Lignina, qualidade de forragem

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL
Aluno: Danilo Gusmão de Quadros
	Trabalho apresentado como parte das exigências da disciplina Nutrição de Ruminantes, ministrada pela Profa. Telma T. Berchielli
Jaboticabal, SP
Agosto de 2001 
ÍNDICE
	ASSUNTO
	PÁGINA
	01. INTRODUÇÃO
	2
	02. LIGNINA NA CÉLULA VEGETAL
	2
	03. A LIGNINA
	3
	04. FERULATO
	5
	05. BIOSINTESE DO MONOLIGNOL
	9
	06. SÍNTESE DE LIGNINA
	10
	07. EFEITO NUTRICIONAL DA LIGNINA
	14
	7.1.	Toxidade
	15
	7.2. Encrustação
	16
	7.3. Ligações covalentes
	17
	08. MELHORAMENTO GENETICO VEGETAL E A LIGNINA
	18
	9. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE LIGNINA
	19
	9.1. Métodos de isolamento de lignina
	20
	10. CONSIDERAÇOES FINAIS
	22
	11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
	23
01. INTRODUÇÃO
		A lignina sempre foi considerada um enigma no mundo natural (Ralph, 1996). A necessidade de estudar essa estrutura é decorrente da sua participação no alimento forrageiro. A forragem apresenta um papel importante na indústria animal mundial, sendo a fibra (parece celular) um dos componentes energéticos da dieta dos ruminantes, embora apenas 50% ser digestivo e, portanto, utilizável (Hatfield et al., 1999).
 		A parede celular é o principal componente das plantas terrestres, proporcionando rigidez e força, constituindo-se em um fonte nutricional significativa para os herbívoros. Essa contém polímeros de carboidratos (polissacarídeos) incluindo a celulose, a hemicelulose e a pectina e um polímero não-carboidrato denominado de lignina.
 
02. LIGNINA NA CÉLULA VEGETAL
		A lignina, como uma substância relacionada com a estrutura da planta, é encontrada nos órgãos que necessitam de maior aporte de força, como o caule. Assim, a lignina é encontrada principalmente no esclerênquima, nos vasos condutores de seiva bruta e elaborada, ou também em células que circundam algum tipo de infecção ou estímulo externo. Todavia, podemos encontrar células no tecido colênquima que se lignificam tornando as paredes mais espessas e selecionando-a para constituírem o tecido esclerênquima.
		Logo que o alongamento celular cessa, se dá o início do processo de lignificação, que se inicia pelos vértices da célula, prosseguindo através da lamela média/parede primária para a parede celular secundária (Wilson, 1994). Segundo Van Soest (1994), pode ocorrer uma variação no processo de lignificação nas plantas devido à resposta ao estresse ambiental e nutrição.
03. A LIGNINA
A lignina é um polímero de unidades de álcoois fenil-propanóicos e é encontrado em qualquer planta vascular (Meshitsuka e Lsogay, 1996). Todavia, a lignina não apresenta uma estrutura definida (Ralph, 1996). Hatfield et al. (1999) definiu a lignina de modo independente da estrutura química, como uma macromolécula derivada de fenol (polímero) que interage com outros polímeros da parede celular para promover uma integridade estrutural, resistência à degradação e impermeabilidade à água.
As ligninas são polímeros altamente condensados e compostos por sub-unidades de álcoois sinapil (referente as unidades siringil), coniferil (referente as unidades de guaiacil) e p-​hidroxifenil (p-coumarico), no caso das gramíneas (Figura 1) (Lapierre. 1993 Hatfield et al. 1999) são formadas pelos ácidos hidroxinamicos denominados ácido p-coumarico, ácido ferúlico e ácido sinápico (Hatifeild et ai., 1999). Os ácidos hidroxinamicos estão presentes na parede celular em todas as forragens tanto com ligações do tipo éter, quanto do tipo éster. Contudo, a sua concentração é mais elevada nas gramíneas do que nas leguminosa (Buxton et ai., 1996).
