Gram e meios de cultura

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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
Técnica de Gram e Meios de Cultura
SÃO PAULO
2017
INTEGRANTES
Amanda Tavares 		
Fabiana Arboleia 		
Irene Yuriko 		
Marcelly Nassar 		
Silvia Denise	
Este relatório é destinado ao professor, Rodrigo Macedo da disciplina de microbiologia.
SÃO PAULO 
2017
UTILIZAÇÃO PRÁTICA DOS PROCEDIMENTOS
Coloração de Gram
Preparo de meios de cultura
COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. 
O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram.
Passo à Passo 
Para realizar a técnica de coloração de Gram, primeiramente é necessário fazer o esfregaço. Que é feito da seguinte maneira:
Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço; 
Colocar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica ou água destilada;
Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar no meio sólido (da placa onde não tem colonia de bactéria);
Com a alça retirar uma colonia escolhida;
Esfregar o material com movimentos de rotação, para se  obter um esfregaço, bem fino e uniforme, evitando a quebra dos agrupamentos bacterianos;
Deixar secar nas proximidades da chama;
Com o auxilio de uma pinça de madeira, fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 3 vezes na  chama do bico de Bunsen (rapidamente); Aguarde o resfriamento da lamina;
Realizar a coloração de Gram;
Agora, podemos utilizar a técnica de coloração, seguindo essas etapas:
Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;
Lavar rapidamente em água;
Cobrir a lâmina com solução de Iugol, por um minuto;
Lavar em água; 
Inclinar a lâmina e gotejar álcool (cerca de 15 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
Lavar a lâmina em água corrente e secar (sem esfregar);
Observar a lâmina corada no microscópio;
MEIOS DE CULTURA
Os meios de culturas são preparações químicas que possuem na sua formula nutrientes e entre outras substâncias que provém as condições necessárias para que os microrganismos inoculados multipliquem-se em um meio artificial, para o seu estudo e análise.
Passo à passo
Em uma balança semi-analítica, pesar o meio de cultura de acordo com as instruções do fabricante;
Medir a quantidade de água destilada necessária para o procedimento com uma proveta graduada;
Transferir para o erlenmeyer a água e o meio de cultura;
Diluir bem o ágar com o auxilio do bastão de vidro e fundi-lo no bico de Bunsen, até ficar translucido na forma que possamos ver o bastão no meio do erlenmeyer; 
Montar o tampão de gaze (boneca):
1ª gaze – abra 1 vez;
2ª gaze – abra 2 vezes;
Cruze-as;
No centro da cruz, colocar um montante de algodão hidrófobo e dar um nó, unindo as pontas das gazes;
Tampar o erlenmeyer com a boneca, envolver a borda com papel craft e finalizar com fita crepe amarela em cima;
Identificar o frasco;
Autoclavar por 15 min à 121 ºC;
Plaquear
Ascenda o bico de bunsen e abra as placas de petri dentro do cone de esterilidade (próximo a chama);
Despeje +/- 25 mL em cada placa, até cobrir todo fundo. 
Espere solidificar e tampe; 
Trabalhe sempre no cone de esterilidade !
 Meio de cultura pronto para semeadura;
INOCULAÇÃO DE MEIOS E SEMEADURA EM PLACA
O Inóculo  é o patógeno ou parte do patógeno capaz de causar infecção, a parte ou porção do agente patogênico que entra em contato com o hospedeiro.
Para realizarmos uma cultura bacteriana é necessário um inóculo.
As técnicas de semeadura em placa é um método pelo qual se transfere, parte de um inóculo bacteriano ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um meio de cultura (ágar). Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, sempre trabalhar no cone de esterilidade.
TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO
Inoculação em meio líquido/caldo (caldo verde brilhante bile 2% ou caldo BHI). Não contém ágar.
Identificar o tubo de ensaio;
Esterilizar a alça bacteriológica e resfriar bem;
Retirar uma colônia do inóculo ou placa de cultura;
Transferir para o interior do tubo, agitando a alça no meio, para desprender o inóculo.
Flambar a boca do tubo e fechar; Flambar a alça novamente;
Incubar o tubo por 24h à 37ºC;
Inoculação em meio semi-sólido (ágar nutriente 0,5%)
Identificar o tubo de ensaio;
Esterilizar a alça agulha e resfriar bem;
Retirar uma colônia do inóculo ou placa de cultura;
Transferir para o interior do tubo, descer a agulha até +/- 0,5cm do fundo do tubo, sem tocar nas bordas;
Flambar a boca do tubo e fechar; Flambar a alça novamente;
Incubar o tubo por 24h à 37ºC;
Inoculação em meio sólido – ágar inclinado (ágar nutriente 1,5%)
Identificar o tubo de ensaio;
Esterilizar a alça bacteriológica e resfriar bem;
Retirar uma colônia do inóculo ou placa de cultura;
Transferir para o interior do tubo, descer a agulha até +/- 0,5cm do fundo,voltar pelo mesmo sulco e estriar a superfície inclinada;
Flambar a boca do tubo e fechar; Flambar a alça novamente;
Incubar o tubo por 24h à 37ºC;
Inoculação de ágar em placas – Por esgotamento (ágar nutriente)
Identificar as placas;
Esterilizar a alça bacteriológica e resfriar bem;
Retirar uma colônia do inóculo ou placa de cultura;
Transferir para superfície do ágar, desta maneira: 
Flambar a alça e Incubar as placas inoculadas;
Inoculação de ágar em placas – Por Espalhamento 
Identificar as placas;
Esterilizar a alça bacteriológica e resfriar bem;
Retirar uma colônia do inóculo ou placa de cultura;
Transferir para superfície do ágar, desta maneira:
Flambar a alça e Incubar as placas inoculadas;
RESULTADOS DA AULA PRÁTICA
Inoculação em meio líquido Inoculação em meio semi-sólido
 
