Bioquimica - Apostila Farmacia.pdf

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO (UFRRJ) 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS (ICE) 
DEPARTAMENTO DE QUíMICA (DEQUIM) 
ÁREA DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BBiiooqquuíímmiiccaa EExxppeerriimmeennttaall 
Farmácia (IC 627) 
 
Roteiros de Práticas e Fundamentos Teóricos 
 
 
 
 
 
2016 
2 
 
SUMÁRIO 
 
1. Espetrofotometria ............................................................................... 3 
2. Titulação de aminoácidos .................................................................. 10 
3. Análises qualitativas de biomoléculas ................................................ 13 
4. Determinação da concentração de proteínas em uma amostra .......... 21 
5. Propridades físico-químicas de proteínas ........................................... 24 
6. Cinética enzimática ............................................................................ 29 
7. Análises qualitativas de carboidratos ................................................. 37 
8. Fermentação ..................................................................................... 45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
ESPECTROFOTOMETRIA 
 
INTRODUÇÃO: 
A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade de solutos 
absorverem luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida 
permite, entre outras coisas, inferir sobre a concentração do soluto em determinada 
solução. 
 
Radiação Eletromagnética - Uma radiação eletromagnética, como a luz visível, pode ser 
descrita (Figura 1): 
 Como uma onda constituída por um componente vetor elétrico e por um 
componente vetor magnético 
 Como uma série de pacotes discretos de energia (fótons) 
No primeiro caso, pode-se aplicar à radiação os parâmetros característicos de um 
movimento ondulatório (comprimento de onda, frequência e número de ondas). 
 
Figura 1: Representação esquemática de uma radiação eletromagnética. O campo elétrico e 
o campo magnético são perpendiculares entre si e ambos oscilam perpendicularmente à direção 
de propagação da onda, onde E é o campo elétrico e M o campo magnético. 
 
A energia eletromagnética não precisa de um meio material para se propagar, 
sendo definida como uma energia que se move na forma de ondas eletromagnéticas à 
velocidade da luz (300.000 km/s). Dado que a velocidade de propagação das ondas 
eletromagnéticas é diretamente proporcional à sua frequência e comprimento de onda, 
esta pode ser expressa por 
c = f x λ (1) 
 
4 
 
onde: 
c: velocidade da luz (m/s) 
f: freqüência (ciclos/s ou Hz) 
λ: comprimento de onda 
Comprimento de onda (λ) é a distância linear entre dois picos de ondas. As 
unidades usadas para o comprimento de onda de uma radiação eletromagnética: 
 1 nanômetro (nm) = 10-9 m 
 1 micrômetro (µm) = 10-6 m 
 1 angstrom (Å) = 10-10 m = 10-8 cm 
Frequência (f) é o número de ondas completas (ciclos) que passam por um 
determinado ponto por segundo. Unidade: s-1 
Número de ondas é o número de ciclos (ondas) por cm. Unidade: cm-1 
Teoria de Planck e o espectro eletromagnético - A distribuição das radiações 
eletromagnético existentes na natureza pela ordem dos seus comprimentos de onda ou 
número de onda constitui o espectro eletromagnético. 
E = h x f (2) 
Em que h é a constante de Planck = 6,62 x 10-27 erg.s. Combinando (1) e (2), 
temos: 
 E = h x f = (hxc)/λ (3) 
Assim a energia de cada fóton é proporcional à frequência e ao número de onda 
e inversamente proporcional ao comprimento de onda (Figura 2). 
 
 
 
 
Figura 2: Representação do espectro 
eletromagnético. 
 
 
 
 
 
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Quantificação de espécies químicas mediante a absorção de luz. 
 
 
5 
 
I. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO: 
 
1. Objetivo: 
Determinar o comprimento de onda ótimo (pico de absorção máximo) para o 
corante indicado. 
 
2. Princípio do método: 
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um 
procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies 
químicas mediante a absorção de energia radiante (luz). 
Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de 
intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. 
Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para 
quantificação do composto através de: 1) absorção direta e 2) através de método 
colorimétrico. 
As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela combinação de duas leis 
(Lei de Lambert-Beer): 
 Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa através de um meio 
absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz. 
 Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na 
solução. 
 
Então, a intensidade de absorção depende: 
• do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λmáx – onde o composto 
absorve mais luz); 
• do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução; 
• da concentração do composto nessa solução. 
A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que: 
A =  . l . c 
onde: 
A = absorvância (definida pela relação adimensional: A = - log I
t
/I
0
), sendo I
o 
a 
intensidade da luz incidente e I
t 
a intensidade da luz transmitida; 
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)
-1
; 
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm (Figura 3); 
c = concentração da substância em mol/L. 
6 
 
 
 
Figura 3: luz atravessando a solução da amostra com 
caminho óptico l. 
 
Desta forma, mantendo-se o caminho óptico 
constante, a absorvância torna-se diretamente proporcional à concentração da 
substância no respectivo λmáx. A fração de luz que passa por uma amostra é a 
transmitância (T) = I
t
/I
0
, e está relacionada logaritmicamente, e não linearmente, com a 
concentração da amostra. 
Então, estabelecendo a relação: 
A = log Io/It log 100/It log 100 – log It A = 2 – log It 
Ou seja: 
Quando Io = 100% A = 2 – log It 
Quando It = 1 A = 2 
Quando It = 100% A = 0 
Quando It = zero A = ∞ 
A intensidade da radiação transmitida por uma substância é utilizada para a sua 
determinação quantitativa. Essa é a base dos ensaios colorimétricos e 
espectrofotométricos. Para descontarmos a absorvância do meio em que o soluto está 
solubilizado utiliza-se um branco (que vai conter tudo que se tem no meio a ser medido 
a absorvância menos o soluto). 
• Espectrofotômetros – instrumento utilizado para medir a quantidade de luz de um 
dado comprimento de onda que é transmitida por uma amostra (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4: Principais componentes de um espectrofotômetro. Uma fonte (lâmpada) emite a 
luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz é selecionada por um monocromador que 
transmite em um comprimento de onda específico. A luz monocromática passa através da 
amostra em uma cubeta com caminho óptico l. Uma parte da luz é absorvida pela amostra 
Lâmpada 
Monocromador 
Cubeta com amostra com c moles/litros 
da espécie a ser analisada 
Intensidade 
da luz 
incidente 
I0 
Intensidade 
da luz 
transmitida 
 I 
Detector 
7 
 
dependendo da concentração (quanto maior é a concentraçãoda amostra maior será a luz 
absorvida). A luz transmitida é medida por um detector. 
 
Cubetas: uma vez selecionado o λ no qual se deseja fazer a análise, essa radiação 
específica atravessará um recipiente, com caminho ótico definido, que contem a 
amostra (cubeta). As cubetas de vidro são as mais baratas do que as de quartzo e por 
isso devem ser usadas sempre que possível. No entanto o vidro absorve radiação na 
faixa do UV e tem sua utilização limitada para a faixa de 360 a 800nm, enquanto as 
cubetas de quartzo podem ser usadas de 200 a 800nm. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
- azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila (0,001% 
em água). Solubilizou-se 0,001g do corante em 100mL de água destilada. 
 
4. Procedimento: 
 Branco: pipetar 3,0mL do solvente (água) utilizado para solubilizar o corante na 
cubeta de vidro; 
 Realizar a leitura no espectrofotômetro (zerar a leitura - branco); 
 Pipetar 3 mL da solução contendo o corante designado na cubeta de vidro; 
 Realizar as leituras e anotar as absorvâncias nos comprimentos de onda 
relacionados abaixo: 
 
• Corante: 
λ (nm) 400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690 
Abs 
 
 
II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO (Aplicação da Lei de Lambert-Beer): 
 
1. Objetivo: 
Construir uma curva padrão e determinar a concentração de uma amostra de 
corante desconhecida. 
 
2. Princípio do método: 
Podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser 
analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para construir 
um gráfico de absorvância em função da concentração da substância em questão. Com 
8 
 
este gráfico, denominado curva padrão, pode-se calcular a quantidade do soluto que 
absorve um determinado comprimento de onda da luz em amostras de concentração 
desconhecida; desde que, estas estejam nas mesmas condições utilizadas para a 
construção da curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc.) (Figura 5). 
 
 
Figura 5: Um exemplo de 
uma curva padrão. Abs x 
concentração (mol/L). 
 
 
 
3. Reagentes e preparo 
das soluções: 
- Idem seção anterior. 
 
4. Procedimento: 
 Identificar 7 tubos de ensaio e colocá-los em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo; 
 
Tubos B 1 2 3 4 5 D 
corante 0,001% (mL) 0 1 2 3 4 5 0 
amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 5 
água destilada (mL) 5 4 3 2 1 0 0 
Abs 
concentração (%) 
 
 Zerar o aparelho com o tubo B (branco) contendo apenas água; 
 Realizar as leituras no espectrofotômetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de 
onda ideal para o seu corante e anotar os valores obtidos; 
 Calcular as concentrações dos tubos 1 ao 5; 
 A amostra D, contendo o mesmo corante, possui concentração desconhecida. 
Você deverá determinar a concentração da solução através da Lei de Lambert-
Beer. 
 
9 
 
Após a construção da curva padrão temos as absorvâncias para diferentes 
diluições de uma solução de concentração conhecida (solução padrão). A absorvância 
de uma solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida pelo 
feixe de luz através da solução (Lei de Lambert-Beer). Então, ao se construir o gráfico 
com os dados obtidos acima (curva padrão), temos: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C1  A1 
C2  A2 
C3  A3 
... 
CN  AN 
 
Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN 
No entanto, há dispersão dos pontos na prática, então, se traça a melhor reta, ou 
se determina o coeficiente angular médio: 
Segundo a equação da reta: 
y = ax + b 
(sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear) 
Ou seja: 
 
A =  . C + b (b = 0) ou  = A/ C 
 
Calcula-se o  para cada concentração (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....) 
 