A constituição química da lignina pode variar em alguns pontos e em diferentes proporções. A parede celular de plantas da ordem giminospermae contém alta proporção de subunidades de guaiacil e seringil, enquanto as da ordem angiospermae dicotiledôneas apresentam proporções iguais de subunidades de guaiacil e seringil propano; e angiospermae monocotiledôneas possuem aproximadamente quantidades iguais das três subunidades alcóois (p-coumaril. coniferil e sinapil) (Correia, 1980).
Figura 1 - Estrutura química típica dos precursores de lignina e os ácidos hidroxicinâmicos achados na parede celular de forrageiras. Fonte: Hatfield et al. (1999)
A sequência destas unidades no processo de lignificação não segue nenhum tipo de padrão e, se necessário, a planta se adapta a produção de lignina como foi observado quando, através da engenharia genética, a produção do álcool coniferil foi paralisada, sendo esta estrutura química uma das principais formadoras de lignina. Mesmo impedida de produzir álcool coniferil, a planta cresceu perfeitamente e produzindo lignina através da alguns ajustes na rota de dreno, tornando clara a importância desta substância para a vitalidade desses organismos (Ralph, 1996).
04.	FERULATO
As pesquisas mostram um menor interesse pela lignina do que pela forma como ela protege os carboidratos da digestão. Por exemplo, mesmo se os componentes da parede celular forem mantidos por tempo indeterminado em condições ruminais, o material que permanece indigestível ainda contém dois terços de carboidratos (Ralph, 1996). Isto ainda corresponde a dois terços potencialmente digestíveis e se observarmos a sua composição veremos a semelhança com o material original da planta. Uma alternativa para explicar esta indigestibilidade é que, de alguma forma, a lignina está ligada através de pontes químicas ao carboidrato, sendo que estas duas frações (polissacarídeos e lignina) podem estar cross-linked.
		Para termos uma idéia como as ligações cruzadas (cross-link) podem produzir tal efeito temos um exemplo de um polimero útil denominado polisopropeno, também conhecido como a borracha. O látex tirado das seringueiras é facilmente polimerizado quando secado ao sol para formar folhas macias e flexíveis. Estes possuem propriedades elásticas, mas quebram-se facilmente, sucumbem-se a abrasão e dissolvem-se na gasolina. Aplicando um pouco de mediador de enxofre nas ligações cruzadas durante o processo de vulcanização temos um material que irá durar cerca de 80.000 km em contato com o asfalto. O que está ilustrado aqui é que, com apenas algumas ligações cruzadas podem ser responsáveis por grandes mudanças nas propriedades do material.
As ligações de junção do ácido ferúlico têm sido cuidadosamente analisada. Nas gramíneas, o modo de agrupamento parece ser altamente conservado, no qual o ácido ferúlico está ligado ao primeiro hidroxil formado na posição C5 quando a arabinose está na forma de furanose através de uma ligação ester (Figura 2). A caracterização estrutural dos fragmentos de parede celular resultantes de uma hidrólise parcial enzimática revelaram estruturas de ferulato oligosacarídeos da seguinte forma: AF-Ara-Xil; AF-Ara-(Xil)2; AF-Ara-(Xil)3 (Hatfield et ai., 1999).
