Apostila 3 - Fermentação Alcoólica

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS 
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA 
 
 
 
 
EDMAR DAS MERCÊS PENHA 
MÁRCIA MONTEIRO MACHADO GONÇALVES 
 
 
 
 
 
2014 
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1 - INTRODUÇÃO 
 
A fermentação alcoólica é o processo químico de transformação dos açúcares, 
principalmente a sacarose, glicose e frutose em álcool. Para que isto ocorra, entretanto, 
torna-se necessária a ação de micro-organismos para o desdobramento destes açúcares 
em álcool. 
Os principais micro-organismos produtores de álcool são as leveduras, 
principalmente linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Essas leveduras são fungos 
unicelulares formados por célula com um diâmetro médio em torno de 5 µm e que só 
podem ser vistas através de um microscópio. As leveduras, também conhecidas como 
fermento biológico, são micro-organismos aeróbios facultativos que, sob condições de 
anaerobiose, fermentam carboidratos a etanol e CO2. 
Qualquer produto que contenha açúcar ou outro carboidrato constitui-se em matéria-
prima potencial para obtenção de etanol. É necessário, entretanto, que seja viável 
economicamente. As matérias-primas podem ser classificadas como sacarinas, amiláceas e 
celulósicas. 
 
Matérias-Primas Sacarinas (ou açucaradas) 
Existem as diretamente fermentescíveis (cujos substratos são monossacarídeos) e as 
não diretamente fermentescíveis (cujos substratos são dissacarídeos). Os dissacarídeos são 
hidrolisados a monossacarídeos para que possam ser fermentados. Essa hidrólise é 
denominada de inversão. A sacarose é o principal dissacarídeo encontrado nas matérias-
primas açucaradas e é invertido a glicose e frutose pelas leveduras Saccharomyces 
cerevisiae, pois estas possuem as enzimas necessárias a esta inversão: as invertases, ou 
sacarases ou ainda beta-glicosidades. 
 
Hidrólise da sacarose 
C12H22O11 + H2O ------------------------→→→→ C6H12O6 + C6H12O6 
sacarose Invertase Glicose Frutose 
 
Fermentação alcoólica 
C6H12O6 ------------------------→→→→ 2 (H3C- CH2-OH) + 2 CO2 + Energia 
Monossacarídeo Etanol Gás carbônico 
 
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São exemplos de matérias-primas sacarinas: caldo de cana, melaço, sucos de frutas. 
 
Matérias-Primas Amiláceas 
O substrato é o amido, o qual somente será fermentado após uma hidrólise, 
denominada de sacarificação. Temos como exemplo: cereais (arroz, milho, cevada), 
tubérculos (mandioca, batata). 
 
Matérias-Primas Celulósicas 
Com relação às celulósicas, elas também necessitam ser hidrolisadas (a celulose 
também pode ser convertida em açúcares fermentescíveis). São exemplos: serragem, 
madeira e resíduos agrícolas. 
 
Principais Etapas da Fermentação Alcoólica 
Quando se fala em produção de etanol por fermentação, há que se pensar em quatro 
grandes etapas: 
• 1ª etapa - o preparo do inóculo, ou seja, a escolha e a propagação/adaptação do 
micro-organismo ao mosto que será fermentado por ele; 
• 2ª etapa - a de preparo do substrato, que é o tratamento da matéria-prima de forma 
que esta seja o mais facilmente metabolizável pelo micro-organismo agente da 
fermentação; 
• 3ª etapa - é a fermentação propriamente dita, onde se dá a transformação dos 
açúcares em álcool; 
• 4ª etapa - é a destilação, quando se recupera e purifica o álcool formado (etapa de 
downstream processing). 
 
 
2 – PREPARO DO INÓCULO 
 
Características do Agente da Fermentação 
A fermentação é o processo biológico que transforma açúcar em álcool. Esta 
transformação é realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae, também chamada de 
fermento de padaria ou fermento biológico, usada também na fabricação de cerveja, vinho 
e pães. 
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Em pequenas usinas, pode-se chegar a utilizar micro-organismos selvagens 
(provenientes da própria matéria-prima), porém normalmente são utilizadas leveduras 
selecionadas (cultura pura) ou levedura de panificação (fermento prensado). 
 
Preparo do Inóculo 
Partindo-se de uma cultura pura faz-se o repique sucessivo das mesmas para 
volumes crescentes de meio que podem conter concentrações crescentes do substrato. A 
cada repique incuba-se a uma temperatura e tempo pré-determinados (Figura 1). 
 
