Relatório 5

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL
LABORATÓRIO DE INSTRUMENTAÇÃO
RELATÓRIO Nº 5:
DETERMINAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS EM AMOSTRA DE LEITE
Lorena Soares
Michelle Marques
Queila Vilela
Ryane Moreira
Belo Horizonte, 20 de novembro de 2013.
Resumo
O presente relatório visa a identificação e quantificação de antibiótico (oxitetraciclina, clortetraciclina e tetraciclina) em amostras de leite. Através do procedimento inicial de extração e preparação da amostra e posteriormente a análise com instrumental no Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE, e em inglês, HPLC). O antibiótico é um agravante em sistemas ambientais, podendo selecionar cepas bacterianas resistentes no ambiente, dentre outros fatores ou causar o desequilíbrio da flora intestinal, afetando diretamente a qualidade destes ambientes e a saúde humana, respectivamente.
Palavras-chave: leite, antibióticos, HPLC, cromatografia líquida.
Introdução
O leite é um líquido produzido pela secreção de glândulas mamárias das fêmeas dos mamíferos. (Matos et al., 2007). Ele é considerado o mais nobre dos alimentos, por sua composição rica em proteína, gordura, carboidratos, sais minerais e vitaminas, proporciona nutrientes e proteção imunológica para o neonato. Além de suas propriedades nutricionais, o leite oferece elementos anticarcinogênicos, presentes na gordura, como o ácido linoléico conjugado, esfingomielina, ácido butírico, β caroteno, vitaminas A e D (Müller, 2002).
Segundo Barros et al. (2001), antibiótico é todo composto químico produzido por um microrganismo possuindo a propriedade, em solução diluída, de inibir o crescimento de outros microrganismos, ou mesmo de os destruir. Alguns antibióticos têm sido usados para combater doenças diversas no controle de mortalidade e morbidade animal e também para melhorar ganhos de peso. No entanto, a aplicação indiscriminada destes medicamentos em vacas tem criado problemas ao homem pela presença de resíduos nos laticínios.
De acordo com Nascimento et al. (2001): a presença de resíduos de antibióticos no leite pode ocasionar uma série de problemas: 
Seleção de cepas bacterianas resistentes no ambiente. É comum o aumento gradativo das dosagens de antibióticos utilizadas na terapia de animais, uma vez que o emprego dessas drogas possibilita a seleção de bactérias resistentes, principalmente quando seu uso é indiscriminado; 
A ingestão de resíduos de antibióticos presentes nos alimentos supõe risco para a saúde humana, seja exercendo pressão seletiva sobre a flora intestinal, favorecendo o crescimento de microrganismos com resistência natural ou adquirida, ou dando lugar, direta ou indiretamente, para o aparecimento de resistência em bactérias enteropatogênicas; 
Hipersensibilidade e possível choque anafilático em indivíduos mais sensíveis;
Alterações no processo fermentativo (produção de queijos e iogurtes). As bactérias láticas são mais sensíveis aos antibióticos, impedindo que a fermentação ocorra satisfatoriamente; 
Modificação dos resultados de análises laboratoriais devido à indução de uma falsa ideia da boa qualidade do produto; 
Desequilíbrio da flora intestinal. Isto pode ocorrer principalmente em crianças abaixo de um ano de idade, que ainda se encontram em formação.
As tetraciclinas são compostos antibacterianos utilizados no gado leiteiro para tratamento de doenças infecciosas, como a mastite e também como aditivos em ração animal para melhorar a conversão alimentar. O uso das tetraciclinas pode acarretar a presença de resíduos destes fármacos no leite, principalmente se não forem utilizados de acordo com as indicações e se não for respeitado o período mínimo de eliminação dos antibióticos pelo leite.
As tetraciclinas possuem diferentes grupos funcionais na sua molécula, cuja presença torna mais complexos os mecanismos envolvidos na sua retenção nos sistemas cromatográficos. 
Em tais sistemas, solventes desempenham papéis importantes, como a formação de pares iônicos, de complexação e a forte interação com grupos silanóis residuais. Estes fatores dificultam a quantificação das tetraciclinas. São utilizadas fases móveis com elevado teor aquoso como consequência da elevada polaridade das tetraciclinas. (Pena et al., 1997 apud Denobile, Nascimento, 2004). 
Na análise cromatográfica das tetraciclinas são utilizadas colunas de fase reversa, cujo material de preenchimento permite a retenção destas através de alguns mecanismos, tais como: formação de pares iônicos, efeitos de competição, locais ativos e não ativos, troca iônica e interação com grupos silanóis (Pena et al., 1997 apud Denobile, Nascimento, 2004). As tetraciclinas formam quelantes com íons metálicos e tendem a absorver-se nos grupos silanóis na coluna de fase reversa. Estes problemas podem ser superados pela adição de ácido oxálico na fase móvel e pelo uso de colunas de poliestirenodivinilbenzeno (Oka et al. 2000; Schenck, Callery, 1998 apud Denobile, Nascimento, 2004).