Figura 2 - Incorporação do ácido ferúlico dentro da matriz da parede célular é feita através da ligação estrutural com o polissacarídeo. O ácido ferúlico nas gramíneas é ligado covalentemente através de um éster ao álcool primário no C5 da arabinose que está ligada na cadeia de arabinoxilana. Fonte: Hatfield et al. (1999)
As moléculas de ácido ferúlico podem sofrer a oxidação dos radicais livres, unindo-se para formar um di-isômero, enquanto o álcool coniferil (maior componente da lignina) sofre a oxidação dos radicais livres formando uma variedade grande de dimeros com diferentes ligações moleculares. O ácido ferúlico é facilmente oxidado pela peroxidase e o produto da junção desses radicais representa uma ampla variedade de diferulato que é influenciado pela química de junção dos radicais livres (Iiyama et al., 1994; Hatfield et al., 1999). Os diferulatos são responsáveis por 70% do total de ferulatos, podendo serencontrado na forma de 5-5, 8-8, 8-5 e 8-0-4 diferulato (Figrura 3 e 4). O ferulato tem sido identificado como o principal responsável pelas ligações cruzadas nas paredes de polissacarídeos, aumentando assim sua indigestibilidade (Ralph, 1996).
Figura 3 — Os diferulatos são formados dentro da matriz da parede celular como o resultado da reação dos radicais pela peroxidase e pelo hidrogênio-peroxidase. Estrutura 1 são ferulatos ligados no C5-C5; estrutura 2a, 2b e 2c os ferulatos estão ligados no C8-C8 mostrando as possíveis formas estruturais dos isômeros (2b e 2c) depois da primeira reação da estrutura 2a; estrutura 3 os ferulatos estão ligados no C8-C5; estrutura 4 os ferulatos estão ligados via ligação éter no C4-C5 e a estrutura 5 os ferulatos estão ligados via éter no C4-C8. Fonte: Hatfield et al., 1999.
	
	Lam et al. (1992) citado por Hatfield et al. (1999) desenvolveram um experimento demonstrando que o ácido ferúlico (ferulato) formou ligações cruzadas do tipo éster com a lignina e o polissacarideo arabinoxilana. Nesse trabalho p-​cumarato não realizou a ligação cruzada em gramíneas.
Figura 4 —	Concentração em μg/g (material da parede celular) de diferulatos. Fonte:Hatfield et al. (1999). 
Estudo realizado por Ralph et al. (1995) citado por Hatfield et al. (1999) confirmou que ferulatos ligados a arabinoxilana unem-se covalentemente aos monômeros de lignina através das reações de junção dos radicais. Sendo que os ferulatos irão reagir somente com os monolignois (monômeros de alcool coniferil e/ou sinapil). Isto significa que o primeiro evento da lignificação da parede celular é a reação com os ferulatos, ou seja, os ferulatos funcionam como o local central para o processo de lignificação. Os diferulatos entram na composição da lignina da mesma forma que o monômero de ferulato (Ralph et al., 1997, citado por Hatfield et al., 1999). 
O posicionamento do ferulato dentro da parede pode regular o padrão de formação da lignina e controlar a ligação cruzada dentro da matriz da parede celular. Por outro lado, não se tem ferramenta para quantificar ferulatos nas paredes celulares ligninficadas de gramíneas, mas sabe-se que 50 a 60% do total de ferulato não se desprende da parede lignificada (Hatfield et al., 1999) (Figura 5).
Figura 5 — Esquema do diagrama dos radicais de ferulato se ligando com a lignina. Ambos os resíduos alcoois coniferil e sinapil ligam-se aos ferulatos acessíveis. Os ferulatos agem como estímulo para a formação de lignina.
05. BIOSINTESE DO MONOLIGNOL
Os aminoácidos aromáticos C6C3, tais como fenilanina, tirosia e triptofano são biosintetisados via o ácido shiquímico. Estes aminoácidos aromáticos são usados para a biosíntese de proteína (metabolismo primário) e também para a biosíntese de vários tipos de fenilpropanóides e compostos aromáticos (metabolismo secundário). A enzima que controlam a transição da via primária para a secundária é a fenilalanina amonialiase (PAL) ou tirosina amonia​liase (TAL: no caso das gramíneas). A atividade do PAL aumenta moderadamente quando a planta está em processo de lignificação (Fukuda et al, 1969; Terashima et al. 1993).