O médio é obtido a partir da média de todos os calculados e representa a 
inclinação da reta. Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados: 
 
Cd = Ad /médio 
Onde: 
A = absorvância; 
C = concentração conhecida do padrão 
 
C2 
 
 




CN 
AN 
A3 
A2 
A1 
C1 C3 
10 
 
TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS 
(Método Potenciométrico) 
 
INTRODUÇÃO: 
Muitas substâncias orgânicas são dissociáveis, podendo apresentar 
características ácidas ou básicas. Os ácidos graxos e nucleotídeos, por exemplo, se 
apresentam assim. Por outro lado, os fosfolipídios, os aminoácidos e as proteínas 
apresentam caráter ácido e básico simultaneamente, ou seja, comportam-se como íons 
anfóteros. A acidez e a basicidade dessas moléculas dependem, entre outros fatores, 
do pH do meio onde se encontram. Dessa forma, o pH do meio define a forma iônica 
desses compostos e, analogicamente, a forma iônica desses compostos também 
interfere no pH do meio. 
 
1. Objetivo: 
Identificar através de uma curva de titulação as características químicas do 
aminoácido desconhecido. 
 
2. Princípio do método: 
A curva de titulação tem duas fases diferentes, correspondendo cada uma à 
remoção de prótons dos seus dois diferentes grupos. Em pH muito baixo, a espécie 
iônica predominante do aminoácido é a sua forma completamente protonada. No meio 
da primeira fase da titulação, na qual o grupo carboxila perde o seu próton, as 
concentrações do doador e do recebedor de prótons são equivalentes. Nesse caso, 
segundo a equação de Henderson-Hasselback o pH é igual ao pK do grupo protonado 
que está sendo titulado. Continuando a titulação, outro ponto importante é alcançado, 
no qual o primeiro próton já foi praticamente removido e inicia-se a remoção do segundo 
próton. A segunda fase da titulação corresponde à remoção do próton do grupo NH3+, 
onde no meio desta segunda fase o pH toma valor equivalente ao pK do grupo amina. A 
titulação fica praticamente completa quando o pH atinge o valor de 12. Neste ponto a 
forma predominante é totalmente desprotonada. 
Na titulação do aminoácido glicina (Figura 6) podemos tirar diversas informações 
importantes. Primeiro dá-nos uma medida quantitativa do pKa de cada um dos grupos 
ionizáveis: 2,34 para o grupo carboxila e 9,60 para o grupo amina. Note-se que o grupo 
carboxila da glicina é cerca de 100 vezes mais ácido (mais facilmente ionizável) do que 
o grupo carboxila do ácido acético, o qual tem um valor de pKa de 4,76. A diferença de 
pKa do grupo carboxila na glicina é causado pela repulsão entre o próton que sai e o 
11 
 
grupo amina carregado positivamente ligado ao carbono . As cargas opostas ao 
estabilizarem-se deslocam o equilíbrio para a direita. À semelhança deste, o pKa do 
grupo amina da glicina fica abaixo do seu valor médio. Este efeito é devido parcialmente 
à eletronegatividade dos átomos de oxigênio do grupo carboxila, que tende a atrair 
elétrons, aumentando a tendência 
de o grupo amina ceder um próton. 
Daí o grupo amina ter um pKa que é 
inferior ao de um grupo amina 
alifático, como por exemplo o da 
metilamina. 
 
Figura 6: Curva de titulação do 
aminoácido glicina. Representação 
dos valores de pK da carboxila, do 
grupo amino e do pI (ponto 
isoelétrico) da glicina. 
 
De forma geral, o pKa de 
qualquer grupo funcional é 
majoritariamente afetado pelo 
ambiente químico, um fenômeno por 
vezes explorado no centro ativo das enzimas para promover mecanismos de reação 
que dependem dos valores do pKa dos grupos doadores/receptores de resíduos 
específicos. 
O pH característico onde todas as espécies químicas da glicina apresentam 
carga líquida nula chama-se ponto isoelétrico (pI). Para a glicina, que não tem nenhum 
grupo ionizável na sua cadeialateral, o pI é simplesmente a média aritmética dos dois 
valores de pKa: 
pI= ½ (pK1 + pK2 ) = ½ (2,34 + 9,60 ) = 5,97 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
- 2 alíquotas de 50mL de solução de um L-aminoácido 0,1M em solução salina 
fisiológica (NaCl 0,89% p/v); 
- 100mL de solução de HCl 0,1M e 100mL de solução de NaOH 0,1M. 
 
4. Procedimento: 
 Monte o esquema para as titulações (Figura 7); 
12 
 
 Meça o pH inicial da solução do L-aminoácido e mantenha o sistema montado 
com o potenciômetro funcionando; 
 Dependendo do pH da solução escolha se a titulação vai ser feita com o ácido 
ou a base; 
 Obrigatoriamente o grupo deverá titular a faixa de pH entre 2.00 e 12.00; ou 
seja, você provavelmente fará uma titulação ácida e outra básica; 
 
 
 
 
Figura 7: Esquema da aparelhagem para a titulação 
potenciométrica. 
 
 
 Transfira a solução de HCl ou NaOH para a 
bureta, primeiramente rinsando-a e, posteriormente, ajustando adequadamente 
seu volume para o início da titulação (não esqueça de verificar a presença de 
bolhas antes de aferir o menisco no ponto zero da bureta); 
 Titule a solução do aminoácido contra HCl ou NaOH, aferindo e anotando o pH 
do sistema a cada 0,2mL adicionado (lembre-se que você deve aguardar até a 
estabilização do potenciômetro para efetuar a leitura). Prossiga a titulação até 
valores de pH próximos a 1.50; 
 Descarte a alíquota do L-aminoácido já titulada e lave a barra magnética com 
água destilada; 
 Transfira a barra magnética lavada para a outra alíquota do L-aminoácido; 
 Meça novamente o pH inicial da solução de L-aminoácido e mantenha o sistema 
montado com o potenciômetro funcionando; 
 Transfira a outra solução titulante (NaOH ou HCl) para a bureta lavada, 
primeiramente rinsando-a e, posteriormente, ajustando adequadamente seu 
volume para o início da titulação (não esqueça de verificar a presença de bolhas 
antes de aferir o menisco no ponto zero da bureta); 
 Titule a solução do aminoácido contra o NaOH ou HCl, aferindo e anotando o pH 
do sistema a cada 0,2mL adicionado (lembre-se que você deve aguardar até a 
estabilização do potenciômetro para efetuar a leitura). Descarte a segunda 
alíquota do L-aminoácido já titulada. 
 
13 
 
ANÁLISES QUALITATIVAS DE BIOMOLÉCULAS 
 
INTRODUÇÃO: 
Muitas moléculas biológicas são macromoléculas, que são polímeros de alto 
peso molecular constituídos pela repetição de unidades menores, chamados 
monômeros. Estas macromoléculas se apresentam em grande variedade quanto ao 
tamanho e também quanto aos seus monômeros constituintes. Entre as 
macromoléculas de maior importância estão as proteínas, formadas por aminoácidos; 
os polissacarídeos (carboidratos), polímeros de açúcares simples, como a glicose; e os 
ácidos nucléicos (DNA e RNA), constituídos por nucleotídeos. Além destas 
macromoléculas, moléculas menores como lipídios, água, sais minerais e vitaminas 
também possuem um importante papel na constituição e função celular. Embora 
moléculas individuais de lipídios sejam muito menores do que proteínas, ácidos 
nucléicos e carboidratos, estes também apresentam unidades monoméricas e muitos 
podem se associar não covalentemente formando agregados maiores. A bioquímica 
preocupa-se com o estudo tanto da constituição destas biomoléculas como a 
importância biológica dos processos e interações envolvendo estas. A identificação 
destas biomoléculas, assim como o conhecimento de suas características e 
propriedades é um passo essencial para o entendimento destes processos. 
 
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Identificar a presença de diferentes biomoléculas (proteínas, lipídios, ácidos 
nucleicos, carboidratos e também aminoácidos) em amostras biológicas através de 
reações específicas. Nesta prática cada grupo irá receber um conjunto com 5 amostras 
e deverá identificar para cada amostra se esta é um lipídio, uma proteína, um 
aminoácido, um carboidrato ou um ácido nucléico. 
 
A. TESTE PARA LIPÍDIOS (TESTE DE SOLUBILIDADE EM ÁGUA): 
 
1. Objetivo: 
Identificação da presença de lipídios nas amostras desconhecidas. 
 
2. Princípio do método: 
Os lipídios são moléculas com grande variedade estrutural e funcional, no 
entanto, estas substâncias são caracterizadas pela baixa solubilidade em água e outros 
solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares. 
14 
 
3. Procedimento: 
 Identificar os tubos de ensaio necessários e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 
Obs. Note que você fará um “controle positivo do teste” usando uma amostra de óleo. 
Tubos óleo (mL) amostra (mL) água (mL) Resultados 
CP 1,0 - 2,0 
A no__ - 1,0 2,0 
A no__ - 1,0 2,0 
A no__ - 1,0 2,0 
A no__ - 1,0 2,0 
A no__ - 1,0 2,0 
Legenda: CP (controle positivo); A (amostra). 
 