Em fase reversa, a fase estacionária tem natureza apolar (como por exemplo, hidrocarbonetos), enquanto a fase móvel é um líquido polar, como água ou álcool, que pode ser modificada ajustando a polaridade. Neste caso, materiais apolares ficam retidos por mais tempo, e o soluto polar elui primeiro. 
A composição da fase móvel, portanto, desempenha papel muito importante no comportamento cromatográfico das tetraciclinas. Pena et al, em 1997, ao testar diferentes tipos de colunas cromatográficas de fase reversa, verificam que não eram necessárias colunas de melhor qualidade e performance se fosse escolhida uma fase móvel apropriada. Os melhores resultados foram obtidos em pH 2 com tampão oxalato, citrato, ou fosfato. A adição de ácido oxálico numa concentração adequada atua como eficiente agente complexante, evitando os picos com caudas e permitindo a determinação precisa das tetraciclinas (Denobile, Nascimento, 2004). A coluna utilizada na prática foi a Nova-Pak Waters® RP 8, 60 A°, 4µm (3,9 x 150 mm). 
Segundo Denobile et al. (2004), no Brasil, a competência para estabelecer limites máximos de resíduos em alimentos, seja de medicamentos veterinários, seja de agrotóxicos, contaminantes e aditivos, é do Ministério da Saúde através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. No caso de medicamentos veterinários, até o momento, esses limites nacionais não foram definidos pelo setor saúde e, portanto, vem-se utilizando o Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal (PNCRB). Para a clortetraciclina, tetraciclina e oxitetraciclina na matriz leite, o valor máximo da soma destes antibióticos deve é 100μg. (Brasil, 2013). 
Objetivos
A prática tem como objetivo determinação de antibióticos através da identificação e quantificação dos mesmos (clortetraciclina, tetraciclina e oxitetraciclina) em amostras de leite.
Através do procedimento de extração e preparação das amostras para posteriormente ser feito a análise com a utilização da Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC). 
Materiais e métodos
Materiais
Tubo de centrífuga
Ultrassom;
Filtro;
Bomba de vácuo;
Funil de Buchner;
Estufa.
Reagentes
Solução de ácido tricloroacético a 80% em acetonitrila ou solução de ácido acético a 80 % em acetonitrila.
Métodos para extração, preparação e quantificação do analito
O instrumento HPLC é de alta precisão e exatidão, apesar de caro, logo, se faz necessária uma preparação da amostra para separar as substâncias de interesse e evitar possíveis danos que outras substâncias possam causar ao aparelho.
Para ser feito processo de extração e preparação da amostra de leite, adicionou-se 5 mL de leite em um tubo de centrífuga, depois disso, aqueceu-se o leite em banho maria numa temperatura de 70º C por 5 minutos. 
Em seguida foi adicionado 1,8 mL da solução de ácido tricloacético a 80% de acetonitrila. 
Não foi utilizada na análise a agitação pelo ultrassom, pois foi feita manualmente por em tornode 2 minutos e levado a centrífuga a 3000 rpm por 10 minutos. 
A amostra foi filtrada e injetada no cromatógrafo líquido de alta eficiência, onde foi introduzida no amostrador automático do cromatógrafo, este transporta a amostra para a coluna que é responsável pela separação das substâncias, ocorre uma interação do recheio da coluna com uma das substâncias de uma maneira diferente, as amostras são transferidas para o detector que identifica as substâncias de antibióticos presentes na amostra de leite. Seguidamente, as substâncias são transferidas em tempos diferentes, devido a interação das substâncias, para o extract (waste) para o fechamento do processo de análise.
As tetraciclinas apresentam forte absorção UV, em torno de 270 e 360 nm em soluções ácidas e neutras, portanto o método de detecção mais convencional para sua determinação é a CLAE acoplada ao detector UV (ou detector de arranjo de diodos, DAD) que permite análise em diferentes comprimentos de onda simultaneamente (Oka et al, 2000, apud Denobile, Nascimento, 2004). A absorção ocorre em 363 nm, próximo dos valores obtidos na literatura, concluindo-se que o método de detecção é de fotodiodos. O fluxo da coluna é de 1mL/min, tempo de corrida de 10 minutos. Possui um sistema gradiente, com duas fases móveis “A” e “B” de acordo com as concentrações do eluente varia-se o tempo. A fase móvel “A” foi preparada misturando 900 mL de ácido oxálico 0,01M, 99mL de acetonitrila e 1mL de trietilamina, filtrada através de filtro Milipore 0,45µm e desgaseificada sob pressão.
A fase “B” constituída de 100% de acetonitrila, foi filtrada através de filtro Milipore 0,45µm e desgaseificada sob pressão.
Na absorbância, gera-se um gráfico com picos diferentes, interpola-se os resultados das áreas obtidas pelas amostras neste gráfico. Cada pico do gráfico refere-se a uma substância diferente. A área abaixo de cada pico é proporcional a uma concentração que será comparada com a curva de um padrão feito anteriormente para cada um dos antibióticos.