O ácido p-coumárico (CA) é a substância intermediária mais importante na via de sintese do monolignol e também um dos principais componentes da lignina de gramíneas. A rota principal para a formação do monolignol é iniciada através da introdução do grupo hidroxil no ácido p-coumárico para termos o ácido cafeico, seguido da 0-metiltransferase, resultando no ácido ferúlico (FA). A partir do ácido ferúlico temos o mesmo processo (grupo hidroxil mais o O- metiltransferase) para obtermos o ácido sinápico (Figura 6) (Terashima et al., 1993; Hatfield et al., 1999).
Os monolignóis, denominados de álcoois p-coumaril, coniferil e sinapil, são biosintetisados pela redução desses ácidos fenólicos. A redução dos grupos carboxilicos são realizados pelas enzimas denominadas hidroxicinamato CoA ligase (CCL), cinamil CoA redutase (CCR) e a cinamil álcool NADP oxiredutase (CAD), sendo que essas podem variar de acordo com o tipo da planta, o tipo do tecido, etc. (Higuchi, 1985, citado por Terashima et al., 1993; Hatfield et al., 1999). Todas essas enzimas que atuam em cada etapa da biosíntese, desde a forma aromática do aminoácido até os monolignois propriamente ditos, controlam a composição de monolignol na lignina (Terashima et al., 1993).
A via de biosintese de monlignol não é tão linear como se pensava, pois foram detectados algumas vias alternativas junto com a complexa interação entre as enzimas, como demostrado por Hatfield et al. (1999).
06. SÍNTESE DE LIGNINA
A lignina é formada através de uma polimerização de desidrogenase iniciado enzimaticamente a partir dos três precursores primários (Sarkanen e Ludwig, 1971, citado por Hatfield et al., 1999). Peroxidases e oxidases reagem com os precursores da lignina (álcoois coniferil, sinapil e p-coumaril) formando produtos oxidados de um elétron que passa por algumas reações para produzir um polímero crescente de lignina (Jung e Deetz, 1993, citado por Hatfield et al., 1999).
Compreendido a biosíntese de monolignois e do ferulato pode-se, então, iniciar os estudos da síntese da lignina. De maneira simplificada, após a obtenção dos monolignóis, inicia a síntese mais complexa, que consiste na conversão de uma mistura de álcoois p-cumaril, coniferil e sinapil em um polímero de lignina, por meio de uma repetida condensação de vários pontos das moléculas em um processo iniciado pela oxidação enzimática do fenol.
A fenol oxidase, que tem o álcool coniferil como precursor, remove um elétron do íon fenóxido originando um radical livre, o qual, pelo fato da estrutura do álcool ser altamente conjugada, é estabilizado por mesomerismo. Esses radicais, no entanto, são altamente reativos e estabilizam-se através da combinação com outros radicais ou reagem pelo radical livre de permuta com outras moléculas para ceder diferentes radicais livres, criando, qualquer desses processos, intermediários instáveis. Assim, a simples oxidação dos fenóis origina o início de uma série de processos, que ao acaso, sem intervenção enzimática, produz uma diversidade de produtos. Diversos desses intermediários da lignificação de baixo peso molecular contém 1, 2, 3, 4... unidades n-fenilpropanóides. 
A Figura 6 é uma ilustração conceitual das relações entre a deposição de polímeros na parece celular e sintetiza temporalmente a formação da heterogenia estrutura da lignina.
As ligninas diferem, sobretudo, no que se refere às proporções relativas dos três álcoois a partir dos quais se formam. Algumas ligninas de gramíneas e ervas são constituídas em sua maioria por unidades ácido p-coumarico, possuindo, no entanto, um alto conteúdo de ácido cinâmicos esterificados.
Entre as ligninas e os carboidratos podem formar-se ligações do tipo éter venzil​carboidratos ou ligações de tipo éster, assim como ligações do tipo acetal e cetal formadas entre grupos aldeidos ou cetonas das ligninas e os hidróxidos dos carboidratos ou entre grupos terminais redutores dos polissacarídeos e os hidróxidos alcoolicos da lignina (Figura 7).
