais solúvel em água e em que valores de pH está mais solúvel em solventes orgânicos. EXPLIQUE. Acima encontra-se parte da molécula da cocaína. 3. Desenhe a estrutura primária do seguinte peptídeo: Glu-Ala-Lis-Leu Represente as porções amino terminal e carboxi terminal em soluções de pH 1 e pH 13. Indique a estrutura de cada aminoácido nos seus respectivos pkas e pI. Glu – Pk1-2,10 PK2- 9,13 PKr – 3,65 Lis – Pk1-2,18 PK2- 8,95 PKr – 10,53 Ala – Pk1-2,35 PK2- 9,87 Leu – Pk1-2,33 PK2- 9,74 8 H O C 3 H O O C C O
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