Eletroforese

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ELETROFORESE 2011
Características básicas;
O fluxo determinante;
Objetivos:
O fluxo determinante; 
Fatores envolvidos;
O ponto isoelétrico;
Tipos do eletroforese:Tipos do eletroforese: 
Eletroforese livre,
Eletroforese capilar, 
Eletroforese em suporte sólido,p ,
Eletroforese em suporte semi-sólido, 
Focalização isoelétrica, 
Eletroforese com SDS, 
Eletroforese bidimensional,
Eletroforese de alta voltagem,
Immunobloting, 
Iontoforese. 
Revelação;
Analise qualitativo e quantitativo;
ALPICAÇÕES PROCEDIMENTO EXPERIMENTALALPICAÇÕES e PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1
ELETROFORESE
DEFINIÇÃO:
Processo de separação e/ou caracterização de componentes de 
um sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, onde u s ste a, baseado a ca ga e ét ca e das pa t cu as, o de
ocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas a 
um campo elétrico.
PRINCÍPIO:
Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessário 
que possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons, 
resultando em carga elétrica livre.
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ELETROFORESE
A l t f é i l t útil ét d líti SA eletroforese é especialmente útil como método analítico. Sua
vantagem é que as proteínas podem ser separadas e visualizadas,
permitindo ao pesquisador determinar rapidamente o número de
espécies de proteínas presentes em ma mist ra o o gra de p re aespécies de proteínas presentes em uma mistura ou o grau de pureza
de uma preparação particular de proteínas.
A eletroforese permite também a determinação de propriedades
cruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e seu peso
molecular aproximadomolecular aproximado.
3
ELETROFORESE
Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólos de
carga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas positivamenteg p , p g p
migram para o pólo negativo (cátodo) e partículas carregadas
negativamente migram para o pólo positivo (ânodo).
Na eletroforese a força elétrica, Fel , que move a macromolécula (os 
ácidos nucléicos, e as proteínas também podem ser separados deste 
modo) é o potencial elétrico,  , vezes a carga líquida da molécula, q.
A f á i ã d lé l é f i ã F éA força que pára a migração da macromolécula é a fricção, Ff, que é 
proporcional da velocidade da partícula, V, vezes o coeficiente de fricção, 
ffr:
No caso do pólo elétrico constante as duas forças se balanceiam e aNo caso do pólo elétrico constante as duas forças se balanceiam e a 
molécula migra-se com a velocidade constante.
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Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.
  qCAuJ    xqCAuJ
A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é 
proporcional o valor da carga e o gradiente do potencial elétrico.
O fluxo como tudo, J, é proporcional da Carga, q,
d C t ã d lé l Cda Concentração das moléculas, C,
da Área através qual o fluxo atravessa, A,
d G di t d t i l lét i do Gradiente do potencial elétrico, , e 
da Mobilidade das moléculas, u. x

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FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO 
ELETROFORÉTICA:
A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétrico 
depende de vários fatores as mais importantes são:
 densidade de carga elétrica livre: densidade de carga elétrica livre:
principal fator, diretamente proporcional
 potencial elétrico aplicado: potencial elétrico aplicado:
diretamente proporcional, a voltagem aplicada deve ser adequada para 
separar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe os 
componentes. Voltagem muito alta, porém, aquece os sistema e prejudicacomponentes. Voltagem muito alta, porém, aquece os sistema e prejudica 
a separação
 raio da partícula: inversamente proporcionalp p p 
 viscosidade do meio: inversamente proporcional 
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FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃO 
ELETROFORÉTICA:
Outros fatores também influenciam na velocidade de migração:
 pH do meio (tampão); pH do meio (tampão);
 força iônica do tampão;
 interação com a fase fixa;
 tipo de suporte; tipo de suporte;
 grau de embebição (absorção) do suporte;
 temperatura;
Várias substâncias podem ser analisadas pela eletroforese, entre as 
principais, as proteínas e ácidos nucléicos.
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PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é valor do pH onde asPONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é valor do pH onde as 
cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem, não tendo 
carga elétrica efetiva e portando não migrando na presença de 
campo elétrico.p
Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuemExistem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuem 
outros grupos dissociáveis:
Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3),
Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil, (g p , p , ) g (g p g ,
pK=12,5).
As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamento 
múltiplo dos aminoácidos componentes.
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PONTO ISOELÉTRICO
Quase todas as proteínas possuíram o ponto isoelétrico exato, 
por exemplo:
Proteínas pI
Pepsina
Ovalbumina
Soroalbumina
Urease
-1.0
4.6
4.9
5 0Urease
-Lactoglobulina
Hemoglobina
Mioglobina
5.0
5.2
6.8
7.0
Quimotripsinogênio
Citocromo C
Lisozima
9.5
10.7
11.0
O ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela é = -1. 
Há uma coisa errada? 
9
As imunoglobulinas não possuem o ponto isoelétrico fixo. 
Faz pesquisa e descobri por que?
ESQUEMA DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEINAS SÉRICO PELO 
PONTAS ISOELETRICOS
pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3
Albumina
Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulinag g g
Alfa 2- globulina Beta - lipoproteína
Alfa lipoproteínaAlfa – lipoproteína
Memoriza os pontos isoelétricos das proteínas sérico. 
Para q e pólo elétrico elas ai migrar em pH 9? Em pH 4? E em pH 6?Para que pólo elétrico elas vai migrar em pH 9? Em pH 4? E em pH 6?
O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3. 
Há uma coisa errada?Há uma coisa errada? 
As imunoglobulinas todas não possuem o ponto isoelétrico fixo. 
Faz pesquisa e descobri por que? 10
MÉTODOS ELETROFORÉTICOS:
ELETROFORESE SEM SUPORTE: denominada eletroforese livre. 
Diagrama esquemático da célula de TiseliusDiagrama esquemático da célula de Tiselius 
para medir a mobilidade eletroforética pelo 
método do movimento de fronteiras.
No exemplo é mostradas duas diferentes espécies 
de proteínas carregadas negativamente comde proteínas carregadas negativamente, com 
diferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidas 
em solução tampão. Neste caso todas as 
proteínas migram para o ânodo. As mais rápidas 
assumem as fronteiras (1) tanto ascendenteassumem as fronteiras (1) tanto ascendente 
quanto descendente, ultrapassando, as mais 
lentas (2). Como resultado forma-se duas 
fronteiras em movimento ascendente e duas 
fronteiras em movimento descendente.
Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo em
forma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde a
maioria das proteínas tenha a mesma carga porém com densidade de carga e
fronteiras em movimento descendente.
maioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga e
mobilidade diversa. A partir da migração da proteína, formando uma frente. O índice de
refração nessa fronteira muda pela passagem das proteínas. Os movimentos de
convecção provocados pela dissipação do calor exigem aparelhos e instalaçõesg
especiais. É um método em desuso
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ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO
ELETROFORESE EM SUPORTE A l ã d t í é i bili d t i lid i ólidELETROFORESE EM SUPORTE: A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi - sólido 
(material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminando a convecção e os distúrbios de vibração, bem 
como diminuindo a difusão das substâncias, o que facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de 
maior resolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação a eletroforese livre. 
ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO: Os suportes sólidosmais usados são papel de filtro (EPF) e acetato de 
celulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagem com as proteínas migrantes nem 
ocasionam o seu retardamento. O acetato de celulose tem a vantagem sobre o papel de filtro de proporcionar melhor 
fracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, o que não é possível em papel, e maior 
rapidez na separação O processo de eletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados em zonasrapidez na separação. O processo de eletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados em zonas 
nítidas. A posição e quantidade das proteínas, pode ser avaliada por um densitômetro.
(a) Diagrama esquemático do instrumental utilizado A amostra é aplicada no centro do papel(a). Diagrama esquemático do instrumental utilizado. A amostra é aplicada no centro do papel 
previamente umedecida pela própria solução tampão. As extremidades do papel são mergulhadas na 
solução tampão, na qual os eletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico. 
(b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja que os íons positivos 
(cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativos em direção ao ânodo Moléculas com(cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativos em direção ao ânodo. Moléculas com 
carga resultante nula, permanecem no ponto de aplicação da amostra. 
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Os suportes semi -sólidos mais usados são os géis de agar, agarose e poliacrilamida. É 
possível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz pode p ç q p p
retardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares.
ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante ao 
descrito para eletroforese em acetato celulose Uma variação dessa técnica bastantedescrito para eletroforese em acetato celulose. Uma variação dessa técnica, bastante 
utilizada é a IMUNOELETROFORESE. Nessa técnica após a separação eletroforética da 
amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação para 
retirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados no p , p g (p p
gel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforética 
permite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedades 
eletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão) 
e pelas propriedades imunológicas (especificidade)e pelas propriedades imunológicas (especificidade).
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA). A eletroforese de proteínas 
é geralmente realizada em géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O g g p p
gel de poliacrilamida é um suporte que funciona com uma peneira molecular, 
promovendo a filtração da amostra pêlos poros do gel, reduzindo a velocidade de 
migração das proteínas em proporção aproximada à massa, ou peso molecular, de cada 
uma delas Nesse caso há associação da separação por carga e por peso molecularuma delas. Nesse caso há associação da separação por carga e por peso molecular. 
Nesse sistema proteínas com mesma carga e por peso moleculares ser separadas.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Aparelho e as Peças para eletroforese vertical
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
FORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização
A esquema do gel.A esquema do gel.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Procedimento esquemáticoProcedimento esquemático 
As amostras (misturas dasAs amostras (misturas das 
proteínas a ser analisadas 
estão colocadas com ajuda 
das micropipettas nosdas micropipettas nos 
poços (buracinhos) em um 
gel (1-3). O campo elétrico 
está aplicado (4) e as p ( )
proteínas migram com a 
velocidade diferente (5, 6) 
dependendo das cargas p g
elétricas livres e tamanho.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
EM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA
Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel
Há d i ti d l t l éE d l d fi Há dois tipos do gel: no topo o gel é com 
poros grandes e serve para concentrar as 
amostras; no baixo o gel é com poros 
menores e serve para separação as proteínas
Esquema do gel em camada fina
entre dois laminas de plástico ou de 
vidro com a aplicação da amostra e 
resolução das proteínas após da menores e serve para separação as proteínas 
ou outros componentes do analise.
resolução das proteínas após da 
revelação.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Revelação
As eletroforeses das amostras do soro do rato (revelado com o corante 
C i A) f õ d Alb i ( l d t b dCoomassie, A) e frações da Albumina (revelado com reagente na base da 
prata, C) no gel de poliacriamida.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
RevelaçãoRevelação
Visualização dos ácidos nucléicos
Com Luz UV Com corantes fluorescentes
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
RevelaçãoRevelação
Em LaboratorioEm Laboratorio
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
RevelaçãoRevelação
Não tocar a 
eletroforetograma 
com mãos vaicom mãos , vai 
sujar dela. 
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Eletroforese ácidos nucléicos
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Eletroforese as proteínas na presença do SDS
Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e do peso molecular de 
proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-se à maioria das proteínas, 
provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidades grosseiramente proporcionais ao pesoprovavelmente por interações hidrofóbicas em quantidades grosseiramente proporcionais ao peso 
molecular de cada proteína e, em geral, na proporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos 
de aminoácidos. O SDS ligado adiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando 
insignificantes as cargas intrínsecas da mesma.
[CH3-(CH2)n-CH2-O-SO3-] Na+
Dodecilsulfato de sódio (SDS)
A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga se a elas e a maioria adquire entãoA conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioria adquire, então, 
uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e, por esta razão, passa a Ter 
uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, a eletroforese na presença de SDS separa 
as proteínas quase exclusivamente na base de sua massa (peso molecular), com os polipeptídios 
menores migrando mais rapidamente Proteínas tratadas com SDS perdem a carga intrínseca emenores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadas com SDS, perdem a carga intrínseca e 
adquirem carga negativa constante em relação ao peso molecular. Sendo negativas, são atraídas pólo 
ânodo e a separação ocorre segundo o peso molecular. Por essa metodologia pode-se determinar o 
volume (massa aproximada) através da filtração pêlos poros do gel. As proteínas menores saem na 
frente o inverso da cromatografica por gel filtraçãofrente, o inverso da cromatografica por gel-filtração. 
23
Eletroforese as proteínas na presença do SDS
Depois de realizada a eletroforese as 
proteínas são visualizadas pela adição 
d t l dde um corante, como o azul de 
Coomassie, o qual se une às 
proteínas, porém não ao gel de 
poliacrilamida. Este tipo de gel fornece 
ét d it ium método para monitorizar os 
progressos sucessivos no isolamento 
de uma proteína, porque o número de 
bandas protéicas deve decrescer à 
did ifi ã tmedida que a purificação aumenta. 
Quando comparada com as posições 
para as quais as proteínas de peso 
molecular conhecido migram no gel, a 
i ã d t í d h idposição de uma proteína desconhecida 
poder fornecer uma excelente medida 
do seu peso molecular. Caso a proteína 
tenha duas ou mais subunidades 
dif t d b id d ádiferentes, cada subunidade será, em 
geral, separada pelo tratamento com o 
SDS e uma banda isolada aparecerá 
para cada uma delas.
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ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 
NA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA SDS)NAPRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).
Exemplo do gráfico padrão para 
determinação do peso molecular
Eletroforetograma
Descobre você mesmo o 
peso molecular a 
proteína desconhecida, 
que apresenta no faixa 2 
da Eletroforetograma. 