 No teste é considerado positivo para a presença de lipídios quando houver a 
formação de duas fases. 
 
B. TESTE PARA PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO) 
 
1. Objetivo: 
Identificar a presença de proteínas nas amostras desconhecidas. 
 
Obs. Agora que você identificou uma amostra como sendo lipídio, esta amostra pode 
ser eliminada nos testes seguintes. Assim será para os próximos testes: a cada teste 
realizado uma amostra pode ser eliminada. 
 
2. Princípio do método: 
Proteínas e peptídeos com no mínimo três aminoácidos, na presença do 
“Reativo de Biureto” desenvolvem uma coloração púrpura. Este método é baseado na 
reação do sulfato de cobre em meio alcalino (Reativo de Biureto) com proteínas e 
peptídeos. O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180 oC forma 
um composto chamado biureto. Este composto na presença de íons de cobre em meio 
fortemente alcalino formará um composto de cor azul (Figura 8). 
 
 
 
 
15 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8: Reação do biureto. 
 
Quando o composto contém duas ou mais ligações peptídicas, produz um 
complexo cobre-proteína ou cobre-peptídeo de cor púrpura ou azul-violeta, que absorve 
luz a 545nm. A intensidade de cor produzida é proporcional ao número de ligações 
peptídicas que estão reagindo, portanto, a quantidade de proteínas presentes pode ser 
determinada. Quando a solução possuir elevada concentração de peptídeos (tri-, oligo- 
e polipeptídeos) a coloração desenvolvida será rosa a avermelhada. A sensibilidade do 
método é de 0,5 a 5,0mg/mL. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reagente de Biureto: 
- Dissolver 1,5g de CuSO4.5H2O e 6,0g de tartarato duplo de sódio e potássio 
(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água; 
- Adicionar 300mL de NaOH 10%; 
- Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de 
solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz. 
Solução padrão de caseína 1% (10mg/mL): 
- Dissolver 2,0g de caseína em 200mL de água destilada. Aliquotar em frações 
de 10mL e conservar a – 20 oC. 
 
4. Procedimento: 
 Identificar os tubos de ensaio necessários e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle 
positivo do teste” usando caseína (uma proteína encontrada no leite). 
 
16 
 
Tubos água (mL) 
caseína 
(mL) 
amostra 
(mL) 
biureto 
(mL) 
Resultados 
 B 1,0 - - 4,0 
CP - 1,0 - 4,0 
A no__ - - 1,0 4,0 
A no__ - - 1,0 4,0 
A no__ - - 1,0 4,0 
A no__ - - 1,0 4,0 
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra). 
 
 Após a adição do reagente de biureto, homogeneizar os tubos e deixar em 
repouso por aproximadamente 20 min; 
 Neste teste éconsiderado positivo se a amostra desenvolver uma coloração 
púrpura de forma semelhante ao controle positivo (a intensidade depende da 
concentração de proteínas). 
 
C. TESTE PARA AMINOÁCIDOS (REAÇÃO DA NINHIDRINA) 
 
1. Objetivo: 
 Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas. 
 
2. Princípio do método: 
O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser 
removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um 
poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de -aminoácidos 
produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial 
(Figura 9). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outra 
molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absorção 
máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para um teste 
quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos -aminoácidos, também 
reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de CO2. 
Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e 
hidróxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo 
máximo de absorção ocorre em 440nm. Neste caso não há liberação de NH3, porém há 
produção de teores quantitativos de CO2. 
17 
 
C
C
O
O
OH
OH
H2N C COOH
H
R
+
HN C COOH
R
C
C
O
O
H
OH
H2O+ +
HN C COOH
R
H2O
+ +
O C COOH
R
NH3
O C H
R
CO2
C
C
O
O
H
OH
NH3
C
C
O
O
OH
OH+ +
C
C
O
O
C
H
N C
C
O
O
C
H2O3+
NH3
C
C
O
C
H
N C
C
O
O
C
O
-NH4
+
Complexo de Ruherman
Abs a 570 nm
(coloração roxa)
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9: Esquema geral da reação de aminoácidos com ninhidrina. 
 
3. Reagentes e preparo de soluções: 
- Pesar 0,25g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 
100mL. (solução 0,25%) 
- Pesar 0,890g de L-alanina dissolver em água destilada. Completar com água q.s.p 
100mL. (solução 0,1M) 
 
4. Procedimento: 
 Identificar os tubos de ensaio necessários e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle 
positivo do teste” usando o aminoácido alanina. 
Tubos 
água 
(mL) 
alanina (mL) 
amostra 
(mL) 
ninhidrina 0,1% 
(gotas) 
Resultados 
B 1,0 - - 5 
CP - 1,0 - 5 
A no ___ - - 1,0 5 
A no ___ - - 1,0 5 
A no ___ - - 1,0 5 
 
18 
 
 A pós a adição da solução de ninhidrina, aquecer os tubos em banho-maria a 
100 ºC por 3 minutos; 
 Neste teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando 
ocorre a formação de uma coloração roxa (maioria dos aminoácidos) ou amarela 
(iminoácido – prolina). 
 
D. TESTE PARA CARBOIDRATOS (REAÇÃO DA ANTRONA): 
 
1. Objetivo: 
 Identificar a presença de carboidratos nas amostras desconhecidas. 
 
2. Princípio do método: 
O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor 
liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de oligo 
e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a 
monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando à 
formação de hidróximetilfurfural e furfural que, na presença de antranol, dão produtos 
de condensação coloridos (Figura 10). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10: Reação de Antrona. 
 
O hidróximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma 
substância de coloração verde musgo relativamente estável enquanto que o furfural 
proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga, mas que 
em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
- Pesar 0,1g de antrona (C14H10O) e dissolver em 100mL de ácido sulfúrico (H2SO4). 
O
C C
H
OH
H
O
H
OH O
C C
H
OH
H
H
OH
OH
O
C C
H
OH
H
H
OH
OH
hidróximetilfurfural antranol 
Complexo 
verde musgo 
19 
 
- Pesar 0,2g de glicose e solubilizar em 100mL de água destilada. (solução 
2,0mg/mL). 
 
4. Procedimento: 
 Identificar os tubos de ensaio necessários e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 O reagente de antrona deve ser adicionado em banho de gelo, e permanecer 
no gelo por 5 minutos antes de levar à fervura; 
 
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle 
positivo do teste” usando glicose. 
Tubos 
água 
(mL) 
glicose 
(mL) 
amostra 
(mL) 
banho 
de gelo 
reagente de 
antrona 
(mL) 
Resultados 
B 0,1 - - 0,5 
CP - 0,1 - 0,5 
A no__ - - 0,1 0,5 
A no__ - - 0,1 0,5 
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra). 
 
 Após adição de todos os reagentes, aquecer em banho fervente (100 oC) e 
observar até o desenvolvimento de uma coloração verde (de 2 a 5 minutos); 
 No teste é considerado positivo para a presença de carboidratos quando ocorre 
a formação de uma coloração verde. 
 
E. TESTE PARA ÁCIDOS NUCLEICOS (Teste para caracterização de pentoses - 
REAÇÃO DE BIAL): 
 
1. Objetivo: 
 Identificar a presença de ácidos nucleicos nas amostras desconhecidas. 
 
2. Princípio do método: 
Ácidos nucléicos (DNA e RNA) podem ser evidenciados pela reação do orcinol 
para pentoses (Figura 11). Neste caso, o ácido nucleico é submetido a um meio 
fortemente ácido, criado pelo reativo do orcinol, promovendo a hidrólise tanto das 
ligações N-glicosídicas quanto fosfodiésteres. Portanto, os produtos de hidrólise 
formados são: a pentose, na forma livre, bases purínicas (adeninas e guanina), bases 
20 
 
pirimidínicas (citosinas, timinas e uracilas) e ácido fosfórico. A pentose neste meio 
fortemente ácido sofre desidratação gerando como produto o furfural, que por sua vez, 
reage com o orcinol, gerando como produto um complexo de cor verde (com 
absorvância máxima a 670nm), indicando a presença de ácidos nucleicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11: Reação da D-ribose com o orcinol em meio ácido. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
- Solubilizar 0,2g de orcinol em 60mL de HCl concentrado. Adicionar 0,2mL de 
cloreto férrico (FeCl3) 10%. 
 
4. Procedimento: 
 Identificar os tubos de ensaio necessários e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo: 
 
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle 
positivo do teste” usando extrato hepático. 
Tubos 
Água 
(mL) 
extrato 
hepático 
(mL) 
amostra 
(mL) 
reativo de 
orcinol 
(mL) 
Resultados 
B 0,5 - - 1,0 
CP - 0,5 - 1,0 
A no__ - - 0,5 1,0 
A no__ - - 0,5 1,0 
Legenda: B (branco); CP (controle positivo) e A (amostra). 
 