Figura 6 – Ilustração conceitual das relações entre a deposição de polímeros na parece celular e a formação da heterogenia estrutura da lignina. Fonte: Terashima e Fukushima (1994).
Estes precursores estão ligados por uma ampla variedade de cadeias no final do polímero. As ligações incluem cadeias de carbono-carbono, na qual um ou ambos os carbonos podem ser aromáticos. A ligação padrão é irregular devido à natureza não enzimática do processo de polimerização, que pode continuar a ocorrer ao longo dos precursores ativados e no espaço da parede que está disponível, preenchendo o que não foi ocupado pelas macromoléculas. O resultado é uma cadeia muito forte formando um emaranhado hidrofóbico que circunda os outros componentes da cadeia, cimentando-os no lugar. De modo geral a estrutura é incapaz de extensão plástica, sendo umabarreira eficiente tanto de nutrientes quanto de patógenos.
Figura 7 —	Ligação do ácido p-coumáico via éster ao álcool primário no Y-carbono da lignina. Nas gramíneas, tais como o milho, a ligação éster está normalmente relacionada com o álcool sinapil podendo ocorrer também com o álcool coniferil. Fonte: Hatfield et al. (1999).
O termo “non-core lignin” é utilizado quando encontramos os ácidos hidroxicinâmicos ligados covalentemente aos polímeros da parede celular que são liberados durante a hidrólise (Lapierre, 1993). Consequentemente, ácidos hidroxicinâmicos tem sido incorporados dentro da lignina com ligações hidrolíticas resistentes, definidas pelo termo “core-lignin”.
Apesar destas definições serem convenientes para investigação dentro do aspecto nutricional de forragem, bem como comparar a composição da planta, a terminologia é bastante infundada com respeito à discussão dos aspectos moleculares da estrutura da lignina. 
Essa terminologia somente pode ser utilizada para os ácidos hidroxicinâmicos que possuem ligações éster, que é conseguido através do tratamento do material a baixa temperatura em meio alcalino (Hatfield et al., 1999). Mediante a complicação de que não existe nenhuma distinção entre ácidos hidroxicinâmicos acoplados a lignina ou aos carboidratos, o uso desta terminologia acaba por ser inapropriado, por isso tende ao abandono. Dessa forma, o complexo que consiste da lignina e ligações covalentes é denominado de lignina-ácido hidroxicinâmico ou complexo lignina-carboidrato, deve ser usado para descrever o complexo correspondente que incorpora ligações covalentes de carboidratos.
	Jung et al. (1996) destacam que as células da parede celular das forragens são compostas por três classes de polissacarídeos: celulose, hemicelulose e pectina. Outro importante componente é a lignina, conceituada como um complexo polímero derivado de álcoois hidrocinâmicos, que é geralmente considerada o maior empecilho da digestão da fibra.
	A lignina é tida como o principal fator limitante da digestibilidade, mas não afeta todos os componentes da dieta. As análises laboratoriais indicam que as partes caracterizadas como não pertencentes à parede celular não possuem lignina na sua estrutura e, considerando a diminuição de carboidratos solúveis e proteína com o processo de lignificação, esclarece a alta correlação negativa entre lignina e digestibilidade (Van Soest, 1994).
		Van Soest (1964) sugeriu que o efeito na digestibilidade devido à lignificação está relacionado com os polissacarídeos da parede celular, tendo mínimo efeito sobre os componentes solúveis da célula. A digestibilidade dos componentes solúveis da célula de gramíneas tropicais é pobremente relacionada com o conteúdo de lignina e a forrageira madura altamente lignificada tem como característica o baixo conteúdo celular de componentes solúveis.