Etapas:
1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider); p ( p );
2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL); 
3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo do 
Peso Molecular das proteínas padrão; 
4 Utili d l d Rf d t í d h id d t i L it d P4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida determina o Logaritmo do Peso 
molecular dele e, a seguir, o Peso Molecular. 25
FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO. Teoria
A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o ponto 
isoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de 
eletroforese.eletroforese. 
Nesse método, inicialmente, um tipo de anfólitos (que uma mistura de 
ácidos e bases orgânicos, de pequeno peso molecular) está aplicado um 
s porte ( m gel) logo após aplicamos m campo elétrico no tempo c rtosuporte (um gel), logo após aplicamos um campo elétrico no tempo curto 
(pré-corrida) que faz distribui os anfolitos ao longo de um gel e estabelece 
um gradiente linear de pH no gel de poliacrilamida ou agarose. 
A i t d lé l1
Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos
A mistura das moléculas com o 
ponto isoelétrico diferente está 
aplicada (1). As moléculas se 
migram (2) até cada dela 
h l l l d
1
2
3
chega o local com o valor do 
pH igual ao pI dela (3). 
2
33
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO 
ResultadoResultado
Quando uma mistura protéica é colocada no 
gel de poliacrilamida ou agarose cada 
proteína migra para o cátodo ou anodo atéproteína migra para o cátodo ou anodo até 
atingir o pH, que é igual ao seu pI (pH 
isoelétrico), formado uma área estacionária. 
Assim proteínas com diferentes pontosAssim, proteínas com diferentes pontos 
isoelétricos distribuem-se de forma diferente 
ao longo do gel, formado uma área 
estacionária.estacionária.
A processo da revelação é similar ao 
processo utilizado na nossa aula pratica com 
papel da celulose como suporte sólido: p p p
corante revelador e solução descorante. 
A separação das moléculas 
em acordo com pontos 
isoelétricos delas. 27
Eletroforese bidimensional. O principio
Combinando dois métodosCombinando dois métodos 
eletroforéticos : 
a focalização isoelétrica (IEF) e 
a eletroforese na presença de SDS) 
em géis bidimensionais consegue-se 
l ã d i t ia resolução de misturas mais 
complexas de proteínas. Este método 
composto é mais sensível do que a 
focalização isoelétrica ou a eletroforesefocalização isoelétrica ou a eletroforese 
em SDS sozinhos. A eletroforese 
bidimensional separa as proteínas de 
peso molecular idêntico que diferempeso molecular idêntico, que diferem 
em ponto isoelétrico, ou proteínas com 
pI similar, porém pesos moleculares 
diferentesdiferentes. 
28
Eletroforese bidimensional. O principio
Combinando dois métodos 
eletroforéticos : 
a focalização isoelétrica (IEF) e 
a eletroforese na presença de SDS) 
em géis bidimensionais . 
A eletroforese bidimensional separa 
as proteínas de peso molecularas proteínas de peso molecular 
idêntico, que diferem em ponto 
isoelétrico, ou proteínas com pI 
similar, porém pesos moleculares , p p
diferentes. 
Revelado com o corante Coomassie.
29
Eletroforese bidimensionalEletroforese bidimensional
Revelação
Reagente da prata Corantes fluorescentesg p
A cada pontinha representa um proteína diferente. A intensidade 
da coloração indica a quantidade da proteínada coloração indica a quantidade da proteína.
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ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM
Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema para 
separação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas 
possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenospossam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenos 
polipeptídios. 
Fonte externo para eletroforese 31
“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico. 
32
“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico. 
33
Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos. 
34
Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.
D it d b bâ iDensitogramas = curvas de absorbância
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Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.
Densitogramas = curvas de absorbânciag
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Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analises 
eletroforeticos 
Agora que temos as densitogramas obtidos com a análise densitométrica das corridas eletroforéticas 
com ajuda dum densitometro, um pequeno problema se apresenta: Como podemos calcular as 
quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados apenas nas densitogramas ? 
Isto pode ser resolvido de duas formas.
Baseado na área do gráfico. Primeiro tem que traçar uma linha na base do gráfico ligando os pontos 
iniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemos 
utilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos x 
e y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como se 
usássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será 
a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar o 
ú áf Qnúmero de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido no 
gráfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a ele 
será atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas.
Outra possibilidade é aproxima o cada curva (pico) com uma ou mais figuras geométricas e calcula as 
á d l Á tó i id 100% Á d d i X%áreas delas. Área somatória assumida como 100%. Área de cada pico – X%.
Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura, 
podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-
t t btid (P t t l) f t t d áfi D i tse esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-se 
cada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa das 
proteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG.
U ã li f ã l ti d t í é i ti d d itUsar esse noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramas 
de eletroforese apresentados na pagina anterior.
37
Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.
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Eletroforese das proteínas séricas:Eletroforese das proteínas séricas: 
correlações clínico-patológicas
A eletroforese das proteínas do soro, dentro de certos limites, tem importante 
papel na investigação clínica. A análise do diagrama eletroforético poderá ser g g
feita por uma simples inspeção visual da fita, após coloração, ou através dos 
dados quantitativos obtidos por eluição da fita e leitura em fotocolorímetro ou 
pela leitura da fita no densitômetro.
A eletroforese do soro do adulto normal, usando tampão pH 8,6 de força 
iônica 0,05, resulta na separação de 5 componentes protéicos: 
f ã lb i lf 1 lf 2 b t l b lifração albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama globulina. 
A fração albumina é a que mais se distancia do ponto de aplicação no sentido 
d ól iti A f õ l b li ã d i d l d ddo pólo positivo. As frações globulinas são designadas pela ordem de 
mobilidade decrescente. Uma vez que a densidade da coloração das 
diferentes frações é proporcional as suas concentrações, a fração albumina é 
que se mostra mais densaque se mostra mais densa.
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Eletroforese das proteínas séricas:Eletroforese das proteínas séricas: 
correlações clínico-patológicasFRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%
Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%
Alf 2 0 4 0 7 /100 l 6% 10%Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%
Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%
Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
40
Eletroforese das proteínas séricas:Eletroforese das proteínas séricas: 
correlações clínico-patológicas
GLOBULINA ALFA-1 AUMENTADA: Enfermidades agudas, crônicas de 
qualquer natureza (por exemplo, resfriados, furunculose); síndrome 
f óti i fl tó i d N l i tnefrótica; processos inflamatórios agudos. Neoplasias e outros; 
síndrome com destruição tissular; efermidade de Hodgkin; úlcera 
péptica; gastroenterites agudas; colites ulcerosas e carcinoma gástrico.
GLOBULINA ALFA-1 DIMINUÍDA: Cirrose hepática, periarterites 
crônicas, hepatites por vírus, má absorção e má nutrição.