 Agitar os tubos e colocar em banho-maria a 100 ºC/5 min; retirar em seguida e 
deixar resfriar; 
 No teste é considerado positivo para a presença de ácidos nucleicos quando 
ocorre a formação de uma coloração esverdeada. 
OH
COH
HH
CH3
OHHO
O
H H
CH2
OH OH
H
OH
H
OH
D-ribose 
(RNA) 
Meio fortemente 
ácido + Fe+2 
Furfural 
+ 3 H2O 
Complexo de 
condensação de cor verde 
Orcinol 
21 
 
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS 
EM UMA AMOSTRA 
(Método do Biureto) 
 
INTRODUÇÃO: 
Proteínas são moléculas orgânicasque apresentam diversas funções celulares 
(transporte, catálise enzimática, defesa, estrutural, etc.). A função e a estrutura de uma 
proteína estão fortemente correlacionadas, por isso observa-se uma grande variedade 
de estruturas protéicas que acompanham a variedade de funções desempenhadas por 
estas. Proteínas são caracterizadas por sua estrutura básica, formada por aminoácidos 
unidos por ligações peptídicas. As ligações peptídicas são formadas entre o grupo 
carboxila de um aminoácido e o grupo amino do aminoácido seguinte com a eliminação 
de uma molécula de água (Figura 12A). O número, a identidade e a disposição destes 
aminoácidos no espaço (devido às interações entre estes) variam entre diferentes 
proteínas e determinam as diferentes estruturas tridimensionais e funções destas 
(Figura 12B). 
 
Figura 12: A - Formação de uma ligação peptídica. B - Estrutura tridimensional de uma 
proteína (citocromo c). 
 
A determinação da concentração de proteínas em materiais biológicos é 
necessária em diversas situações, como na purificação de uma determinada proteína a 
partir de um extrato de material biológico para o estudo de suas propriedades e 
funções; ou na avaliação quantitativa de certas proteínas que têm suas quantidades 
alteradas em determinadas situações patológicas. 
A B 
22 
 
Existem diversos métodos para a determinação do conteúdo total de proteínas 
em uma amostra. Suspensões puras de proteínas apresentam absorção de luz de 
comprimento de onda abaixo de 230 nm com absorção máxima a 220 nm, 
correspondente principalmente às ligações peptídicas. Entretanto, já que outros 
compostos como ácidos carboxílicos, íons de tampão, alcoóis, bicarbonato e 
substâncias aromáticas também absorvem nesta região, os resultados obtidos devem 
ser interpretados com cuidado. As proteínas também absorvem luz ultravioleta em 
comprimentos de onda próximos a 280 nm que correspondem a presença de tirosina 
(275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas moléculas. Como o teor 
destes aminoácidos varia entre diferentes proteínas, a absorção a 280 nm será 
particular de cada grupo de proteínas. A quantificação de proteínas através da absorção 
a 280 nm é uma técnica rápida e eficiente, entretanto ela está sujeita a interferências, 
particularmente de ácidos nucléicos que exibem absorção máxima a 260 nm. Outros 
métodos bastante comuns baseiam-se no conteúdo de nitrogênio de proteínas (todas as 
proteínas possuem um conteúdo médio de nitrogênio de 16%), como o “método de 
Kjeldahl”, ou na reação de sulfato de cobre em meio alcalino com proteínas, que 
fornece um produto de coloração púrpura, como no “método do Biureto”. Também 
bastante utilizado, o “método de Folin-Lowry” apresenta modificações ao método do 
Biureto. Neste método, após a realização do método do Biureto é adicionado à reação o 
reagente de Ciocalteau (ácido fosfotúngstico fosfomolibídico) que é reduzido pela 
tirosina presente nas moléculas de proteínas. Nesta reação a coloração desenvolvida é 
muito mais intensa, tornando o método 100 vezes mais sensível do que o método do 
Biureto, sendo este bastante útil para amostras muito diluídas. 
Todos os métodos possuem vantagens e limitações, portanto a escolha deve ser 
cautelosa e levar em consideração os diversos fatores relativos àquela análise, como, 
por exemplo, as características da amostra e a disponibilidade de recursos como 
equipamentos e reagentes. Nesta prática será realizado o método do Biureto, que será 
descrito em maiores detalhes a seguir. 
 
1. Objetivo: 
Determinação da concentração de proteínas através da formação de produtos 
com coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria. 
 
2. Princípio do método: 
Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo 
de Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). Maiores detalhes 
podem ser encontrados no roteiro da aula “Análise Qualitativa de Biomoléculas”. 
23 
 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reagente de Biureto: 
- Solubilizar 1,5g de CuSO4.5H2O e 6,0g de tartarato duplo de sódio e potássio 
(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500mL de água; 
- Adicionar 300 mL de NaOH 10% e água destilada para 1 litro de solução. 
Conservar a temperatura ambiente protegido da luz. 
Solução padrão de caseína 1% (10mg/mL): 
- Pesar 1,0g de caseína, dissolver em aproximadamente 70mL de água destilada e 
depois adicionar hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida, e completar 
o volume para 100mL. Aliquotar em frações de 10mL e conservar a – 20 oC. 
 
4. Procedimento: 
 Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante; 
 Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte: 
 
Tubos 
H2O 
(mL) 
caseína 
10 mg/mL 
(mL) 
amostra reagente 
de biureto 
(mL) 
Abs (540 nm) 
B 1,0 0 - 4,0 
1 0,8 0,2 - 4,0 
2 0,6 0,4 - 4,0 
3 0,4 0,6 - 4,0 
4 0,2 0,8 - 4,0 
5 - 1,0 - 4,0 
6 - - 1,0 4,0 
 
 Após a adição do reagente de biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 
aproximadamente 20 min; 
 Calcular a concentração de proteínas na amostra de concentração desconhecida 
que seu grupo recebeu. 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE PROTEÍNAS 
 
INTRODUÇÃO: 
A solubilidade das proteínas é muito variável e depende da distribuição e da 
proporção de grupos polares (hidrofílicos) e apolares (hidrofóbicos) na molécula. 
Fatores como pH do meio, concentração de sais e a constante dielétrica do solvente 
também afetam a solubilidade. 
 
 
 
 
 
 
 
Muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas. Uma vez que as 
proteínas podem possuir muitos grupos carregados positiva ou negativamente 
provenientes das cadeias laterais dos aminoácidos, as moléculas podem interagir umas 
com as outras, com pequenos íons de carga oposta e com a água. Assim ocorrem 
interações proteína-proteína, proteína-água e proteína-íons. Se a interação proteína-
proteína é grande e a interação proteína-água é pequena, as proteínas tenderão a se 
tornarem insolúveis. Por outro lado, se a interação proteína-água for grande, as 
proteínas tenderão a serem solúveis. Qualquer condição que altere estas interações 
poderá afetar a solubilidade das proteínas. 
Em geral a desnaturação diminui a solubilidade das proteínas. A redução da 
solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que 
prejudiquem as interações proteína-água e favoreçam as interações proteína-proteína. 
Existem várias condições desnaturastes tais como, temperaturas elevadas, valores de 
pH extremos, sais de metais pesados e solventes orgânicos. 
Temperaturas elevadas aumentam a agitação térmica, afetando as interações 
que estabilizam a estrutura tridimensional da proteína (pontes de hidrogênio, interações 
hidrofóbicas). 
Condições extremas de pH, por causa da adição de ácidos ou bases fortes 
alteram o estado de ionização dos aminoácidos, afetando as interações iônicas que 
estabilizam a estrutura tridimensional da proteína. Além disso, bases provenientes de 
certos ácidos fortes podem interagir com as cargas positivas presentes na proteína, 
formando sais que resultam na desnaturação e precipitação. 
25 
 
A precipitação de proteínas por causa da adição de sais de metais pesados é 
atribuída à combinação do cátion metálico (Pb+2, Hg+2, etc) com cargas negativas que 
podem estar na proteína, resultando na formação de sais insolúveis (proteinato de 
chumbo, proteinato de mercúrio, etc). A precipitação é favorecida quando o pH está do 
lado alcalino do ponto isoelétrico da proteína graças ao aumento do número de cargas 
negativasna proteína. 
Solventes orgânicos também podem interferir nas interações que estabilizam a 
estrutura tridimensional (pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas), promovendo 
desnaturação e precipitação. Entretanto neste caso há um fator adicional envolvido no 
mecanismo de precipitação, a constante dielétrica do solvente. 
 A força das interações eletrostáticas (F) depende da magnitude das cargas 
envolvidas (q1, q2), da distância entre os grupos carregados (r) e de uma propriedade 
física do solvente conhecida como constante dielétrica (). A relação entre a força de 
atração eletrostática e os parâmetros mencionados é dada pela lei de Coulomb: 
F = q1 x q2/ x r2 
 A constante dielétrica é uma medida derivada do momento dipolar da molécula 
e pode ser determinada por medidas de capacitância. Em termos simples, a constante 
dielétrica é uma medida da assimetria de cargas intrínseca ou induzida em um campo 
elétrico. A água apresenta uma constante dielétrica alta,  = 80, atenuando as 
interações iônicas. Assim, a força de atração entre moléculas protéicas contendo 
radicais com cargas opostas é baixa, fazendo com que predominem as interações 
proteína-água em vez de interações proteína-proteína. Solventes orgânicos apresentam 
constantes dielétricas inferiores à da água (por exemplo, benzeno = 2,3, etanol = 24, 
clorofórmio = 4,8). Conseqüentemente as interações iônicas nestes solventes são muito 
mais fortes do que com a água. Portanto, a adição de um solvente orgânico a uma 
solução aquosa de proteína favorece as interações proteína-proteína, conduzindo à 
precipitação. 
As proteínas também podem ser precipitadas sem desnaturação ao se variar o 
pH e por alterações da força iônica do meio. 
Muitas proteínas podem ser precipitadas ao se variar o pH da solução até seu 
ponto isoelétrico. O ponto isoelétrico de uma proteína é definido como o valor de pH no 
qual a carga líquida da molécula é zero. Neste pH, a solubilidade das proteínas em 
solução aquosa é mínima, pois a presença de um número equivalentes de cargas 
positivas e negativas na superfície da molécula aumenta a atração iônica, minimizando 
a repulsão eletrostática entre as cadeias. 
26 
 