 
Figura 1. Propagação e adaptação de inoculo para fermentação alcoólica. 
 
Partindo-se da levedura de panificação podem ser utilizadas concentrações de 5 a 20 
gramas de fermento prensado por litro, para mostos com concentrações entre 13 e 15oBrix. 
Em outras situações, como no caso de uso de melaço quando os teores de sólidos 
solúveis devem ser diluídos para a faixa de 15-25oBrix, pode-se aumentar a concentração 
de inóculo (40g/L) e obter uma redução do tempo de fermentação (inóculo maciço). 
No processo, além do álcool, forma-se também grande quantidade de gás 
carbônico, de modo que o mosto parece estar em ebulição. Durante a fermentação o 
caldo de cana é chamado de mosto e, depois de fermentado, é chamado de vinho. 
 
13º Brix 
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Exigências Nutricionais e Ambientais 
As leveduras S. cerevisiae necessitam das seguintes condições nutritivas e 
ambientais para o seu bom desenvolvimento: 
 Fonte de carbono: carboidratos solúveis; 
 Fonte de nitrogênio: sais amoniacais; 
 Outros - fosfatos, sais de magnésio, potássio e cálcio; 
 Microelementos e fatores de crescimento ou vitaminas – Manganês, cobalto e 
vitaminas do complexo B; 
 Temperatura: mesófilas, 26 - 35o C - ideal na faixa de 25 a 28ºC; 
 pH: 4 - 5, sendo o processo normalmente conduzido a 5,5 que é o pH do melaço e do 
caldo de cana. 
 
 
3 - PREPARO DO MOSTO 
O melaço e o caldo de cana-de-açúcar ainda são as únicas matérias-primas de 
importância econômica imediata para produção de etanol industrial no Brasil. 
 
Cana de açúcar 
Existem muitas variedades de cana de açúcar disponíveis para plantio. A variedade 
mais indicada para cada caso depende de análise das características específicas do solo. 
Na prática, de qualquer cana será possível obter cachaça, porém, plantando a cana certa, 
maior será a produtividade. 
Saber a hora de colher a cana também é importante, e existem técnicas que nos 
auxiliam a estabelecer a época certa da colheita. Alguns mais antigos decidem "no olho" 
outros, ainda, dizem que é preciso "ouvir" o canavial. Para quem busca uma resposta 
mais científica a solução é realizar uma amostragem do canavial e medir o oBrix. O caldo 
de cana contém uma grande quantidade de açúcar dissolvido, o grau Brix é uma maneira 
de medir a quantidade de açúcar no caldo, quanto maior o Brix, mais açúcar dissolvido. 
 
1ºBrix = 1g de sacarose dissolvida em 100mL de amostra 
 
A cana é considerada madura quando o Brix estiver em 16% ou mais. Se você tiver 
um sacarimetro portátil, que mede o oBrix com apenas uma gota de caldo, o ideal é fazer 
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a medida com caldo da base e da ponta da cana. Quando a razão entre os dois for de 0,8 
ou maior a cana está madura. Se a razão for maior que 1 a cana passou do ponto. 
 
0,8 ≤ oBrix na ponta <1 
 oBrix na base 
 
Independente do seu critério de decisão para escolher o momento da colheita, é de 
fundamental importância que esta seja feita sem queimar a palhada. O corte deve ser 
realizado sem que o canavial tenha sido queimado. O fogo acelera a degradação da cana 
e favorece acumulo de cinzas nas dornas, prejudicando o processo de fermentação e 
resultando em cachaça de má qualidade. A palhada deveser removida e pode ser 
deixada no campo, ou servir de volumoso para o gado. Uma vez cortada, o ideal é que a 
cana seja colocada diretamente sobre a carreta, carroça ou caminhão onde será 
transportada até a moenda. Deve-se evitar empilhar a cana cortada no chão para evitar 
que esta suje de terra. Como as cinzas, a terra acumula nas dornas, atrapalham a 
fermentação. A cana cortada deve ser transportada para a área de moagem 
imediatamente, e processada dentro de 24horas. 
No Quadro 1 são apresentadas as principais características do caldo de cana e do 
melaço. 
 