Resultados e Discussão
Para que seja feita a determinação da concentração dos antibióticos analisados no leite, foram feitas as curvas de calibração em que se relacionaram as concentrações dos padrões do equipamento de HPLC com a área de pico referente. 
Os dados de concentração dos padrões e áreas de pico para as diferentes concentrações de Oxitetraciclina, Clortetraciclina e Tetraciclina se encontram nas tabelas 1, 2 e 3. 
Tabela 1 – Curva de calibração da Oxitetraciclina
	Oxitetraciclina
	ng/ml
	Área
	50
	0,9514
	100
	3,3364
	200
	8,1054
	400
	17,6464
	800
	36,7274
	1600
	74,8864
Tabela 2 – Curva de calibração de Clortetraciclina
	Clortetraciclina
	ng/ml
	Área
	50
	1,1846
	100
	2,0036
	200
	3,6446
	400
	6,9246
	800
	13,4845
	1600
	26,6046
Tabela 3 – Curva de calibração de Tetraciclina 
	Tetraciclina
	ng/ml
	Área
	50
	1,5166
	100
	4,1216
	200
	9,3298
	400
	19,7516
	800
	40,6001
	1600
	82,2716
A partir dos dados que foram apresentados nas tabelas anteriores foram construídos gráficos para que através de regressão linear seja obtida a equação das curvas de calibração. Nas figuras 1, 2 e 3 são apresentados os gráficos com as curvas de calibração e as equações referentes a Oxitetraciclina, Clortetraciclina e Tetraciclina.
Figura 1 – Curva de calibração da Oxitetraciclina
Figura 2 – Curva de calibração de Clortetraciclina
Figura 3 – Curva de calibração Tetraciclina
Após a construção das curvas de calibração foi utilizado o valor de área de pico da amostra, que nos foi fornecido para que se obtivesse a concentração de cada tipo de antibiótico. Na tabela 4 é apresentada a concentração obtida através das equações da curva de calibração referente a cada antibiótico.
Tabela 4 - Áreas de pico dos analitos e sua concentração
	Analito
	Área 
	Concentração (μg/L)
	Oxitetraciclina
	4,8968
	132,717
	Clortetraciclina
	3,6047
	197,585
	Tetraciclina
	84,3260
	1.639,428
	Total (Soma)
	
	1.969,73
Na tabela 4 o valor da concentração foi apresentado em μg/L o que corresponde ao valor da concentração em ng/ml, sendo assim não é necessário multiplicar o valor que foi obtido pelas equações em ng/ml por nenhum fator de conversão para que se obtenha a concentração em μg/L . Optou-se por apresentar a concentração em μg/L para que possa ser feita a comparação com os valores estabelecidos pelo Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal (PNCRB). 
As curvas de calibração apresentadas no relatório como figuras 1,2 e 3 apresentam R² igual a 1, o que indica grande precisão nas curvas. Já a curva de calibração de Tetraciclina poderia ter sido feita com mais alguns valores de ng/mL, já que a curva ia até 1600ng/mL dando uma área de 82,271 e a amostra apresentou uma área maior de 84,326, ou seja maior concentração que a que foi usada para fazer a curva. 
A curva é baseada em resultados esperados e nesse caso ela não pôde ser precisa, apresentando uma incerteza maior para os resultados.
Conclusão
A partir dos resultados pode-se dizer que o método do HPLC foi um método de alta detecção para os antibióticos oxitetraciclina, clortetraciclina e tetraciclina, podendo detectar concentrações da ordem de 10-3 mg/L. Esse composto é um agravante em sistemas ambientais, podendo selecionar de cepas bacterianas resistentes no ambiente, dentre outros fatores, que afetam diretamente a qualidade destes ambientes e a saúde humana. Por fim, pode-se dizer que o método apresenta algumas vantagens sobre outras cromatografias, como a gasosa, pois não degrada a amostra já que trabalha com temperaturas mais amenas (máximo de 60ºC) além de não serem necessárias temperaturas altas para a detecção do analito. Pode-se concluir após a soma dos três antibióticos (1.969,73 µg) que estes, estão muito acima do permitido (100 µg segundo BRASIL, 2010), podendo causar qualquer um dos danos citados na introdução deste relatório.
Referências bibliográficas	
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DENOBILE, M.; NASCIMENTO, E. S. Validação de método para determinação de resíduos dos antibióticos oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e doxiciclina, em leite, por cromatografia lóquida de alta eficiência. Rev. Bras. Ci. Farm., v.40, n.2, 2004.
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MÜLLER, Ernst, E. Qualidade do leite, células somáticas e prevenção da mastite. Anais do II Sul- Leite: Simpósio sobre Sustentabilidade da Pecuária Leiteira na Região Sul do Brasil / editores Geraldo Tadeu dos Santos et al. – Maringá : UEM/CCA/DZO – NUPEL, 2002. 212P. Toledo – PR, 29 e 30/08/2002. Páginas 206-217.
WANG, J, et al. Analysis of sulphonamide residues in edible animal products. Food Additives and Contaminants, n. 23, p. 362-384.