CLOBULINA ALFA-2 AUMENTADA: Síndrome nefrótica, icterícia 
obstrutiva, tuberculose pulmonar e extrapulmonar, mieloma múltiplo, 
enfermidade de Hodgkin nefrose e glomerilonefrite enfermidades doenfermidade de Hodgkin, nefrose e glomerilonefrite, enfermidades do 
colágeno, diabete melitus, úlcera péptica, gastroenterites agudas, 
colites ulcerosas e carcinoma gástrico 
41
Eletroforese das proteínas séricas: 
GLOBULINAALFA 2 DIMINUÍDA H tit í i h áti
correlações clínico-patológicas
GLOBULINA ALFA-2 DIMINUÍDA: Hepatites por vírus, cirrose hepática, 
síndrome de má absorção e má nutrição.
BETA CLOBULINA AUMENTADA: Especialmente em todos os processos em 
q e há hiperlipemia como síndrome nefrótica mi edema icterícia obstr ti a eque há hiperlipemia como: síndrome nefrótica, mixedema, icterícia obstrutiva e 
mieloma múltiplo.
BETA GLOBULINA DIMINUÍDA: Leucemias mielogênicas e momocíticas, 
colites ulcerosas nefrose e glomerulonefritescolites ulcerosas, nefrose e glomerulonefrites.
GAMA CLOBULINA AUMENTADA: Inflamações crônicas (entre elas 
endocardites bacterianas e hepatites crônicas), necroses hepáticas, 
enfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa calazarenfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa, calazar 
(leishmaniose), linfogranuloma venéreo, cirrose crônica (ê característica a 
quase ausência de demarcação entre os picos beta e gama), sarcoidoses, 
artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.
GAMA GLOBULINA DIMINUÍDA: Baixa resistência por infecções, leucemias 
linfáticas, úlceras gástricas, colites ulcerosas, enterites agudas, câncer do 
estômago, nefroses, glomerulonefrites e enfermidades de má absorção e g , , g ç
nutrição.
42
Eletroforese em capilar: apresentação esquemática
43
Eletroforese em capilarEletroforese em capilar
44
Tipos de eletroforese em capilar:p p
Eletroforese zonal em capilar (EZC): é a forma mais simples de eletroforese em 
capilar e também é conhecida como em eletroforese em solução. A separação se 
baseia na diferença da razão massa/carga das substâncias O fundamental na EZC é abaseia na diferença da razão massa/carga das substâncias. O fundamental na EZC é a 
homogeneidade da solução tampão e a uniformidade na intensidade do campo elétrico 
ao longo do capilar. O controle do pH do meio é muito importante uma vez que ele 
interfere na dissociação dos grupamentos acídicos e protonação dos grupamentos g g
básicos do soluto. 
Eletroforese em gel no capilar (EGC): é uma adaptação da eletrofrese em gel 
tradicional só que ocorrendo no interior do capilar que é preenchido com uma soluçãotradicional só que ocorrendo no interior do capilar, que é preenchido com uma solução 
de polímeros criando uma peneira molecular. Deste modo é possível separar pelo 
tamanho substâncias que apresentam a razão massa/carga similar. Está técnica é 
comumente empregada na determinação do peso molecular de proteínas e na análise 
de seqüenciamento de DNA. 
Focalização isoelétrica em capilar (FIC): possibilita que moléculas anfóteras como 
proteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e oproteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e o 
anodo. As moléculas irão migrar até onde sua carga resultante seja zero. No ponto 
isoelétrico as moléculas estacionam em uma zona focada, que pode ser localizada 
utilizando um detetor de pressão ou por meios químicos. A FIC é muito utilizada para 
caracterização de proteínas. 
45
APLICAÇÕES:
O campo de aplicação dos métodos eletroforéticos é extremamenteO campo de aplicação dos métodos eletroforéticos é extremamente 
vasto, alguns exemplos podem ser citados:
Estudo clínica do plasma e outros líquido do organismo de 
mamíferos (EAC ou EPF);mamíferos (EAC ou EPF);
Resolução de misturas complexas de proteína, ácidos nucléicos 
e aminoácidos (EGPA, EGPA-SDS, FI);e aminoácidos (EGPA, EGPA SDS, FI);
Determinação da pureza e homogeneidade molecular (EGPA, 
EGPA-SDS, FI);, );
Determinação do pI das proteínas (FI);
Determinação do peso molecular (EGPA-SDS).
46
APLICAÇÕES:
O campo de aplicação dos métodos eletroforéticos é extremamenteO campo de aplicação dos métodos eletroforéticos é extremamente 
vasto, alguns exemplos podem ser citados:
Determinação de alterações em amostras submetidas a ação de 
agentes químicos (drogas) ou físicos (radiações) - (EGPA, EGPA-SDS, 
FI);FI);
Genética molecular (EGPA** ou EGPA-SDS)- testes de paternidade 
entre outros;entre outros;
Testes mais refinados para diagnóstico (“immunoblotting” - teste 
para HIV) - (EGPA ou EGOA-SDS);para HIV) (EGPA ou EGOA SDS);
Veterinária (EGPA, EGPA-SDS, FI) - usado para avaliar alterações 
patológicas em animais;p g ;
 Taxonomia** (EGPA, EGPA-SDS, FI) - Classificação de espécies.
47
Iontoforese
A eletroforese pode ser utilizada para “injeção” de 
medicamentos através da pele.
Obstáculos para penetração da pele: A resistência do estrato córneo (camada mais 
d l ) i d d d di lé l d ê iextrema da pele) impede a entrada de medicamentos: moléculas grandes têm muita 
dificuldade em atravessar a epiderme para os vasos sangüíneos da derme. 
Soluções: Os equipamentos utilizados nesse caso denominam-se os aparelhos 
para iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsospara iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsos 
de eletricidade praticamente indolores que tornam a pele permeável. 
48
Estrutura da peleEstrutura da pele
http://webanatomy.net/anatomy/skin.jpghttp://webanatomy.net/anatomy/skin.jpg
49
Estrutura da peleEstrutura da pele
50
Iontoforese
51
Iontoforese
Iontoforese é um processo de facilitação da penetração dos tecidos 
biológicos para substâncias ionizadas (com cargas elétricas livres) 
quando submetidas a aplicação do potencial elétrico adequado.
As substâncias são geralmente os fármacos (antiinflamatórios, 
esteróides e anestésicos locais) Iontoforese é usada paraesteróides e anestésicos locais). Iontoforese é usada para 
transportar quantidades clinicamente significativas dos fármacos 
para região cutânea e subcutânea do tecido. 
A análise experimental e clínica demonstram a importância deste 
método na clínica, fisioterapia, dermatologia, otorrinolaringologia, 
oftalmologia, odontologia, e neurologia.oftalmologia, odontologia, e neurologia.
