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Slide 3 - Cultivo e Conservação de microrganismos

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Cultivo, Conservação e Ativação de 
Cepas Microbianas
Prof. Edmar das Mercês Penha
1. Introdução (a)
• Os microrganismos estão presentes em toda parte, ar,
água, solo, organismo humano, em geral como culturas
mistas, isto é, diferentes tipos e espécies microbianas
juntas.
• Em processos industriais prefere-se, sempre que• Em processos industriais prefere-se, sempre que
póssível, utilizar culturas puras.
• Para isolar, identificar, cultivar, e conservar culturas
microbianas é necessário aplicar diversas técnicas e
conhecimentos relacionados a fisiologia microbiana e
microscopia, entre outros.
1. Introdução (b)
• A avaliação macroscópica do aspecto da cultura
(colônia) é muito importante, pois diferentes tipos de
microrganismos crescendo no mesmo meio podem
apresentar-se completamente distintos.
• Para observar as características culturais, portanto,• Para observar as características culturais, portanto,
necessita-se de culturas puras.
• Cultura pura é aquela formada por uma população 
derivada de uma única célula parental (original).
• Cultura axênica é aquela formada por indivíduos de uma 
mesma espécie.
2. Cultura Pura
• A obtenção de uma cultura pura representa uma
condição artificial imposta por manipulações no
laboratório, a fim de obter uma espécie isolada.
• Os laboratórios microbiológicos de universidades,
instituições de pesquisa ou indústria, têm interesse eminstituições de pesquisa ou indústria, têm interesse em
manter sua própria coleção de culturas puras, em
condições viáveis, por um longo período de tempo.
• Estas culturas são necessárias para aulas, pesquisas,
como reagentes, em estudos taxionômicos e como
culturas de referência.
3. Fatores importantes na escolha de m-
os para aplicação industrial
• 3.1- VIABILIDADE - A cultura deve permanecer viva por longo
período de tempo e ter capacidade de crescimento em meio
sintético.
• 2.2 - ESTABILIDADE - Além de permanecer viável, é importante
que suas características sejam mantidas.que suas características sejam mantidas.
• Variação - alteração reversível
• Mutação - alteração irreversível; há modificação nas bases
nitrogenadas do DNA celular.
• 2.3 - POTÊNCIA - Capacidade de produção do metabólito desejado
com alta produtividade.
• 2.4 - INOCUIDADE - Não ser patogênico.
4. Métodos de Isolamento de Cultura Pura
• 4.1 - Sementeira em Superfície
• Com uma alça de platina, coloca-se uma porção do inóculo na
superfície de um meio com agar e espalha-se o mesmo sobre o
meio, a fim de distribuir os microrganismos de forma a separar bemmeio, a fim de distribuir os microrganismos de forma a separar bem
as células individuais. Assim, apenas uma pequena porção do
material pode ser espalhada na superfície do meio, para que se
tenha uma colônia originando-se de uma única célula.
• 4.2 - Técnica da Placa Derramada
• Em tubos contendo agar liquefeito (450C), colocam-se alíquotas da
suspensão microbiana, em diluições sucessivas.
• Estas técnicas podem ser mais eficazes quando já se sabe que
microrganismo se deseja isolar, pois podem ser utilizados meios
seletivos ou diferenciais.
• 4.3 - Técnica do Enriquecimento
• O microrganismo desejado encontra-se em pequena quantidade e
apresenta crescimento mais lento em relação às outras espécies.apresenta crescimento mais lento em relação às outras espécies.
Fornece-se, então, um meio especial e condições ambientais próprias
para o desenvolvimento da cultura desejada.
• 4.4 - Técnica das Diluições Sucessivas
• Quando o microrganismo desejado está presenteem número maior do
que os demais, efetuam-se diluições sucessivas em meio adequado.
Quando muito diluído, o meio só deverá conter a espécie
predominamte. Para garantir, pode realizar a sementeira.