A solubilidade das proteínas também pode se alterada pela presença de sais. A 
capacidade de sais neutros de influenciar a solubilidade de muitas proteínas é uma 
função da força iônica (m). A força iônica de uma solução salina é uma função tanto da 
concentração quanto da valência dos cátions e ânions que formam o sal, sendo definida 
como: 
 = 1/2∑Mi x Zi2 
Onde Mi é a molaridade do íon i, e Zi é a sua valência. A soma é feita para todos 
os íons. Para NaCl, por exemplo, ZNa = +1 e ZCl = -1 e uma vez que MNa+ = MCl-l para 
uma solução NaCl a força iônica equivale à concentração (NaCl = MNaCl). Assim, para 
eletrólitos 1:1 a força iônica é igual à molaridade do sal, mas isso não ocorre quando 
íons divalentes ou de valência maior estão envolvidos. Estes íons multivalentes 
conferem uma maior contribuição individual à atmosfera iônica do que íons 
monovalentes, uma vez que o quadrado da carga iônica é incluído no cálculo da força 
iônica e neste caso,   M. 
Em baixa força iônica, os sais aumentam a solubilidade das proteínas, um 
fenômeno denominado “salting-in”. O efeito é atribuído à interação da proteína com o 
sal, causando diminuição da interação proteína-proteína. Um efeito oposto na 
solubilidade das proteínas é obtido em altas concentrações de sal em elevada força 
iônica. As proteínas podem ser precipitadas sem desnaturação por meio da adição de 
sal, fenômeno conhecido como “salting-out”, podendo ser explicado pela retirada da 
camada de solvatação (água de hidratação) das moléculas, resultando na 
predominância das interações proteína-proteína. 
 
1. Objetivo: 
Comparar as diferentes situações desnaturantes entre as soluções proteicas, 
utilizando a mesma solução padrão de proteínas. 
 
2. Reagentes e preparo das soluções 
Solução de proteína-padrão 2% (20mg/mL): 
- Pesar 2 g de proteína-padrão (caseína, gelatina, hemoglobina ou ovoalbumina) 
dissolver com aproximadamente 70mL de água destilada e depois adicionar 
hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida e completar o volume para 
100mL. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a – 20 oC. 
Solução de ácido tricloroacético 12,5% (p/v): 
- Pesar 12,5g de TCA (ácido tricloroacético) dissolver com aproximadamente 100mL 
de água. Conservar a temperatura ambiente. 
27 
 
Solução de cloreto de sódio (NaCl) 1M: 
- Pesar 40g de NaCl e solubilizar em 1000mL de água. Conservar a temperatura 
ambiente. 
Solução saturada de sulfato de amônio: 
- Em um becker de 100mL ir adicionando sulfato de amônio até precipitar o sal no 
fundo do becker. Conservar a temperatura ambiente. 
 
 3. Procedimento: 
Ação do calor: 
 Em um tubo de ensaio coloque 2,0mL da solução proteica; 
 Leve o tubo ao banho-maria a 100 ºC por 10 minutos. 
 
Ação de ácido forte: 
 Em um tubo de ensaio coloque 1,0mL da solução protéica e 1,0mL de TCA 
(12,5%); 
 Observe e conclua o que ocorreu. 
 
Ação de solventes orgânicos: 
 Prepare 3 tubos de ensaio com 1,0mL da solução protéica, e em cada tubo 
adicione 1,0mL de acetona (tubo 1), 1,0mL de etanol (tubo 2) e 1,0mL de éter 
etílico (tubo 3); 
 Agite os tubos vigorosamente, observe e conclua o que ocorreu. 
 
Precipitação reversível de proteínas: 
 
Salting-in: em um becher, coloque 5,0mL da solução de clara de ovo, diluída em água 
destilada, mexendo lentamente com um bastão de vidro (até aparecer um precipitado = 
globulinas). Em seguida adicione a solução de NaCl (1M) até a redissolução do 
precipitado de proteína não desnaturada. 
Salting-out: em um tubo de ensaio, coloque 2,0mL da solução de clara de ovo, 
adicione 2,0mL da solução saturada de sulfato de amônio e observe a formação do 
precipitado, aos poucos, agitando lentamente, adicione água destilada a fim de 
dissolver novamente o precipitado. 
 
 
 
28 
 
 
 
4. Curva de Solubilidade da Caseína em Função do pH: 
 Fazer um gráfico o inverso da turbidez (absorvância) contra o pH; 
 Analisar o gráfico obtido indicando a faixa onde se situa o PI da caseína. 
 
Tubos B 1 2 3 4 5 6 7 
H2O (mL) 5,0 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,9 
Ác. Acético 0,1M (mL) - 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 - 
Ácido Acético 1M (mL) - - 0,6 
Caseína 0,3% (mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
pH 
Abs (570nm) 
 
 
5. Curva de Solubilidade da Caseína em Função da Força Iônica: 
 Fazer um gráfico logaritmo do inverso da turbidez (absorvância) contra a 
força iônica; 
 Analisar o gráfico obtido indicando as regiões de “salting in” e “salting out”. 
 
Tubos B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
H2O (mL) 5,0 4,0 3,9 3,7 3,4 3,2 3,0 2,5 2,0 0,5 - 
Ác. Acét. 0,1M (mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
MgSO4 1,25M (mL) - - 0,1 0,3 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0 3,5 4,0 
Caseína 0,3% (mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
Força Iônica 
Abs (570nm) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
CINÉTICA ENZIMÁTICA 
 
INTRODUÇÃO: 
Enzimas são catalisadores biológicos que aceleram a velocidade das reações 
químicas, diminuindo a energia de ativação. Possuem, em geral, estrutura protéica, 
sendo que algumas moléculas de RNA (ribozimas) foram descritas com atividade 
catalítica. As enzimas não alteram a constante de equilíbrio nem a variação de energia 
livre das reações, sendo regeneradas, sob a forma original, ao final da catálise. As 
moléculas reagentes são denominadas substratos (S) e produtos (P) são formados ao 
final das reações. As enzimas são,geralmente, bastante específicas com relação aos 
substratos, formando um complexo denominado ES (enzima-substrato) durante a 
catálise: 
 
 
A grande maioria das reações biológicas não ocorre, ou ocorre em velocidades 
baixíssimas nas condições fisiológicas de pH e temperatura. Logo, as reações 
biológicas, em geral, necessitam de um catalisador para que possam ocorrer, isto é, 
necessitam de enzimas. Diversos são os fatores que influenciam a velocidade de uma 
reação enzimática. O pH ótimo de uma enzima não é necessariamente idêntico ao pH 
de seu meio normal. Acima ou abaixo desse pH, a atividade se reduz. Ainda que os 
perfis de atividade em função do pH de muitas enzimas tenham a forma de um sino, 
eles podem variar consideravelmente em forma. Pode-se observar pela figura 13 que a 
enzima abaixo apresenta um pH ótimo entre os valores 7,0 e 9,0. 
4 5 6 7 8 9 10 11
0
1
2
3
4
5
pH
[g
lic
os
e]
 (
g
/m
L/
m
im
)
 
Figura 13. Perfil típico do efeito da variação de pH sobre uma atividade enzimática. 
 
E + S  ES  E + P 
30 
 
Tal como ocorre para a maioria das reações químicas, a velocidade das reações 
catalisadas por enzimas aumenta geralmente com a temperatura, dentro de certa faixa 
de temperatura na qual a enzima é estável e mantém atividade integral, até que se 
atinja a temperatura ótima. A partir dessa temperatura, a atividade enzimática diminui à 
medida que a temperatura é elevada, uma vez que as enzimas são desnaturadas pelo 
calor (Figura 14). 
0 20 40 60
0
3
6
9
12
temperatura (C)
[g
lic
os
e]
 (
g
/m
L/
m
im
)
 
Figura 14. Perfil típico do efeito da variação de temperatura sobre uma atividade 
enzimática. 
 
Dentro de limites bastante amplos, a velocidade de uma reação enzimática é 
proporcional à concentração de enzima. Este princípio pode ser aplicado a uma grande 
variedade de enzimas, desde que não haja interferentes na reação e a concentração de 
substrato seja mantida constante (Figura 15). 
0.0 0.2 0.4 0.6
0
2
4
6
enzima (mL)
[g
lic
os
e]
 (
g
/m
L/
m
im
)
 
Figura 15. Perfil típico do efeito da variação de enzima sobre a atividade enzimática. 
 
A formação e ruptura de ligações químicas por uma enzima são precedidas pela 
formação de um complexo enzima-substrato. Em concentração constante da enzima, a 
(mg) 
31 
 
velocidade de reação aumenta com o aumento da concentração de substrato até que a 
velocidade máxima é alcançada (Figura 16). Em concentração de substrato 
suficientemente alta, os centros catalíticos estão ocupados e assim a velocidade da 
reação alcança um máximo. 
 
Figura 16. Efeito da variação de substrato (sacarose) sobre a atividade de invertase de 
Saccharomyces cerevisiae. 
 
Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten desenvolveram estudos considerando as 
principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cinética 
Química para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato 
(S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso 
pela equação química: 
 
 
 
 
Após tratamentos matemáticos e aproximações a equação de Michaelis-Menten 
é esta: 
 
A figura 16 representa uma curva de velocidade inicial de reação em função da 
concentração de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis 
32 
 
O
CH2OH
H
OH
H
H
OH
H
OH
H
O
H
OHH
OH
CH2
CH2OH
HOHO
 SACAROSE
(NÃO REDUTOR)
O
CH2OH
H
OH
H
H
OH
OH
H
OH
H
HO
H
OHH
OH
CH2
CH2OH
HO
H
GLICOSE
+
FRUTOSE
REDUTORES
e Menten. Essa enzima é dita de características michaelianas e obedece à expressão 
de velocidade apresentada acima. Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de 
saturação do substrato. Nestas circunstâncias, o sistema tende a adquirir velocidade de 
reação máxima (Vmáx), grandeza que é função da concentração inicial da enzima livre 
(E). Podemos também definir uma concentração de substrato na qual se obtém metade 
de Vmáx. Esse valor de [S] é numericamente igual ao KM, parâmetro que dentro de 
certos limites mede a afinidade da enzima pelo substrato. O método mais preciso para a 
determinação gráfica dessas grandezas é 
através do gráfico de duplo-recíproco 
(Lineweaver-Burk). Para tanto se deve plotar 
1/V em função de 1/[S] (Figura 17). 
 
Figura 17. Gráfico de Lineweaver-Burk da 
invertase de Saccharomyces cerevisiae. 
 
 
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA: 
Determinação da atividade enzimática da invertase de levedura. 
 
 CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇÚCAR REDUTOR: 
 
1. Objetivo: 
 A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para 
determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase. 
 
2. Princípio do experimento: 
A invertase é uma enzima hidrolítica que catalisa a hidrólise da sacarose, dando 
como produto a glicose e a frutose. A sacarose é um dissacarídeo não-redutor assim 
para cada molécula de sacarose hidrolisada, duas moléculas redutoras são formadas 
(Figura 18). 
 
 
 
 
 
 
Figura 18: Esquema geral da reação da invertase. 
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
1/S
1/
V
33 
 
O nome da invertase foi dado a esta enzima porque ao hidrolisar a sacarose 
liberando glicose e frutose, ocorre uma inversão do sinal da rotação óptica de positivo 
para negativo sendo denominado açúcar invertido. A sacarose tem um desvio de 
+66,5, a glicose de +52,7 enquanto o desvio da frutose é de -92, portanto após a 
hidrólise, a rotação óptica que era de 66,5 passa a ser -39,3. As propriedades 
químicas da sacarose e do açúcar invertido são bem diferentes quanto ao poder 
edulcorante, solubilidade e poder redutor. 
As enzimas que catalisam a hidrólise da sacarose são largamente distribuídas. 
As mais conhecidas são a invertase de leveduras e a sacarase intestinal. Sendo um 
açúcar não redutor, pode-se medir a atividade hidrolítica da enzima pelo aparecimento 
de açúcar redutor (glicose mais frutose) após a incubação com a enzima. Para 
determinar a quantidade de açúcar redutor formado, basta utilizar uma curva-padrão de 
açúcar redutor elaborado nas mesmas condições. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reativo de Somoggy 
- Solubilizar 28g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO4) e 40g de tartarato duplo de 
sódio e potássio (C4H4O6NaK) em 500mL de água destilada; adicionar 100mL de 
hidróxido de sódio (NaOH) 1M, dissolver 8,0g de sulfato de cobre cristalizado em 
80mL de água destilada e adicionar lentamente com agitação. Após, acrescentar 
180g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume para 
1000mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se 
necessário. Manter em frasco âmbar. 
Reativo de Nelson 
- Solubilizar 50g de molibdato de amônio [(NH4).MoO4] em 800mL de água 
destilada; adicionar 52mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado lentamente com 
agitação. Após, dissolver 3,0g de arseniato de sódio (Na2HAsO4.7H2O) em 50mL de 
água destilada, adicionar à solução acima e homogeneizar. Completar o volume 
para 1000mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em 
frasco âmbar. 
Glicose 0,02% (0,2 mg/mL) 
- Pesar 0,02g de glicose, solubilizar em água destilada e completar o volume para 
100mL em um balão volumétrico. 
 
 
 
 
34 
 
4. Procedimento: 
 Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes 
conforme a tabela abaixo:Tubos H2O 
(mL) 
glicose 
(mL) 
Somoggy 
(mL) 
 
 
 
Agitar bem e 
levar ao 
banho-maria 
fervente 
(100C) por 
10 min 
Nelson 
(mL) 
H2O 
(mL) 
glicose 
(mg/mL) 
Abs 
(530 nm) 
B 1,0 0 1,0 1,0 7,0 
1 0,8 0,2 1,0 1,0 7,0 
2 0,6 0,4 1,0 1,0 7,0 
3 0,4 0,6 1,0 1,0 7,0 
4 0,2 0,8 1,0 1,0 7,0 
5 0 1,0 1,0 1,0 7,0 
 
 Esta curva servirá para determinar a concentração do açúcar redutor produzido a 
partir da sacarose por ação da invertase; 
 Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorvância x concentração de 
glicose). 
 
 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA NA AMOSTRA PROTÉICA 
DESCONHECIDA 
 
1. Objetivo: 
Neste experimento será determinada se a amostra protéica entregue 
anteriormente possui atividade de invertase. 
 
2. Reagentes e preparo das soluções: 
Sacarose 0,4M 
- Pesar 0,412g de sacarose (C12H22O11), dissolver em tampão fosfato 0,1M (pH 5,0) 
e completar o volume para 100 mL em um balão volumétrico. 
Preparo da enzima padrão (invertase) 
- Pesar 10 g de levedura seca (Saccharomyces cerevisiae), colocar num balão de 
50mL e completar o volume com água destilada; 
- Levar ao banho-maria a 37 C para autólise por 1,5h. A seguir, centrifugar a 
suspensão por 40 min a 3.500rpm, desprezar o sedimento e centrifugar novamente; 
- Guardar o sobrenadante para os ensaios enzimáticos (os ensaios serão 
realizados com a enzima diluída 500 x (1:500). 
 
35 
 
3. Procedimento: 
 Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo: 
 
Tubo tampão 
fosfato 
de sódio 
0,1M pH 
5.0 (mL) 
sacarose 
(mL) 
amostra 
 (mL) 
enzima 
 (mL) 
 
Agitar 
bem e 
levar ao 
banho-
maria 
por 15 
min/ 
37oC 
Somoggy 
(mL) 
 
 
Agitar bem 
e levar ao 
banho-
maria 
fervente 
(100C) 
por 10 min 
Nelson 
(mL) 
H2O 
(mL) 
B 0,5 2,0 0 0 1,0 1,0 5,5 
CP 0 2,0 0 0,5 1,0 1,0 5,5 
A 0 4,0 0,5 0 1,0 1,0 5,5 
Legenda: B (branco), CP (controle positivo) e A (amostra desconhecida). 
 
 Ler as absorvâncias em 530nm; 
 Determinar a concentração de açúcar redutor através da curva padrão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
 CONSTRUÇÃO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN E CÁLCULO DO 
GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK: 
 
1. Objetivo: 
 Determinação dos parâmetros cinéticos KM (constante de Michaelis) e Vmáx 
(velocidade máxima). 
 
2. Procedimento: 
 Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo: 
 
Tubo tampão 
(mL) 
sacarose 
(mL) 
enzima 
 (mL) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agitar 
bem e 
levar ao 
banho-
maria 
por 15 
min/ 
37oC 
Somoggy 
(mL) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agitar bem 
e levar ao 
banho-
maria 
fervente 
(100C) 
por 10 min 
Nelson 
(mL) 
H2O 
(mL) 
Abs (530 nm) 
B1 2,4 0,1 - 1,0 1,0 5,5 
 
1 1,9 0,1 0,5 1,0 1,0 5,5 
 
B2 2,3 0,2 - 1,0 1,0 5,5 
 
2 1,8 0,2 0,5 1,0 1,0 5,5 
 
B3 2,1 0,4 - 1,0 1,0 5,5 
 
3 1,6 0,4 0,5 1,0 1,0 5,5 
B4 1,7 0,8 - 1,0 1,0 5,5 
 
4 1,2 0,8 0,5 1,0 1,0 5,5 
 
B5 0,9 1,6 - 1,0 1,0 5,5 
5 0,4 1,6 0,5 1,0 1,0 5,5 
B6 0,5 2,0 - 1,0 1,0 5,5 
6 0 2,0 0,5 1,0 1,0 5,5 
 
 Construir os gráficos de Michaelis-Menten (velocidade inicial x concentração de 
sacarose) e de Lineweaver-Burk (1/V0 x 1/S); 
 Calcular as constantes cinéticas. 
 
 
 
 
 
 
 
37 
 
ANÁLISES QUALITATIVAS DE CARBOIDRATOS 
 
INTRODUÇÃO: 
Muitas moléculas biológicas são macromoléculas, que são polímeros de alto 
peso molecular constituídos pela repetição de unidades menores, chamados 
monômeros. Estas macromoléculas se apresentam em grande variedade quanto ao 
tamanho, função e características químicas. 
Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes da terra. A cada ano, a 
fotossíntese converte mais de 100 bilhões de toneladas e CO2 e H2O em celulose e 
outros componentes vegetais. Certos carboidratos (açúcar comum e amido) são a base 
da dieta na maior parte do mundo e a oxidação dos carboidratos é a principal via 
metabólica fornecedora de energia para a maioria das células não fotossintéticas. Além 
disso, essas moléculas podem apresentar um papel estrutural como na síntese de 
paredes celulares, material de reserva como o amido e glicogênio e ainda serem 
utilizados na síntese de compostos não glicídicos, ácidos nucleicos e cofatores. 
Os carboidratos são, predominantemente, polihidroxialdeídos ou 
polihidroxicetonas cíclicos, ou substâncias que liberam esses compostos por hidrólise. 
Muitos carboidratos, mas não todos, têm fórmulas empíricas (CH2O)n; alguns também 
contêm nitrogênio, fósforo ou enxofre. 
Os carboidratos estão divididos em três classes principais de acordo com o seu 
tamanho: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos (a palavra “sacarídeo” 
é derivada do grego sakcharon que significa “açúcar”). Os monossacarídeos, ou 
açúcares simples, consistem em uma única unidade de poliidroxialdeído ou cetona 
(Figura 19). O monossacarídeo mais abundante na natureza é o açúcar com seis 
átomos de carbono na molécula, a D-glicose, também chamada dextrose. 
 