52
Iontoforese
Mecanismos: Mecanismos: IonizaçãoIonização e e EletroosmoseEletroosmose
Iontoforese
As As drogasdrogas colocadascolocadas emem meiomeio aquosoaquoso sãosão compostoscompostos iônicosiônicos queque se se 
dissociamdissociam emem partículaspartículas carregadascarregadas positivamentepositivamente e e negativamentenegativamente, , 
portantoportanto serãoserão atraídosatraídos porpor eletrodoseletrodos de de sinalsinal contráriocontrário..pp pp
Ionização --> ex. (fosfato de > ex. (fosfato de dexametasonadexametasona sódica) sódica) 
((--) íon fosfato de ) íon fosfato de dexametasonadexametasona e (+) íon sódio. e (+) íon sódio. 
A identificação da droga prediza polaridade do eletrodo que será usados A identificação da droga prediz a polaridade do eletrodo que será usados 
para mover ou entregar a droga ao tecido.para mover ou entregar a droga ao tecido.
Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogasDrogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogasDrogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogas Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogas 
negativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)negativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)
O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado de O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado de 
eletrodo dispersivoeletrodo dispersivoeletrodo dispersivo.eletrodo dispersivo.
53
1 El t f
EletroosmoseEletroosmose
1. Eletroforese;
2. Electroosmose com cargas 
elétricas fixas negativas. Os 
poros seletivamente 
hid áti
1.
preenchidas com cátions que 
faz acontece o fluxo da água 
(junto com os cátions) na 
direção do pólo negativo = 
t dcatodo. 
3. Eletroosmose com cargas 
elétricas fixas positivas. Os 
poros seletivamente 
hid ipreenchidas com anions que 
faz acontece o fluxo da água 
(junto com os anions na 
direção do pólo positivo = 
d
2.
anodo.
Esse fluxo leva as moléculas 
neutras e, também influi na 
migração das moléculas com 
lét i li3 cargas elétricas livres: 
freando aquelas que se 
movimenta contra fluxo da 
água e acelerando a 
i ã t
3.
migração outras que se 
movimenta na mesma 
direção do que a água. 54
Eletroosmose Eletroosmose 
Então na eletroosmose o fluxo do solvente acontece enquanto o campo 
elétrico é aplicado sobre um meio poroso (membrana, pele....) com cargas 
elétricas fixas nas paredes dos poroselétricas fixas nas paredes dos poros.
Por isso razão os suportes (solido ou semi-solido) para o eletroforese 
sempre estão feitos dos materiais sem as cargas elétricas fixas nos poros. 
Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de cargas negativas cargas negativas que que 
facilita facilita migração dos cátions migração dos cátions e e o fluxo do solvente/água o fluxo do solvente/água ((junto com as junto com as 
substâncias dissolvidas)substâncias dissolvidas) para o para o catodocatodo. . )) pp
Fluxo: Fluxo: de anodo para catodo.de anodo para catodo.
A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargas A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargas 
negativas) em pH entre 3 e 4 (negativas) em pH entre 3 e 4 (CostelloCostello etet alal 1995)1995)negativas) em pH entre 3 e 4 (negativas) em pH entre 3 e 4 (CostelloCostello, , etet alal 1995). 1995). 
Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições a Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições a 
pele apresenta excesso de pele apresenta excesso de cargas positivascargas positivas que facilita que facilita migração dos migração dos 
anions anions e o solvente (e o solvente (junto com as substâncias dissolvidas) junto com as substâncias dissolvidas) parapara o anodo.
Fluxo: Fluxo: de catodo para anodo. Fonte da energia elétrica de catodo para anodo. Fonte da energia elétrica 
55
Iontoforese: 
Eletroforese + Eletroosmose
56
Iontoforese PrincípiosIontoforese. Princípios
A taxa de penetração da droga aumenta com:
Aumento da carga da drogag g
Aumento da corrente iônica
Decréscimo da massa molecular do íon
(íons pequenos e leves apresentam maior 
mobilidade)
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57
Iontoforese PrincípiosIontoforese. Princípios
 Curdy, C., Kalia, Y.N., & Guy, R.Hy, , , , y,
 A resistência oferecida pela pele reside na camada A resistência oferecida pela pele reside na camada
superficial da epiderme, ou seja, estrato córneo, que
limita a perda de água do corpo.
 O estrato córneo é o maior obstáculo para a entrega 
de drogas transdérmica.
58
Iontoforese PrincípiosIontoforese. Princípios
• Banga, 1998
 A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o 
estrato córneo tem 10-15 μm.
 Os espaços intercelulares estão completamente cheios de Os espaços intercelulares estão completamente cheios de 
lamelas que são compostas por lipideos, ceramidas, 
colesterol e ácidos graxos em quantidades praticamente 
i iiguais.
 A morfologia dos lipídeos é importante para a função de 
barreira do estrato córneobarreira do estrato córneo.
59
Iontoforese PrincípiosIontoforese. Princípios
• Robinson, A.J & Snyder-Mackler, L., 1995, y , ,
 Muitos compostos são carregados positivamente ou 
negativamente Quando estes compostos são colocados emnegativamente. Quando estes compostos são colocados em 
soluções apropriadas, dissociam-se em componentes que se 
comportam como íons. Estes íons podem ser influenciados pelo 
campo elétrico aplicado a solução onde eles podem ser atraídoscampo elétrico aplicado a solução, onde eles podem ser atraídos 
pelos pólos de sinais contrários. A força elétrica de repulsão 
destas cargas é a força motriz para a iontoforese.
60
Iontoforese TeoriaIontoforese. Teoria
A A densidadedensidade de de correntecorrente é é medidamedida pelapela correntecorrente
aplicadaaplicada divididodividido pelapela áreaárea emem centímetroscentímetros quadradoquadrado dodoaplicadaaplicada divididodividido pelapela áreaárea emem centímetroscentímetros quadradoquadrado do do 
eletrodoeletrodo..
A quantidade de drogas entregue depende da correnteq g g p
total aplicada multiplicada pelo tempo.
AA íí idi i lidi i l i ii i llA A correntecorrente contínuacontínua unidirecionalunidirecional causacausa irritaçãoirritação nana pelepele, , 
sendosendo toleradatolerada emem no no máximomáximo 1 1 mAmA/cm /cm quadradoquadrado..
61
Iontoforese vs InjeçãoIontoforese vs. Injeção
A iontoforese é um tratamento não invasivo é o 
risco para a pele é baixo.p p
A iontoforese permite um tratamento sem dor paraA iontoforese permite um tratamento sem dor para 
pacientes que não suportam injeções.
A iontoforese minimiza os traumas que ocorrem 
nas injeções.
62
Iontoforese vs Via OralIontoforese vs. Via Oral
A iontoforese permite a aplicação de drogas sem queA iontoforese permite a aplicação de drogas sem que 
elas sejam absorvidas pelo trato gastrointestinal
A iontoforese é permite a aplicação de drogas 
transpondo o metabolismo hepático.
A iontoforese diminui os riscos de superdosagem.