Quadro 1. Características do caldo de cana e do melaço 
CALDO DE CANA DETERMINAÇÕES MELAÇO 
80 (%) água 20 (%) 
15 (%) açúcares 62 (%) 
0,4 (%) cinzas 8 (%) 
0,8 (%) comp. nitrogenados 3 (%) 
5,2-6,8 (%) pH 5,8 (%) 
15 oBrix 70 
500-1000 L Rendimento (por ton cana) 25-40 L 
 
 
 
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4 – FERMENTAÇÃO 
 
Por usina de fermentação entende-se toda a área de produção, desde a recepção 
da cana até a expedição da cachaça. Existem algumas orientações para a construção da 
usina, mais do que exigências, essas orientações apontam para áreas de produção fáceis 
de limpar e bem organizadas. Deve-se ter também um pequeno laboratório. 
Poucos equipamentos são necessários para acompanhar o processo, 
controlar a qualidade do produto e obter bons resultados finais. É essencial possuir 
pelo menos um densímetro em escala brix, um densímetro em escala GL, 
termômetro e proveta. Além desses, um medidor de pH seria um ótimo 
complemento. Note que estes equipamentos não substituem a necessidade de 
realizar análises físico-químicas em laboratório qualificado, mas auxiliam a 
obtenção e manutenção de alto padrão de qualidade. 
 
Controles da Fermentação 
 
Teor de açúcar no mosto 
Deve ser ajustado entre 14 e 16 oBrix empregando um densímetro em escala Brix 
ou com sacarímetro de campo, e são os mesmos usados para controle da maturidade da 
cana. O ajuste do oBrix é feito com água dentro dos padrões de potabilidade. 
 
 
Figura 2. Densímetro em escala brix e refratômetros. 
 
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pH 
O pH indica a acidez, quanto menor o pH mais ácido será o líquido, o pH do caldo 
deve ficar entre 4,5 e 5,6 (Figura 3). Caso a variedade da cana plantada seja indicada 
para o tipo de solo empregado, se a cana não foi queimada e o inóculo preparado da 
maneira recomendada, esse valor deve ter sido atingido naturalmente. Se for necessário 
corrigir, pode-se diminuir o pH com vinhoto de destilação anterior. Quase nunca é 
necessário aumentar o pH. 
 
Figura 3. Medidores de pH de bancada e portátil e papel tornasol. 
 
Temperatura 
A temperatura do mosto durante a fermentação deve ser mantida entre 28° e 34°C. 
Deve-se evitar que a temperatura passe dos 34ºC, principalmente nos dias mais quentes. 
Por isso, é importante monitorar e controlar a temperatura do mosto durante a 
fermentação (Figura 4). 
 
 
Figura 4. Termômetros 
 
 
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Nível de espuma 
Respeitadas estas condições, o tempo de fermentação deve ficar entre 12 e 24 
horas. Após esse período a efervescência do mosto (Figura 5) termina e as leveduras 
decantam para o fundo da dorna, é hora de destilar. Se a efervescência continuar muito 
além deste período a cachaça não será de boa qualidade. Os principais motivos que 
levam a uma fermentação longa são inóculo inadequado, teor de açúcar (oBrix) muito alto 
ou muito baixo e temperatura inferior aos 28ºC. 
 
 
Figura 5. Efervescência natural do mosto durante a fermentação. 
 
 
5 - DESTILAÇÃO 
 
Se tudo correu bem até aqui o grau alcoólico do vinho fermentado deve estar entre 
7,5 a 10% v/v, com pH entre 3,9 e 4,2. A medida do teor de álcool no destilado é feita com 
um densímetro em escala GL (Figura 6), conhecido como alcoômetro de Gay-Lussac, 
similar ao já utilizado para medir o oBrix. Neste caso a escala GL significa % de álcool, ou 
seja, 1ºGL = 1 mL de etanol em 100mL de solução. 
 
Figura 6. Densímetro em escala GL. 
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Recomendações para produção de cachaça 
 
Embora seja a fermentação a principal etapa responsável pela qualidade da 
cachaça, a destilação é a que mais exige nossa atenção e acompanhamento. A 
destilação deve ser realizada com muito cuidado, e acompanhada de perto com o 
densímetro em escala GL. 
Deve-se ter como equipamento para destilação (Figura 7) um destilador com 
panela em aço inoxidável contendo algumas partes em cobre, como o deflegmador e a 
serpentina. Eventualmente, o alambique pode ser todo em cobre, neste caso, deve-se ter 
cuidado para evitar a reação do cobre com o ar, essa reação forma um composto 
esverdeado chamado zinabre, que causa altos índices de cobre na cachaça. Uma 
maneira indicada para prevenção do zinabre é deixar o alambique completamente cheio 
de água durante todo o período que não estiver sendo utilizado. 
 