Figura 19: Dois açúcares de seis carbonos (hexoses). O grupo carbonila aparece sombreado 
em vermelho em cada uma das estruturas. A glicose é uma aldoexose ao passo que a frutose é 
uma cetoexose. 
38 
 
Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente 
suaves, tais como os íons férrico (Fe3+) e cúprico (Cu2+). Tal característica faz dos 
monossacarídeos agentes redutores. 
Observa-se que os açúcares que apresentam a hidroxila livre no C-1 são bons 
agentes redutores (Figura 20). Por esse motivo a extremidade que contém a hidroxila 
livre passa a ser chamada extremidade redutora e o açúcar, de AÇÚCAR REDUTOR. A 
capacidade que esses compostos apresentam de reduzir íons metálicos em soluções 
alcalinas é um bom método de identificação desses compostos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 20: Açúcares redutores e não redutores. 
 
Os oligossacarídeos são compostos por cadeias curtas de unidades 
monossacarídicas, unidas entre si por ligações características, chamadas ligações 
glicosídicas. Os mais abundantes são os dissacarídeos, formados por duas unidades de 
monossacarídeos (Figura 21). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 21: O dissacarídeo lactose. A lactose é um dissacarídeo muito comum, encontrado no 
leite. Ela é formada por duas unidades monossacarídicas distintas (galactose e glicose) unidas 
por uma ligação glicosídica. 
39 
 
 Outro dissacarídeo extremamente abundante é a sacarose, ou açúcar de cana. 
A sacarose é composta pelos monossacarídeos, com seis átomos de carbono, glicose e 
frutose. Todos os monossacarídeos e dissacarídeos comuns têm nomes que terminam 
com o sufixo “-ose”. Os polímeros de açúcares têm uma variação progressiva de 
tamanho de cadeia. Aqueles que contêm mais de 20 unidades são chamados 
polissacarídeos. Os polissacarídeos podem ter cadeias contendo centenas ou 
milhares de unidades monossacarídicas unidas por ligações glicosídicas (Figura 22). 
Alguns como a celulose, têm cadeias lineares, enquanto outros, como o amido, têm 
cadeias ramificadas. Os polissacarídeos de origem vegetal, amido e celulose, consistem 
em unidades repetitivas de D-glicose, mas diferem entre si no tipo de ligação 
glicosídica, consequentemente, têm propriedades e funções biológicas diferentes. 
Figura 22: Os dois polissacarídeos do amido, a amilose e a amilopectina. (a) Um pequeno 
segmento de amilose, um polímerolinear composto por unidades de D-glicose unidas por 
ligações glicosídicas do tipo (α14). Uma única cadeia do polímero pode conter vários milhares 
de unidades de glicose. A amilopectina tem ligações semelhantes à amilose nas unidades entre 
os pontos de ramificação. (b) No ponto de ramificação, a amilopectina tem uma ligação (α16). 
(c) Um agregado de amilose e amilopectina como se acredita que ocorra nos grânulos de amido. 
As fibras de amilopectina (vermelho) formam estruturas em dupla hélice umas com as outras ou 
com as fibras de amilose (azul). 
 
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA 
Identificar os carboidratos presentes em diferentes amostras dadas. Determinar 
algumas de suas propriedades químicas. 
 
 
40 
 
I. TESTE DE BENEDICT: 
 
1. Objetivo: 
 Identificar se amostra apresenta açúcar redutor (monossacarídeos e 
dissacarídeos redutores) em sua composição. 
 
2. Princípio do método: 
O “Reagente de Benedict” (também chamado de Solução de Benedict) é um 
reagente químico de cor azulada, desenvolvido pelo químico americano Stanley 
Rossiter Benedict, geralmente usado para detectar a presença de açúcares redutores, 
nos quais se incluem os monossacarídeos glicose, frutose, galactose e manose, bem 
como os dissacarídeos maltose e lactose. O Reagente de Benedict consiste, 
basicamente, de uma solução de sulfato cúprico em meio alcalino, podendo ser 
preparado através do carbonato de sódio, citrato de sódio e sulfato cúprico. 
A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores podendo ser 
esquematizada de forma simplificada como mostrado a seguir: 
 
 
 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reagente de Benedict 
- Pesar 17,3g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O), 173g de citrato de sódio (Na3C6H5O7), 
100g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3), dissolver em água destilada e completar o 
volume para 1000mL em um balão volumétrico. 
 
4. Procedimento: 
 Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo: 
 
Tubos H2O (mL) 
Soluções de 
Carboidratos (mL) 
Reagente de 
Benedict (mL) 
Resultados 
B 0,2 ----- 1,0 
CP ----- 0,2 1,0 
CN ----- 0,2 1,0 
A ----- 0,2 1,0 
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - açúcar redutor); CN (Controle Negativo – 
açúcar não redutor) e A (Amostra). 
Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O 
Precipitado 
vermelho 
41 
 
 Aquecer os tubos em banho fervente (100 oC) por 5 minutos; 
 O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração vermelho. 
 
II. TESTE DE SELLIWANOFF: 
 
1. Objetivo: 
Identificar se a amostra é uma aldose ou uma cetose. A reação é positiva para 
cetoses. Aldoses também reagem, no entanto, de forma muito mais lenta do que as 
cetoses. 
 
2. Princípio do método: 
O teste de Selliwanoff segue os mesmos princípios teóricos que embasam a 
reação de Molisch, onde há formação de furfural e hidroximetilfurfural (HMF). Como 
esses dois produtos, isoladamente, são incolores, adiciona-se um composto fenólico ao 
meio para que seja desenvolvida coloração visível (vermelho intenso). A reação de 
Seliwanoff só diferencia-se da reação de Molisch nos reagentes utilizados: o ácido que 
causará a desidratação do carboidrato é o ácido clorídrico (HCl) e o fenol que reage 
como o furfural e com o hidroximetilfurfural é o resorcinol (Figura 23). 
Esse teste permite diferenciar aldoses de cetoses porque a reação com a 
cetose é mais rápida e mais intensa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 23: Formação do hidroximetilfurfural e resorcinol. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reativo Seliwanoff 
- Dissolver 0,5g de resorcinol (C6H6O2) em 1000 mL de ácido clorídrico (HCl) 6M. 
Ácido clorídrico 6M (utilizar banho de gelo) 
- Adicionar aproximadamente 350mL de água destilada em um balão volumétrico de 1000mL 
e em banho de gelo adicionar 510mL de ácido clorídrico (HCl) P.A cuidadosamente. 
Completar o volume para 1000mL. 
 
cetohexose 
OHOH2C
H
H
CH2OHOH H
OHH
OHOH2C
COH
HH
hidroximetilfurfural 
H2O 
OH
OH
resorcinol 
Produto de 
coloração vermelha 
42 
 
4. Procedimento: 
 Em um tubo de ensaio, adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo: 
 
Tubo H2O (mL) Soluções de 
Carboidratos (mL) 
Reagente de 
Selliwanoff (mL) 
Resultados 
B 0,2 ----- 1,0 
CP ----- 0,2 1,0 
CN ----- 0,2 1,0 
A ----- 0,2 1,0 
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - cetose); CN (Controle Negativo - aldose) 
A (Amostra). 
 
 Aquecer os tubos em banho fervente (100 oC) por 2 minutos; 
 Observar os tubos durante a fervura; 
 O teste é positivo se houver o desenvolvimento de coloração vermelha. 
 
III. TESTE DO IODO 
 
1. Objetivo: 
O objetivo do teste é permitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra 
contendo o polissacarídeo amido. 
 
2. Princípio do método: 
O amido é um polissacarídeo composto por dois tipos de cadeia: amilose e 
amilopectina. Moléculas de alto peso molecular (como a amilose e a amilopectina) 
podem sofrer reações de complexação, com formação de compostos coloridos. Um 
exemplo importante é a complexação da amilose e da amilopectina com o iodo (Figura 
24), resultando em complexo verde azulado e vermelho-violáceo, respectivamente. A 
figura a seguir esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido. 
 
 
Figura 24: Complexação do iodo à estrutura supramolecular do amido. 
43 
 
O grau de adsorção do I2 a partir da solução diluída de KI-I2 pela amilose nativa 
é de 19-20% enquanto a amilopectina adsorve 0,5%. O mecanismo de reação envolve a 
inclusão de um arranjo linear de poli KI-I2 na hélice da amilose. Para que a cor azul 
apareça é necessário que a amilose tenha no mínimo 40 resíduos de glicose. Cadeias 
pequenas de amilose ou amilopectina também adsorvem o I2 desde que sejam 
utilizadas soluções mais concentradas de KI-I2. 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Lugol (KI-I2) 
- Pesar 5,0g de iodo (I2) e 10g de iodeto de potássio (KI), dissolver em água destilada e 
completar o volume para 1000mL em um balão volumétrico. 
 
