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05/04/2014 1 Cultura de Células Claudia Mermelstein Diferentes tipos celulares podem crescer em cultura fibroblastos mioblastos oligodendrócitos A maioria das células se encontam em tecidos aderidas à outras células e à MEC Tecido muscular esquelético corado com hematoxilina/eosina Fibras em corte transversal Fibras em sentido longitudinal Adesões celulares O isolamento das células é a primeira etapa da cultura isolamento mecânico: tesouras, pinças, facas e bisturis isolamento enzimático: tripsina, quimiotripsina, ou colagenase para separar as células da MEC e as células entre si Isolamento por quelantes de íons divalentes (Ca e Mg): EDTA e EGTA para separar as adesões célula-célula e as adesões célula-MEC Junções celulares 05/04/2014 2 Adesões célula-célula: moléculas dependentes de cálcio como as caderinas Adesão célula-MEC Como separar um só tipo celular de um tecido que contém vários tipos celulares? • Células de diferentes tamanhos e/ou densidades podem ser separadas através de centrifugações • Células com diferentes habilidades para aderir ao plástico da placa de cultura podem ser separadas com diferentes tempos de adesão Linhagens celulares A ATCC (American Type Culture Collection) vende mais de 3.400 linhagens celulares site da ATCC: http://www.atcc.org HeLa células epiteliais retiradas de um tumor cervical de uma mulher chamada Henrietta Lacks Esta célula HeLa foi a primeira célula humana a ser comercializada, e hoje existem mais células HeLa nos laboratórios do mundo do que a própria Henrietta Lacks tinha. Linhagens da ATCC Vantagens e desvantagens do uso de linhagens de células Vantagens: * praticidade comparada ao uso de animais * contém um só tipo celular e portanto as conclusões são mais diretas * reproducibilidade * questões éticas ligadas ao não uso de animais em pesquisa Desvantagens: * modelo afastado da situação “in vivo” * maiores chances de contaminações por microrganismos devido as tripsinizações e repiques infinitos 05/04/2014 3 Culturas primárias X linhagens celulares • Culturas primárias – são as preparadas diretamente a partir do animal de origem. São em geral semelhantes ao in vivo (ex: culturas de fibroblastos secretam colágeno). Só passam por até 40 ciclos de divisão celular e depois morrem. São, em geral, compostas por mais de um tipo celular. • Linhagens celulares – são células imortalizadas, ou seja, se dividem indefinidamente em cultura. São oriundas de tumores ou de células que foram transformadas com vírus. São compostas por um só tipo celular. Equipamentos de sala de cultura de células: fluxo laminar Equipamentos de sala de cultura de células: fluxo laminar Todos os materiais utilizados em cultura de células devem ser estéreis e/ou descartáveis tubos, pipetas, garrafas, placas, multiwell, filtros Etapas de uma cultura de células primárias isolamento mecânico e enzimático do tecido centrifugação das células plaqueamento das células tripsinização das células Meios e tampões utilizados em cultura de células São soluções quimicamente definidas e contém: amino-ácidos, vitaminas, sais minerais,... 05/04/2014 4 Composição de um meio de cultura de células de mamiferos Histórico de cultura de células Em 1955 Eagle estabelece os nutrientes básicos necessários para o crescimento em cultura de células de mamiferos: Nutrition Needs of Mammalian Cells in Tissue Culture Harry Eagle National Institutes of Health, Bethesda, MD Science, Volume 122, 1955, pages 501–504 Este meio básico é utilizado até hoje e é composto de: 13 amino-ácidos, várias vitaminas, sais, glicose e algumas proteínas presentes no soro Células normais param de crescer quando encostam em outras: inibição por contato célula normal célula cancerosa Células epiteliais polarizadas podem crescer em tipos especiais de culturas em que os meios de cultura apical e basolateral são diferentes Células em cultura podem ser submetidas a diferentes tipos de análise * transfecção de genes * microscopia óptica de contraste de fase * imunofluorescência * eletroforese * immunoblotting * microscopia eletrônica de transmissão e de varredura * isolamento de organelas através de centrifugações diferenciais
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