Inoculação em meio sólido - Ágar inclinado
 
Inoculação em placa
Por esgotamento – Ágar Nutriente Por esgotamento – Ágar Cled
S. aurus S. aurus 
 
Por espalhamento – Ágar Mac Conkey
E. coli 
 
CARACTERISTICAS DAS BACTERIAS SEMEADAS
Placas de ágar Cled e Nutriente 
A bactéria semeada foi a Staphylococcus aurus, que é uma bactéria aeróbia ou anaeróbia facultativa, Gram Positiva (cora em roxo), cuja a morfologia é de estafilococos.
Nas placas de Cled, a S. aurus alterou a cor do ágar que passou de verde para translucida. Já a sua cor e apresentou-se amarela e de textura mais fina.
Nas placas de Nutriente, a S. aurus não alterou a cor do ágar, permanecendo translucido levemente opaco. Sua cor também apresentou-se amarela e de textura um semi-solida. 
Em ambas as Colônias apresentam-se um pouco agrupadas.
Placas de ágar Mac Conkey
A Bactéria semeada foi a E. coli, que é uma bactéria facultativamente anaeróbica, Gram Negativa (cora em rosa), cuja a morfologia é de bacilos (bastonete).
Nas placas demostram-se mais “altas”, com uma textura um pouco gelatinosa e de cor rosa, com o centro mais claro.
As colônias apresentam-se separadas. 
CONCLUSÃO
Sabemos que os meios de cultura são importantes na multiplicação dos microrganismos para que posteriormente seja feita uma identificação, análise e uma pesquisa desses resultados. Dentro desse contexto, foi observado que nas duas técnicas, realizadas durante as aulas em laboratório, os resultados ocorreram como esperado, com pequenas exceções, como por exemplo na alteração da coloração na placa do ágar Cled com a S. aurus. Sendo assim, concluímos que os resultados foram satisfatórios dentrodo foi previsto e ressaltamos a importância da extrema atenção desses preparos, com intuito de não haver contaminações.