63
Área de Aplicação
Precauções e Contra-indicações
O i i é b i l ã d dOs riscos para o paciente é baixo, mas, ela não pode ser empregada 
no tratamento nas seguintes condições:
Marcapasso cardíacos
Estimulação na área torácica
E l d l d
Câncer
Hiper ou hipotensão não 
controladaEstimuladores implantados
Sobre as carótidas no pescoço
Área faríngea 
controlada
Doenças vasculares 
periféricas
Área faríngea 
Sangramentos
Diminuição ou ausência de 
Tromboflebites
Gestação
Osteoporosesensação. Osteoporose
Obesidade morbida
Desordens epiléticasp
64
Fatores de AbsorçãoFatores de Absorção
f lf lFatores fisiológicosFatores fisiológicos
As condições do leito vascular é importante, pois a 
vasoconstricção leva a uma diminuição do fluxo, enquanto 
a vasodilatação aumenta oa vasodilatação, aumenta-o.
Existem pequenas diferenças no fluxo de drogas porExistem pequenas diferenças no fluxo de drogas por 
iontoforese em mulheres e homens.
A quantidade e o tipo de pêlos também afeta o fluxo de 
drogas na iontoforese.
65
Penetração e DistribuiçãoPenetração e Distribuição
A A penetraçãopenetração dos dos íonsíonsp çp ç
A penetração dos íons depende do tipo de tecidoA penetração dos íons depende do tipo de tecido.
A profundidade é de aproximadamente 1 1 centimetrocentimetro..
Alguns íons penetram até nos capilares subcutâneos.
66
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
InflamaçãoInflamação com com dordor constanteconstante
FosfatoFosfato sódicosódico de deDexametasonaDexametasona aa 0.4% (polaridade negativa) 
entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
DiclofenacoDiclofenaco a 5% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 
aplicações semanais durante 4 semanas
CetoprofenoCetoprofeno a 10% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 
aplicações semanais durante 5 semanas
HidrocloretoHidrocloreto de de LidocaínaLidocaína aa 4% (polaridade negativa) entregue via 
cátodo em 3 aplicações semanais durante 3 semanas
67
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
ArtriteArtrite ReumatóideReumatóide
SalicilatoSalicilato de de SódioSódio aa 2% (polaridade negativa) entregue via 
ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.
MetacolinaMetacolina aa (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 
aplicações semanais durante 4 semanas.p ç
CitratoCitrato de de PotássioPotássio a a 2% polaridade negativa) entregue via 
ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanasânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
68
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
E M lE M lEspasmos MuscularesEspasmos Musculares
Sulfato de Magnésio aSulfato de Magnésio a 2%gg
(polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais 
durante 4 semanas
Baclofeno aBaclofeno a 0.5% polaridade negativa) entregue via ânodoBaclofeno a Baclofeno a 0.5% polaridade negativa) entregue via ânodo 
em 3 aplicações semanais durante 8 semanas
Cloreto de cálcioCloreto de cálcio a 2% (polaridade positiva) entregue via 
cátodo em 3 aplicações semanais d rante 4 semanascátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
69
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
CicatrizaçãoCicatrizaçãoçç
Iodeto de Potássio aIodeto de Potássio a 10% (polaridade positiva) entregue viaIodeto de Potássio a Iodeto de Potássio a 10% (polaridade positiva) entregue via 
cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.
Cloreto de Sódio Cloreto de Sódio 3% (polaridade negativa) entregue via cátodo 
em aplicações por 4 semanas
70
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
Depósitos de CálcioDepósitos de Cálcio
Ácido Acético a Ácido Acético a 4% (polaridade negativa) entregue via 
cátodo em 3 aplicações semanais em 4 a 8 semanas
NeuropatiasNeuropatiasNeuropatiasNeuropatias
GabapentinaGabapentina a 6% (polaridade negativa) entregue via cátodo 
em 3 aplicações semanais em 2 a 8 semanas
71
Aplicações ClínicasAplicações Clínicas
VerrugasVerrugas
Salicilato de sódio a Salicilato de sódio a 2% (polaridade negativa) entregue 
via cátodo a cada 6 a 9 dias em 3 seções de 
tratamento.
GôtaGôta
•• Citrato de lítio a Citrato de lítio a 3% (polaridade positiva) entregue via 
ânodo em 3 a 5 aplicações por uma semana
72
Variáveis da IontoforeseVariáveis da Iontoforese
Concentração da Droga
pHpH da solução da drogapHpH da solução da droga
Preservativos
Fonte de corrente elétrica e intensidade de corrente
Intensidade de corrente
IMPORTANTE RELEMBRAR QUE NA IMPORTANTE RELEMBRAR QUE NA 
IONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TER IONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TER IONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TER IONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TER 
ÍONS COMPETIDORES.ÍONS COMPETIDORES.
73
Variáveis da IontoforeseVariáveis da Iontoforese
ConcentraçãoConcentração dada drogadrogagg
O O movimentomovimento de de íonsíons aumentaaumenta com a com a concentraçãoconcentração do do solutosoluto
no no eletrodoeletrodo doadordoador.
pH pH dada DrogaDroga
O pH é essencial para entrega da droga e comforto do 
paciente. A soluções ótimas que predominam na forma 
ionizada.ionizada.
74
Variáveis da IontoforeseVariáveis da Iontoforese
PreservativosPreservativos
Os Os PreservativosPreservativos na formulação podem ser transferidos para
a pele durante a iontoforese Isto pode causar eritemasa pele durante a iontoforese. Isto pode causar eritemas
localizados.
Os Preservativos criam competição iônica que resulta na
redução de entrega da droga.
75
Variáveis da IontoforeseVariáveis da Iontoforese 
TipoTipo de de fontefonte de de correntecorrente elétricaelétricapp
Sistemas de corrente constante são mais confiáveis que os
de voltagem constantede voltagem constante.
IntensidadeIntensidade de de correntecorrente
A intensidade de corrente aumenta o fluxo de íons.
76
Efeitos colaterais do IontoforeseEfeitos colaterais do Iontoforese
ReaçãoReação AlcalinaAlcalina
QueimadurasQueimaduras químicasquímicas podempodem ser ser induzidasinduzidas sob sob osos
l dl d E i d i d d deletrodoseletrodos. Este tipo de queimadura pode ser causada por
reações ácidas ou básicas.
ReaçõesReações AlcalinasAlcalinas sãosão maismais comunscomuns e e resultaresulta dada
acumulaçãoacumulação de de hidróxidohidróxido de de sódiosódio sob o sob o cátodocátodo.çç
77
Efeitos colaterais da IontoforeseEfeitos colaterais da Iontoforese
QueimadurasQueimaduras nana pelepele
A corrente elétrica através da pele cria o movimento de 
íons. Este movimento de íons conduz a alteração do pH da
pele.