07. EFEITO NUTRICIONAL DA LIGNINA
Fukushima e Paneto (1995), ao realizar ampla revisão sobre o tema, consideraram que, entre os componentes fibrosos da dieta, a lignina está associada à diminuição da digestibilidade dos nutrientes, sendo que o amadurecimento das plantas promove incremento no conteúdo de lignina e essa apresenta alta ou completa indigestibilidade, conferindo assim o baixo valor nutricional das plantas maduras. Esses autores destacam algumas razões pela limitação a degradação microbiana: a) estrutura compacta e hidrófoba, impedindo a umidificação; b) rigidez estrutural devido a ligações carbono-carbono (C-C) e éter (C-O-C); c) diferentemente de outros polímeros naturais, a lignina contém muitos tipos de ligações intermonômeras, muitas das quais não são diretamente hidrolisáveis.
	A literatura apresenta três mecanismos da ação inibitória da lignina sobre a digestibilidade dos polissacarídeos da parede celular: toxicidade, incrustação e ligações covalentes, conforme serão discutidos a seguir.
7.1.	Toxidade
	Existe uma inibição da digestão da parede celular por ácidos fenólicos solúveis que ocorrem naturalmente na forragem, que são inibidores dos microrganismos ruminais não adaptados, e possivelmente não é a principal causa da limitação na digestibilidade da parede celular (Van Soest, 1994). Corroborando, Fukushima e Paneto (1995) destacam que os compostos fenólicos parecem ter uma ação tóxica sobre os microrganismos, sendo que a decomposição parcial da lignina libera esses compostos, que possuem diferenciados graus de inibição. O mecanismo pelo qual a inibição ocorre não é bem conhecido, mas existem teorias que sugerem uma capacidade dos fenóis de se combinarem com as membranas da célula e rompê-las e/ou a capacidade de inativar enzimas essenciais.
	Jung et al. (1993) destacam alguns ácidos fenólicos extraídos da alfafa (vanílico, p-hidroxibenzóico, ferúlico). Segundo esses autores, houve um decréscimo na atividade celulolítica das bactéria ruminais Fibrobacler succinogenes e Ruminococcus flavefaciens na presença dos ácidos fenólicos. Em experimentos com culturas mistas, também houve decréscimo linear na atividade celulolítica e amilolítica quando os ácidos ferúlico e p-coumárico foram incubados in vitro. Contudo, os autores recomendaram cuidado na análise desses testes, pois a concentração desses ácidos fenólicos são baixas no rúmen (in vivo), sendo liberadas durante o processo fermentativo, podendo atingir 10 vezes menos a concentração usadas em laboratório. Nessa mesma revisão, os autores citaram outros experimentos nos quais não houve impactos na degradabilidade do amido ou da celulose em uma concentração de ácidos fenólicos semelhante à encontrada em quatro fontes de forragem.
	Fukushima et al. (1991) verificaram que compostos fenólicos solúveis não inibiram a digestão in vitro da celulose da alfafa. Pelo contrário, sugeriram que as substâncias fenólicas foram possivelmente metabolizadas ou modificadas pelos microrganismos ruminais. Fukushima e Paneto (1995) citaram diversos trabalhos com cepas de bactérias ruminais na presença de ácidos fenólicos, demonstrando que existem conflitos de resultados. Alguns resultados mostraram uma adaptação das bactérias ruminais aos compostos em questão. Foram verificados sinais de metabolismo dessas bactérias utilizando tais compostos como substrato, embora com uma limitada capacidade de hidrogenação dos ácidos hidrocinámicos.
	Jung e Allen (1995) notaram que os estudos anteriores sugerem uma toxidade direta dos ácidos fenólicos nos microrganismos ruminais e, por outro lado, as pesquisas mais recentes, usando um modelo mais apropriado da formula estrutural dos ácidos fenólicos na parede celular, indicaram que não ocorre efeitos tóxicos nos microrganismos ruminais.
