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Cultivo, Conservação e Ativação de Cepas Microbianas Prof. Edmar das Mercês Penha 1. Introdução (a) • Os microrganismos estão presentes em toda parte, ar, água, solo, organismo humano, em geral como culturas mistas, isto é, diferentes tipos e espécies microbianas juntas. • Em processos industriais prefere-se, sempre que• Em processos industriais prefere-se, sempre que póssível, utilizar culturas puras. • Para isolar, identificar, cultivar, e conservar culturas microbianas é necessário aplicar diversas técnicas e conhecimentos relacionados a fisiologia microbiana e microscopia, entre outros. 1. Introdução (b) • A avaliação macroscópica do aspecto da cultura (colônia) é muito importante, pois diferentes tipos de microrganismos crescendo no mesmo meio podem apresentar-se completamente distintos. • Para observar as características culturais, portanto,• Para observar as características culturais, portanto, necessita-se de culturas puras. • Cultura pura é aquela formada por uma população derivada de uma única célula parental (original). • Cultura axênica é aquela formada por indivíduos de uma mesma espécie. 2. Cultura Pura • A obtenção de uma cultura pura representa uma condição artificial imposta por manipulações no laboratório, a fim de obter uma espécie isolada. • Os laboratórios microbiológicos de universidades, instituições de pesquisa ou indústria, têm interesse eminstituições de pesquisa ou indústria, têm interesse em manter sua própria coleção de culturas puras, em condições viáveis, por um longo período de tempo. • Estas culturas são necessárias para aulas, pesquisas, como reagentes, em estudos taxionômicos e como culturas de referência. 3. Fatores importantes na escolha de m- os para aplicação industrial • 3.1- VIABILIDADE - A cultura deve permanecer viva por longo período de tempo e ter capacidade de crescimento em meio sintético. • 2.2 - ESTABILIDADE - Além de permanecer viável, é importante que suas características sejam mantidas.que suas características sejam mantidas. • Variação - alteração reversível • Mutação - alteração irreversível; há modificação nas bases nitrogenadas do DNA celular. • 2.3 - POTÊNCIA - Capacidade de produção do metabólito desejado com alta produtividade. • 2.4 - INOCUIDADE - Não ser patogênico. 4. Métodos de Isolamento de Cultura Pura • 4.1 - Sementeira em Superfície • Com uma alça de platina, coloca-se uma porção do inóculo na superfície de um meio com agar e espalha-se o mesmo sobre o meio, a fim de distribuir os microrganismos de forma a separar bemmeio, a fim de distribuir os microrganismos de forma a separar bem as células individuais. Assim, apenas uma pequena porção do material pode ser espalhada na superfície do meio, para que se tenha uma colônia originando-se de uma única célula. • 4.2 - Técnica da Placa Derramada • Em tubos contendo agar liquefeito (450C), colocam-se alíquotas da suspensão microbiana, em diluições sucessivas. • Estas técnicas podem ser mais eficazes quando já se sabe que microrganismo se deseja isolar, pois podem ser utilizados meios seletivos ou diferenciais. • 4.3 - Técnica do Enriquecimento • O microrganismo desejado encontra-se em pequena quantidade e apresenta crescimento mais lento em relação às outras espécies.apresenta crescimento mais lento em relação às outras espécies. Fornece-se, então, um meio especial e condições ambientais próprias para o desenvolvimento da cultura desejada. • 4.4 - Técnica das Diluições Sucessivas • Quando o microrganismo desejado está presenteem número maior do que os demais, efetuam-se diluições sucessivas em meio adequado. Quando muito diluído, o meio só deverá conter a espécie predominamte. Para garantir, pode realizar a sementeira. 5. Métodos de Conservação • O método aplicável a uma cultura pode não ser aplicável a outras. É necessário que as características da espécie sejam preservadas talcaracterísticas da espécie sejam preservadas tal como foram determinadas no momento do isolamento. • 5.1 - Transferência Periódica para Meios Novos (Repiques Sucessivos) • As culturas podem ser mantidas em tubos inclinados, onde são cultivadas, e, periodicamente, transferidas para meios novos (com a mesma composição). Os tubos são preparados com um meio adequado para estocagem, adicionados de agar e esterilizados. Após o resfriamento (efetuado com o tuboesterilizados. Após o resfriamento (efetuado com o tubo inclinado a fim de aumentar a superfície para crescimento microbiano), inocula-se, em condições assépticas, o microrganismo. • Algumas culturas são mantidas por essa técnica por até 1 ano. A principal desvantagem é a possibilidade de contaminação e mutação. • 5.2 - Conservação Sob Camada de Óleo Mineral • Pode-se cobrir o crescimento em tubo inclinado com óleo mineral estéril. Apesar de conservar por mais tempo, não é uma técnica muito usado. • 5.3 - Liofilização • Consiste no congelamento (-400C) da suspensão celular, seguida de secagem a baixas temperaturas sob alto vácuo (sublimação). Tem-se a cultura na forma de um pó, que permite maior sobrevivência da mesma, menor possibilidade de alteração das características culturais e necessidade de pequena área para estoque. Culturas podem ser preservadas por até 20 anos. • 5.4 - Temperaturas Baixas • É efetuado um congelamento das células, porém com adição de um agente protetor (glicerol ou dimetil sulfóxido) que impede a formação de cristais de água que danificariam as células. A suspensão congeladaque danificariam as células. A suspensão congelada é mantida em refrigeradores de nitrogênio líquido. É eficaz inclusive para algumas espécies que não podem ser mantidas por liofilização. 6. Ativação de Culturas • Para utilização industrial de uma cultura estoque é necessário ativá-la de modo a diminuir a fase lag (fase de adaptação do cultivo ao meio). Issolag (fase de adaptação do cultivo ao meio). Isso vai possibilitar um menor tempo de processo e maior produtividade. • As principais técnicas utilizadas são: • 6.1 - Exaltação da Fase Metabólica • A partir da cultura original, são realizados repiques sucessivos, isto é, transferência para meios de crscimento novos (com a mesma composição do meio a ser utilizado no processo), sempre aumentando de escala. Passa-se de tubo de ensaio para erlenmeyer, fermentador dede tubo de ensaio para erlenmeyer, fermentador de bancada e assim sucessivamente, até chegar ao volume de inóculo do fermentador industrial. A transferência deve ser feita na fase exponencial do crescimento. • Ex: Lactobacillus casei em soro de leite • 6.2 - Choque Térmico • É utilizado para microrganismos esporulados, forma pela qual estes são geralmente conservados. Para ativá-los, efetua-se um choque térmico (aquecimento rápido a cerca de 900C) e a seguir incuba-se pararápido a cerca de 90 C) e a seguir incuba-se para que as células vegetativas germinem. • Ex: Clostridium acetobutilycum que produz solventes orgânicos a partir de amido ou melaço. 7. Principais Coleções de Culturas • KRAL - 1900 (Praga) • ATCC - American Type Culture Collection - EUA • Instituto Pasteur - Paris • National Collection Of Type Cultures - Londres • Japanese Type Culture Collection - Tóquio • Coleções com finalidades específicas • Northern Utilization Research and Development Division - leveduras, bolores e bactérias para fermentações. • Quatermaster Research and Development Center - microrganismos envolvidos em processos de deterioração.
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