As As queimadurasqueimaduras podempodem ser ser causadascausadas pelapela correntecorrente e e nãonão
pelapela medicaçãomedicação.pp çç
78
Reduzindo os riscos de 
queimar a pele
P d i i idê i d i it ã lPara reduzir a incidência de irritação a pele:
1) Limpeza com sabão água ou álcool antes da aplicação1) Limpeza com sabão, água ou álcool antes da aplicação.
2)2) SATURAR OS ELETRODOSSATURAR OS ELETRODOS garantindo que não haja áreas
secas. Preencha os eletrodos adequadamente.
3) Fazer as apliçações iontoforéticas somente em pele íntegra.3) Fazer as apliçações iontoforéticas somente em pele íntegra.
4)4) ReduzirReduzir a a densidadedensidade de de correntecorrente porpor aumentoaumento no no tamanhotamanho do do 
eletrodoeletrodo ee decréscimodecréscimo dede correntecorrenteeletrodoeletrodo e e decréscimodecréscimo de de correntecorrente.
79
IndicaçõesIndicações
• Inflamação 
• Dores
• Edemas
• Ferimentos e infecções• Dores
• Depósitos do Cálcio
• Cicatriz e aderências
• Ferimentos e infecções
• Hiperidrose
Indicação Meios Elétrodo Tempo (minuto)
Corrente 
(miliampère)
Hiperidrose
Edema
Vasodilatação
Bater a água 
Hialuronidase
Histamina
Ânodo (+) 
Ânodo (+) 
Ânodo (+)
15
20
3-5
15-20
20
2-10Vasodilatação
Úlcera de Varicose
Histamina
Metacolina
Ânodo ( ) 
Ânodo (+) 
3 5
20
2 10
5-30 
http://www beauty cosmetic guide com/lang/pt/skin surgery/iontophoresis htmhttp://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm
80
Contra indicaçõesContra-indicações
 (Robinson & Snyder-Mackler, 1995)
P l d ifi d• Pele danificada
• Diminuição de sensação na pele
S ibilid d d d i i t d• Sensibilidade a droga administrada
• Sensibilidade a corrente direta
• Marcapassos cardíacos e outros implantes 
• Arritmias Cardíacas
81
O aparelho para iontoforesep p
82
Fatores quais influenciaram na penetração 
i t f ti d fá
1 Concentração da substancia
iontoforetica das fármacos
1 Concentração da substancia 
2 Densidade do corrente elétrico 
3 Duração do processo3 Duração do processo
4 Impedância da pele
5 Lipofilicidade/hidrofilitidade e o peso molecular do fármaco5 Lipofilicidade/hidrofilitidade e o peso molecular do fármaco
6 Mobilidade do fármaco e a condutividade da solução 
7 Valencia (numero maximo/densidade das cargas elétricas)( g )
8 Valor de pH
9 Estado de ionização (depende do pK e pH)
10 Efeito do Iontoforese na metabolização e degradação do 
fármaco na pele
83
Lista de exercícios
Descrever o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhado
Lista de exercícios
Descrever o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhado
de análise eletroforetica de uma amostra de proteínas.
Como determinar a quantidade relativa das proteínas num eletroforetograma?q p g
Como a eletroforese pode ser utilizada em exames que auxiliam o processo 
de diagnóstico? 
Que é o significado de cada dos parâmetros que compõem a equação de 
fluxo migracional?
Qual é o fator mais relevante que determina a movimentação das proteínas 
do soro no eletroforese naaula pratica?
Que fatores influenciam na velocidade de migração da partícula durante a 
eletroforese?
84
Lista de exercícios
D fi t i lét i ? C d t i á l i t l t d i
Lista de exercícios
Defina ponto isoelétrico? Como determiná-lo experimentalmente de maneira 
rápida e com maior precisão? Como e que tipo de substância torna isto 
possível?
Descre a res midamente os tipos de eletroforese Em q e sit ações seDescreva resumidamente os tipos de eletroforese. Em que situações se 
aplicam?
Em que tipo de eletroforese o peso molecular das proteínas tem maior 
importância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o maisimportância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o mais 
relevante? 
Como revelar a localização das proteínas num eletroforetograma?
Como determina a quantidade relativa das proteínas reveladas numaComo determina a quantidade relativa das proteínas reveladas numa 
eletroforetograma? Qual aparelho torna isso possível? 
Que é o densitômetro? 
Os corantes utilizados num eletroforese (Lider e Revelador) possuíram quaisOs corantes utilizados num eletroforese (Lider e Revelador) possuíram quais 
propriedades?
85
Bibliografia
1 L b tó i lí i Li i Ath Edit 1991
Bibliografia 
1. Laboratório para o clínico. Livraria Atheneu Editora, 1991
2. Diagnósticos clínicos e conduta terapêutica para examines laboratoriais. Todd, 
Sanford, Davidsohn, Editora Monole Ltda, 1982.
3 Eletroforese Peulo Cesar Nahum3. Eletroforese. Peulo Cesar Nahum
4. Diagnóstico clínico e tratamento para métodos laboratoriais. J.B.Henry, Editora 
Mamole Ltda, 1999.
5. Na Bancada. Manual de iniciação cientifica em laboratórios de pesquisas ç p q
biomédicas. Kathy Barker, Editora ArtMed, 2002
6. http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-
B236EC5B641E
7. http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp
8. http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis
9. http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm
10 http://chsfpc5 chem ncsu edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002 htm10. http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm
86
Analiso eletroforetico das proteinas de plasma dum paciente
87
PROCEDIMENTO
MATERIAL NECESSÁRIO:
Cuba de acrílico para eletroforese c/ponte de 11cm de larguraCuba de acrílico para eletroforese, c/ponte de 11cm de largura, 
ajustável a 8,5 cm; 
Fonte de corrente continua (200-300 V);
Densitômetro (O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade 
das moléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração 
das moléculas numa solução (espectrofotômetro específico));ç ( p p ));
Estufa, Fita de acetato de celulose 2,5x14 cm (Cellogel), 
Papéis de filtro, Pipeta automática, Tesoura, Pinça
Placas de Petri, Amostra (soro caprino)
Corante líder (marcador da mobilidade máxima de qualquer 
partícula (molécula) numa eletroforese).
88
PROCEDIMENTO
MATERIAL NECESSÁRIO:MATERIAL NECESSÁRIO:
Tampão de corrida: - veronal sódico: 5,15g +EDTA 2,6g por 1 litro 
de água - pH=8 6 força iônica= 0 075de água pH=8,6, força iônica= 0,075
Solução corante revelador: Amido negro 0,5g+metanol 45%+ 
ácido acético 10% em água.ácido acético 10% em água.
Solução descorante: metanol 47,5% + ácido acético 5% em água
Solução desidratante: metanol
Solução transparentizante: Metanol 85%+ ácido acético 14% 
+glicerol 1%
89
PROTOCOLO
1 – Observar o sinal do polo elétrico marcado na canaletas da cuba. Colocar tampão 
de corrida nos dois lados da cuba até a metade aproximadamentede corrida nos dois lados da cuba, até a metade aproximadamente.