 
Figura 7. Exemplo de destilador. (A) panela, (B) coluna, (C) pré-aquecimento do vinho 
para próxima destilação, (D) condensador, (E) sistema de corte do destilado. 
 
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O sistema de aquecimento do vinho pode ser através de vapor ou fogo direto. O 
sistema a vapor é mais adequado, pois proporciona uma melhor qualidade ao produto, 
devido ao aquecimento uniforme do vinho. Isto acelera o processo e facilita o controle da 
temperatura resultando numa destilação mais eficiente que ajuda a diminuir a acidez e o 
teor de cobre na cachaça. Na Figura 7 é mostrado um exemplo de destilador com 
aquecimento a vapor, o qual entra pela tubulação (1) e circula dentro da panela (A). Cabe 
ressaltar que o volume da panela não deve ser superior a 2000L, principalmente quando o 
aquecimento for feito por fogo direto. 
O vapor sobe pela coluna onde entra em contato com o deflegmador, não mostrado 
na figura, sendo um disco de cobre perfurado posicionado dentro da coluna. O contato 
dos vapores com o cobre é muito importante para a boa qualidade da cachaça, o cobre 
catalisa reações químicas de oxidação que ajudam a eliminar substâncias com aroma e 
paladar desagradáveis. Ao sair da coluna o vapor destilado segue por tubos de cobre e 
passa por dentro do pré-aquecedor e depois pelo condensador. O pré-aquecedor é 
dispensável, porém muito útil, pois nele está contido o vinho que ainda será destilado e 
que vai sendo aquecido pelo vapor com objetivo de acelerar o processo da destilação. No 
condensador circula água fria; é aqui que todo vapor destilado esfria e volta para fase 
líquida, sendo recolhido seletivamente no separador de frações. 
Durante a destilação separa-se o vinho em 4 frações, cabeça, coração, cauda 
e vinhoto. Para separar uma fração da outra basta mudar a inclinação do tubo de saída 
do condensador. A cabeça é a 1ª fração, de cerca de 5% a 10% do volume destilado; o 
coração, a 2ª fração, é a cachaça propriamente dita e corresponde à cerca de 80% do 
volume destilado; a cauda, a 3ª fração, correspondente a cerca de 10% a 15% finais do 
destilado total e o vinhoto é o que resta na panela após a destilação. Em muitos 
alambiques, a cauda não chega a ser destilada, sendo incorporada ao vinhoto. Na prática, 
considerando um destilador com panela de 1000 litros, os primeiros 5 a 10 litros são 
separados como cabeça, a partir daí recolhe-se o coração, ou seja, a cachaça, até que o 
destilado, frio, apresente aparência turva, o que deve ocorrer por volta de 38ºGL, ou 38% 
de álcool. Neste ponto interrompe-se a destilação e o restante da panela é considerado 
como vinhoto. Note que à medida que a destilação avança o grau alcoólico do destilado 
vai diminuindo, de modo que o grau alcoólico da cachaça será a média entre o grau no 
inicio e no fim do corte do coração. Ao final,deve-se padronizar o grau alcoólico da 
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cachaça, acrescentando água potável até obter o grau desejado, dentro da faixa 
especificada. 
O corte determina a personalidade da cachaça, quanto menor for a fração 
separada como cabeça, maior será o grau alcoólico e mais aromático será o produto. 
Quanto menor a fração considerada como coração, mais pura será a cachaça. Em termos 
mais técnicos, o corte vai determinar a acidez, e a composição química da cachaça, seu 
teor de álcoois superiores, ésteres, metanol e outros componentes. Todas essas 
substâncias têm seus limites permitidos definidos por lei. O corte vai garantir que a 
cachaça atenda aos requisitos de qualidade para que possa ser comercializada. A 
negligência em observar estes limites pode causar sérios danos à saúde dos 
consumidores. 
 
No Brasil, a principal matéria prima utilizada na produção de etanol é a cana de 
açúcar por apresentar vantagens do ponto de vista econômico, energético e de 
disponibilidade. Entretanto, apesar da viabilidade, a produção de álcool pode está 
associada a um problema ambiental, uma vez que, em tese, cada litro de álcool produzido 
no processo de destilação, gera cerca de 14 litros de um efluente chamado vinhoto que 
apresenta alto poder poluente. 
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6 – EXPERIMENTOS DE LABORATÓRIO 
 
6.1 - Objetivos 
 
6.1.1 – Verificar a influência da fortificação do caldo de cana no rendimento, na 
eficiência e na produtividade da fermentação alcoólica. 
Realizar fermentação de caldo de cana in natura em reatores de mesma geometria, 
mesmo volume e mesma concentração de inóculo, porém fortificado pela adição de 0,1% 
de (NH4)3PO4 e 0,1% de extrato de levedura. 
 