4. Procedimento: 
 Em um tubo de ensaio, adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo: 
 
Tubo H2O (mL) Soluções de 
Carboidratos (mL) 
LUGOL (gotas) Resultados 
B 2,0 ----- 2 
CP ----- 2,0 2 
CN ----- 2,0 2 
A ----- 2,0 2 
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - amido); CN (Controle negativo – glicose); 
A (Amostra). 
 Aguardar 30 segundos à temperatura ambiente; 
 O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração roxo-azulada. 
 
IV. TESTE DE BARFOED MODIFICADO: 
 
1. Objetivo: 
Identificar monossacarídeos. 
 
2. Princípio do método: 
A reação é feita utilizando acetato de cobre em meio de ácido láctico (reagente 
de Barfoed) à quente por 30 segundos. O produto formado nesta primeira etapa é 
posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Apenas os monossacarídeos 
formam o produto de coloração azul. A adição de ácido fosfomolíbdico leva à formação 
de um complexo corado de azul escuro. A reação também ocorre com dissacarídeos 
44 
 
redutores, mas de forma mais lenta. Desta forma, o teste permite diferenciar 
monossacarídeos redutores de dissacarídeos redutores. 
 
 
 
 
 
3. Reagentes e preparo das soluções: 
Reagente de Barfoed modificado 
- Dissolver 48g de acetato cúprico ((CH3COO)2.Cu.H2O) em 900mL de água destilada 
quente, adicionar lentamente 50mL de ácido lático (C3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o 
volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Filtrar se necessário. 
ReagenteFosfomolíbdico 
- Dissolver 150g de ácido molíbdico (H2MoO4) e 75g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) 
em 500mL de água destilada quente com agitação. Aquecer até ebulição. Filtrar. 
- Adicionar 300mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85%. Completar o volume para 1000mL em 
um balão volumétrico. 
 
4. Procedimento: 
 Em um tubo de ensaio, adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo: 
 
Tubo H2O (mL) Soluções de 
Carboidratos (mL) 
Reagente de 
Barfoed (mL) 
 
 
Aquecer os 
tubos a 
100ºC/30seg 
Reagente 
Fosfomolíbdico 
(mL) 
Resultados 
B 0,2 ----- 1,0 0,5 
CP ----- 0,2 1,0 0,5 
CN ----- 0,2 1,0 0,5 
A ----- 0,2 1,0 0,5 
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo – monossacarídeo redutor); CN (Controle 
negativo – dissacarídeo redutor); A (Amostra). 
 
 O teste é positivo ocorre se houver o desenvolvimento da coloração azul escuro. 
 
 
 
 
 
Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O 
H3PO4.12 MoO3 
Complexo de cor 
azul escuro 
45 
 
FERMENTAÇÃO 
 
INTRODUÇÃO: 
Os seres vivos transformam energia química dos alimentos em energia sob a 
forma de ATP que poderá ser utilizado para realizar trabalhos que permitem a 
manutenção do estado vital das células e dos órgãos (biossíntese de macromoléculas, 
contração muscular, transporte através de membranas, etc.). A esse conjunto de reações 
de transformações energéticas que ocorre em uma célula dá-se o nome de metabolismo. 
O metabolismo pode ser aeróbico ou anaeróbico. No primeiro caso, as reações ocorrem 
na presença de oxigênio e a síntese de ATP ocorre em mitocôndrias operantes no caso 
de células eucarióticas. Esse processo denominado respiração celular, quando completo, 
transforma a matéria ingerida em CO2 e H2O. Quando a degradação ocorre parcialmente 
e não chegando aos produtos finais CO2 e H2O e o metabólito intermediário é excretado, 
temos a fermentação, um processo independente de mitocôndria, podendo ser aeróbico 
ou anaeróbico. Um exemplo é a fermentação da glicose pela levedura gerando álcool que 
ocorre em anaerobiose, onde o álcool é excretado para o meio de cultura. 
A fermentação pode ser considerada um processo de obtenção de energia a 
partir da oxidação de compostos orgânicos utilizando um aceptor de elétrons endógeno. 
Como o processo é parcial, há apenas uma pequena fração de energia liberada. Nas 
fermentações, o ATP é gerado a partir da fosforilação ao nível de substrato 
Praticamente todas as células conhecidas metabolizam glicose e várias hexoses 
através da via glicolítica (Figura 25). Esta via metabólica é composta de uma sequência 
de 10 reações catalisadas por diferentes enzimas e resumidamente, é a via de conversão 
de glicose em piruvato. Seus produtos finais, além do piruvato, são duas moléculas de 
ATP e duas moléculas de NAD reduzido. 
46 
 
Glicose Frutose 6-fosfatoGlicose 6-fosfato
hexoquinase
ATP ADP
Mg+2
Fosfoglicose 
isomerase
Frutose 1,6-difosfato
fosfofrutoquinase
ATP
ADP
Mg+2
aldolase
Gliceraldeído 
3-fosfato
Dihidroxiacetona 
fosfato
Fosfotriose isomerase
1,3-
difosfoglicerato
Gliceraldeído 3-fosfato 
desidrogenase
NAD+ NADH + H
+
Fosfoglicerato 
quinase
ATP
ADP
Mg+2
3-fosfoglicerato
Fosfoglicerato 
mutase
2-fosfogliceratofosfoenolpiruvato
enolase
Mg+2
H2O
piruvato
ATP
ADP
Mg+2
Piruvato 
quinase
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 25: Via glicolítica. 
 
O ATP produzido na via glicolítica será rapidamente utilizado nos processos 
celulares que demandam energia, sendo convertidos em ADP + Pi, substratos 
necessários para a via glicolítica. O NAD reduzido deve ser re-oxidado a NAD+ para que 
a via glicolítica possa continuar operando. Depois de produzido, o piruvato pode ter os 
seguintes destinos: 
 
 
 
 
 
 
 
34 ATP 
Alcoólica Láctica 
Fermentação 
Glicose 
2 piruvato 
2 ATP 
Respiração aeróbica 
Ciclo de Krebs 
Cadeia transportadora 
2 ATP 
47 
 
A fermentação difere da respiração celular, pois nesta última o aceptor de 
elétrons é exógeno (oxigênio) e sua captação é realizada via uma cadeia transportadora 
de elétrons. Dessa forma, após a quebra da glicose originando piruvato, este pode ser 
convertido a outro composto orgânico. Por esse motivo, a fermentação é um processo 
que não depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia transportadora de elétrons. Neste tipo 
de reação, os elétrons são transferidos das coenzimas reduzidas (NADH, NADPH e 
FADH2) ao piruvato ou derivados, regenerando-os para novos ciclos de glicólise. 
A fermentação não precisa necessariamente ocorrer em ambiente anaeróbico 
(sem oxigênio). Mesmo em presença de grandes quantidades de oxigênio, leveduras 
preferencialmente realizam a fermentação em detrimento da fosforilação oxidativa. 
Carboidratos são os substratos mais comuns da fermentação e os dois principais tipos 
de fermentação são a alcoólica e a láctica, mas vários microrganismos utilizam a 
fermentação produzindo compostos diferentes como o ácido butírico e acetona. 
 
Fermentação alcoólica (leveduras e algumas espécies de bactérias): 
 
 
 
 
 
 
Figura 26: Fermentação alcoólica. 
 
 
 
 
A quebra do piruvato leva a produção de etanol e dióxido de carbono. É um tipo 
importante de processo para a fabricação de pães, cerveja e vinho (Figura 26). 
 
Fermentação láctica 
A quebra do piruvato leva a formação de ácido láctico (Figura 27). Ocorre em 
músculos de animais quando há necessidade de geração de energia rápida. Em 
repouso a célula muscular produz um excesso de ATP, que transmite sua energia para 
outro composto, a creatina fosfato, que é mais estável, permanecendo por mais tempo 
armazenado na célula. Em uma contração, este composto cede energia para a 
produção de ATP. 
48 
 
 
 
 
 
Figura 27: Fermentação láctica. 
 
 
 
 
 
 
Ocorre também em bactérias (como lactobacilos) e alguns fungos. Bactérias que 
convertem lactose em ácido láctico dão o sabor característico dos iogurtes. Estas 
bactérias podem ser classificadas como homofermentativas (produzem apenas lactato) 
ou heterofermentativas (produzem além do lactato, outros produtos como dióxido de 
carbono, acetato, ácido fórmico, etc.). 
Existem vários outros tipos de fermentação, além da alcoólica e da láctica, que 
são observados em diferentes microrganismos: 
 Propiônica: produtos finais: ácido propiônico, ácido acético e CO2 
(Propionibacterium, Veillonella). 
 Acetona-Butírica: ácido butírico, acetona, butanol, isopropanol, ácido acético, 
ácido fórmico, etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus). 
 Acética: acético, glucônico (Acetobacter). 
 Aerogenes-coli-tífico: ácidos fórmico, acético, láctico e succínico, etanol, 2,3-
butilenoglicol, H2 e CO2 (Escherichia, Enterobacter, Salmonella). 
 
Certas substâncias complexas como algumas enzimas, antibióticos e vitaminas, 
cuja obtenção por síntese química é bastante onerosa, e às vezes até impossível, 
podem ser obtidas através de processos fermentativos. Os processos fermentativos têm 
apresentado um significativo desenvolvimento, tanto em relação aos microrganismos 
fermentativos como o processo fermentativo em si, sendo estes objetos de estudo de 
áreas como microbiologia, bioquímica e engenharia bioquímica. 
 
1. Objetivo: 
Analisar o consumo temporal de glicose por células de Saccharomyces 
cerevisiae como uma forma indireta de se determinar a capacidade fermentativa dessas 
células. 
49 
 
2. Princípio