2 - Retirar com auxílio de pinça, a fita de acetato de celulose do pacote em que a 
mesma é acondicionada, mergulhá-la no tampão de corrida e agitar (movimento de 
)vai-vem) durante 3-5 minutos.
3 – Retirar a fita da solução tampão com uma pinça (prendedo por uma 
extremidade), segurando-a na posição vertical em cima da cuba; remover o excessoextremidade), segurando a na posição vertical em cima da cuba; remover o excesso 
de tampão da fita, tocando-a levemente na outra extremidade com uma folha de 
papel de filtro. Escolher o lado permeável da fita.
Ob t d f d fit é á lObs: somente uma das faces da fita é permeável - a opaca.
90
PROTOCOLO
4 - Sempre com o auxílio de pinça, esticar muita bem a fita na ponte. 
Observar que ambas as extremidades estejam em contato com a 
solução tampão e que o lado permeável da fita estar situado para 
cima. 
5 F h b li f t 3 5 i t ilib5 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 3-5 minutos, para equilibrar 
ainda mais os poros da fita com a solução tampão.
6 Desligar a fonte Pipetar a amostra do soro com a pipeta6 - Desligar a fonte. Pipetar a amostra do soro com a pipeta 
automática e com a mesma colocar numa placa de Petri, misturando 
com o corante Líder. (O corante Líder é um corante que não tem 
afinidade por proteínas mas migrar com maior velocidade do que asafinidade por proteínas, mas, migrar com maior velocidade do que as 
proteínas. A distância percorrida pelo corante serve como uma distância 
padrão.) Aplicar uma pequena (menos de que 1 microlitro) da 
amostra distante 1-2 cm do polo negativo (PORQUE? Explica!)amostra, distante 1 2 cm do polo negativo (PORQUE? Explica!). 
Marcar a posição da aplicação da amostra com tesoura aos dois 
lados laterais da fita (ponto de partida).
91
PROTOCOLO
7 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 30 minutos. Observar corrida 
pelo movimento do corante lider.
8 - Desligar a fonte, marcar a posição do corante líder com tesoura 
de um lado lateral da fita (chegada). Segurar a fita com a pinça no 
i d fit tá l b t id d ( 1 i dmeio da fita e cortá-la em ambas as extremidades (~1 cm acima do 
ponto de partida e ~1 cm abaixo do de chegada). Coloque a fita na 
placa de Petri e aplicar a solução corante revelador (no nosso caso é 
Amido negro) por 2 minutos!Amido negro), por 2 minutos!
9 – Repor o corante revelador para o recipiente e aplicar a solução 
descorante agitando Fazer várias lavagens à temperatura ambientedescorante agitando. Fazer várias lavagens à temperatura ambiente 
e duas com solução descorante quente, com finalidade de remover o 
excesso do corante revelador. A fita deve ficar novamente branca, 
exceto os locais onde tem proteína OBS: O corante líder é tambémexceto os locais onde tem proteína. OBS: O corante líder é também 
removido.
92
PROTOCOLO
Analiso da Eletroforetograma
Visual
Medidas necessarios para identificação das proteinasMedidas necessarios para identificação das proteinas. 
Distancia percorrida e Migração Relativa, 
Rf = DP/DL
93
PROTOCOLO
10. Retirar a fita do descorante e estendê-la na parte de cima de uma 
placa de Petri. 
Medir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativaMedir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativa 
(Rf), definida como Rf= DP /DL , onde DP é distancia percorrida por 
proteína, mm, e DL é distancia percorrida por corante líder, mm.
Compare seus dados com o padrão de migração relativa das proteínas p p g ç p
nas nossas condições, as quais são:
1. Gama-globulina- ~0.320.07; 2. Beta- globulina~0.600.07; 
3. Alfa2-globulina~ 0.730.06; 4. Alfa1-globulina~ 0.840.04; 
5. Albumina-~ 0.940.03
A partir da comparação indicar a localização das frações básicas às 
proteínas do soro no seu eletroforetograma.
94
PROTOCOLO
11 – Na preparação da fita para leitura no densitômetro, antes devemos colocá-
la por 30 segundos em metanol puro e logo em seguida, por 1 minuto na 
solução transparentizantesolução transparentizante.
12 - Retirar a fita do solução transparentizante, estendê-la na parte de cima de 
uma placa de Petri e deixar na estufauma placa de Petri e deixar na estufa
até que a fita fique transparente (aproximadamente 1 minuto).
13 - Retirar da estufa, esperar esfriar, colocar na mesa de um densitômetro
para realização da leitura e determinação da quantidade (relativa ou absoluta)de cada proteínade cada proteína. 
95
PROTOCOLO
O densitômetro é um aparelho 
baseado na propriedade das 
moléculas de absorver a luz 
diretamente proporcional à 
concentração das moléculas numa 
solução (espectrofotômetro 
específico). 
96
PROTOCOLO
O densitômetro é construído para medidas da absorbância ao 
longo da fita com as proteínas coradas. 
O resultado da leitura da fita está apresentado 
como um gráfico (chamada “densitograma” que 
soma de várias Gaussianas “picos”) onde as p )
áreas sombreadas por cada Gaussiana (pico) 
representam a quantidade de proteína (ou 
qualquer outra substância que absorva a luz).
Soma todas as áreas = 100% das proteinas 
analisadas;
Área de qualque um - Xq q
FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%
Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%
Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%
Beta 0 7 a 0 9 g/100 ml ou 10% a 13%Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%
Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
97
PROTOCOLO
14 – Agora que temos o gráfico obtido com a análise 
densitométrica das corridas eletroforéticas, um 
pequeno problema se apresenta: Como podemos 
calcular as quantidades relativas de cada proteína nacalcular as quantidades relativas de cada proteína na 
solução da corrida, baseados apenas no gráfico? Isto 
pode ser resolvido de duas formas:
14.1 – Primeiro traçamos uma linha na base do ç
gráfico (azul) e separa os picos (vermelho). Depois 
as áreas de cada pico pode ser obtido através da 
aproximação por uma ou mais figuras geométricas. 
Para se saber a quantidade relativa das proteínasPara se saber a quantidade relativa das proteínas, 
basta estabelecer relações matemáticas entre as 
áreas de cada pico e a área total. 
Outra possibilidade é utilizar uma balança analítica e p ç
uma tesoura. Podemos simplesmente recortar o 
gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. 
Em seguida pesa-se esse recorte e anota-se a o 
peso obtido (PG =peso total) referente a todopeso obtido (PG =peso total), referente a todo 
gráfico. Depois, recorta-se cada Gaussiana (picos) 
do gráfico (as linhas vermelhas) e pesa-se 
separadamente. Para se saber a quantidade relativa 
das proteínas, basta estabelecer relações 
matemáticas entre os pesos anotados e o peso total. 98