6.1.2 – Verificar a influência da concentração inicial de inóculo sobre o rendimento, 
a eficiência e a produtividade da fermentação alcoólica. 
Realizar fermentação de caldo de cana in natura em reatores de mesma geometria e 
mesmo volume porém, utilizando inoculo normal (10g/L) em um dos frascos e 20g/L em 
outro (inóculo maciço). 
 
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1ª Prática – Início da Fermentação 
 
1 - Preparo dos meios de fermentação: 
 Meio A - meio não fortificado: Colocar 1 litro de caldo de cana in natura em 
erlenmeyer de 2 litros. 
 Meio B - meio fortificado: Colocar 1 litro de caldo de cana in natura + 0,1% de 
(NH4)3PO4 + 0,1% de extrato de levedura em erlenmeyer de 2 litros. 
 
2 - Inoculação 
 Turma 1(N1N2) - Meio B + 10g de fermento fresco 
Turma 2 (N3N4) - Meio A + 10g de fermento fresco 
Turma 3 (N5N6) - Meio A + 20g de fermento fresco 
Turma 4 (T5T6) - Meio B + 20g de fermento fresco 
 
3 - Amostragem 
 Tempo Inicial: 
 Concentração de açúcar: 
-Glicídios redutores totais (GRT - Prática no 4 de Bioquímica). 
-Densímetro de BRIX: graduado com solução de sacarose em água, de forma que 
10oBRIX ≡ densidade de uma solução de 10% sacarose em água. 
-Refratômetro de mão: é utilizado para medidas rápidas em oBRIX. 
 
 Quantificação celular: 
-Câmara de Neubauer: Neste caso são contadas as células viáveis ou não. 
Procedimento: Colocar uma gota de uma suspensão diluída na câmara de 
contagem e cuidadosamente cobrir com uma lamínula (evitar a formação de 
bolhas). Em seguida, colocar a câmara no microscópio (objetiva 40X) e efetuar a 
contagem das células em 5 dos 25 quadrados da câmara. 
 
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 Cada um desses cinco quadrados é dividido em 16 quadradinhos e é identificado 
pelos números de 1 a 5. 
 Resultado (células/cm3) =
)cm(V
1
x25x
5
células
3
câmara
∑
x fator de diluição 
2 
5 4 
3 
1 
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2ª Prática – Final da Fermentação 
 
1 - Amostragem 
 
1.1 - Retirar amostras no tempo final para as seguintes determinações: 
 -Açúcar: densímetro de BRIX (ou refratômetro) e/ou glicídios redutores totais (GRT) 
 -Quantificação celular: densidade ótica ou câmara de Neubauer 
 
1.2 - Destilar 400 mL de mosto fermentado em um sistema similar ao da figura abaixo até 
a temperatura de ebulição do álcool que é em torno de 78°C. Ao final da destilação medir 
o volume de destilado obtido e de vinhoto (resíduo da fermentação alcoólica). No 
destilado medir o teor alcoólico com um densímetro (alcoômetro) que indica o volume de 
álcool etílico contido em 100 volumes de uma mistura feita exclusivamente de álcool 
etílico e água. O resultado será expresso em porcentagem volume/volume (mL de 
etanol/100mL de solução) ou grau Gay-Lussac (oGL). 
 
 
 
2 - Cálculos 
 
Equação de Gay-Lussac: 
C6H12O6 —→→→→—- 2C2H5OH—–+——2CO2 
 glicose álcool etílico dióxido de carbono 
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Tomando-se por base a sacarose, principal açúcar da cana, tem-se: 
 
 
100
S - substrato do ou M.P. da peso ou Volume
P-produto do peso ou Volume
Rendimento
0
x
∆
= , 
onde M.P. = matéria prima 
 
x100
P - consumido) (subst. teórico produto do peso ou Vol.
P - produto do peso ou Vol.
ofermentaçã Ef.
esperado∆
∆
= 
 
x100
P - inicial) (subst. teórico produto do peso ou Vol.
P - produto do peso ou Vol.
Processo Ef.
0S
∆
= 
 
ofermentaçãt
∆P
adeProdutivid =