5. Métodos de Conservação
• O método aplicável a uma cultura pode não ser
aplicável a outras. É necessário que as
características da espécie sejam preservadas talcaracterísticas da espécie sejam preservadas tal
como foram determinadas no momento do
isolamento.
• 5.1 - Transferência Periódica para Meios Novos (Repiques
Sucessivos)
• As culturas podem ser mantidas em tubos inclinados, onde são
cultivadas, e, periodicamente, transferidas para meios novos
(com a mesma composição). Os tubos são preparados com um
meio adequado para estocagem, adicionados de agar e
esterilizados. Após o resfriamento (efetuado com o tuboesterilizados. Após o resfriamento (efetuado com o tubo
inclinado a fim de aumentar a superfície para crescimento
microbiano), inocula-se, em condições assépticas, o
microrganismo.
• Algumas culturas são mantidas por essa técnica por até 1 ano.
A principal desvantagem é a possibilidade de contaminação e
mutação.
• 5.2 - Conservação Sob Camada de Óleo Mineral
• Pode-se cobrir o crescimento em tubo inclinado com óleo
mineral estéril. Apesar de conservar por mais tempo, não é uma
técnica muito usado.
• 5.3 - Liofilização
• Consiste no congelamento (-400C) da suspensão celular,
seguida de secagem a baixas temperaturas sob alto vácuo
(sublimação). Tem-se a cultura na forma de um pó, que permite
maior sobrevivência da mesma, menor possibilidade de
alteração das características culturais e necessidade de
pequena área para estoque. Culturas podem ser preservadas
por até 20 anos.
• 5.4 - Temperaturas Baixas
• É efetuado um congelamento das células, porém
com adição de um agente protetor (glicerol ou dimetil
sulfóxido) que impede a formação de cristais de água
que danificariam as células. A suspensão congeladaque danificariam as células. A suspensão congelada
é mantida em refrigeradores de nitrogênio líquido. É
eficaz inclusive para algumas espécies que não
podem ser mantidas por liofilização.
6. Ativação de Culturas
• Para utilização industrial de uma cultura estoque
é necessário ativá-la de modo a diminuir a fase
lag (fase de adaptação do cultivo ao meio). Issolag (fase de adaptação do cultivo ao meio). Isso
vai possibilitar um menor tempo de processo e
maior produtividade.
• As principais técnicas utilizadas são:
• 6.1 - Exaltação da Fase Metabólica
• A partir da cultura original, são realizados repiques
sucessivos, isto é, transferência para meios de crscimento
novos (com a mesma composição do meio a ser utilizado
no processo), sempre aumentando de escala. Passa-se
de tubo de ensaio para erlenmeyer, fermentador dede tubo de ensaio para erlenmeyer, fermentador de
bancada e assim sucessivamente, até chegar ao volume
de inóculo do fermentador industrial. A transferência deve
ser feita na fase exponencial do crescimento.
• Ex: Lactobacillus casei em soro de leite
• 6.2 - Choque Térmico
• É utilizado para microrganismos esporulados, forma
pela qual estes são geralmente conservados. Para
ativá-los, efetua-se um choque térmico (aquecimento
rápido a cerca de 900C) e a seguir incuba-se pararápido a cerca de 90 C) e a seguir incuba-se para
que as células vegetativas germinem.
• Ex: Clostridium acetobutilycum que produz solventes
orgânicos a partir de amido ou melaço.
7. Principais Coleções de Culturas
• KRAL - 1900 (Praga)
• ATCC - American Type Culture Collection - EUA
• Instituto Pasteur - Paris
• National Collection Of Type Cultures - Londres
• Japanese Type Culture Collection - Tóquio
• Coleções com finalidades específicas
• Northern Utilization Research and Development Division -
leveduras, bolores e bactérias para fermentações.
• Quatermaster Research and Development Center -
microrganismos envolvidos em processos de deterioração.

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