7.2. Encrustação
A denominação encrustação é devido a uma barreira física que a lignina provoca entre os polissacarídeos da parede celular e as enzimas dos microrganismos ruminais, ocasionando uma queda da degradabilidade dos alimentos fibrosos (Fukushlma e Paneto, 1995; Jung e Allen, 1995; Jung et al.,1993; Van Soest, 1994; Besle et al.,1994).
	Jung et al. (1993) descreveram que a lignina promove um enchimento hidrófobo na matriz da parede celular, sendo que esse impedimento da entrada de água nos polímeros internos promove uma limitação nas enzimas hidrófilas durante a degradação dos carboidratos estruturais. Esses autores citaram vários experimentos nos quais foram realizados tratamentos para promover a ruptura dessas ligações e observaram resultados expressivos no aumento da digestibilidade desses materiais testados.
	Com o avanço da maturidade fisiológica planta, os ésteres de ferulatos tornam-se ésteres ligados à lignina, formando ligações cruzadas entre a lignina e o polissacarídeo da parede celular, sendo que as enzimas que liberam xilanose, celulose e pectina, são moléculas grandes, a proximidade da lignina com os polissacarídeos dificulta o acesso físico das enzimas microbianas com seus substratos, impedindo a hidrólise e consequentemente reduzindo a digestibilidade (Casler e Jung, 1999; Junget al.,1993).
Segundo Besle et al. (1994), diferentes respostas entre tratamentos químicos e as diferenças no efeito da lignina entre forragens, ilustra que a encrustação pode ser uma limitação parcial na degradabilidade ruminal. Os autores destacaram que procedimentos de natureza física, como uma moagem fina aumenta a digestibilidade da fibra e observaram que a encrustação é mais efetiva em forragens com maturidade avançada e é maior em leguminosas do que em gramíneas.
Fukushima e Paneto (1995) destacaram em sua revisão vários trabalhos da década de 60 em a moagem fina (moinho de bolas) promoveu aumentos significativos na digestibilidade in vitro da celulose, hemicelulose e pectina. O tratamento químico também aumentou a digestibilidade tanto in vitro como in situ de materiais grosseiros (fibrosos).
7.3. Ligações covalentes
	As ligações covalentes entre a lignina e os polissacarídeos são de fundamental importância na digestibilidade da fibra. Segundo vários autores, o conteúdo de lignina está altamente correlacionada com a digestibilidade. Todavia, as variações quantitativas tomadas isoladamente de lignina não explicam o decréscimo total na digestibilidade. A interação da lignina com outros componentes da planta como por exemplo lignina-hemicelulose pode estar envolvida na inibição da digestão, pois as gramíneas caracteristicamente possuem os derivados do ácido cinâmico esterificados, fazendo pontes entre a lignina do núcleo e os carboidratos estruturais da parede celular. Os ésteres de ácidos cinâmico mais frequentemente encontrados são os ácidos ferúlico e p-cumárico que compõem de 5 a 10% de lignina de gramíneas. Esses ácidos p-hidroxicinâmicos da parede celular aumentam com o avanço da maturidade e são apontados como responsáveis pela inibição da degradação microbiana (Fukushima e Paneto, 1995).
	Hartley e Jones (1977) experimentaram o tratamento com hidróxido de sódio em Lolium multiflorum (gramínea) e em Trifolium pratense (leguminosa) e obtiveram maior efeito no aumento da digestibilidade nas gramíneas do que nas leguminosas, portanto os autores concluíram, que, entre outros fatores, a quebra das ligações tipo ésteres entre os carboidratos e os ácidos fenólicos característica das gramíneas foram à razão do aumento da digestibilidade.
08. MELHORAMENTO GENETICO VEGETAL E A LIGNINA
	O trabalho de melhoramento genético afim de diminuir a lignificação em plantas forrageiras possibilita uma alternativa de aumento da digestibilidade da parede celular, considerando que, quantitativamente, esse um importante aspecto na dieta de ruminantes. Contudo, devido a herança poligênica a qual expressa a característica e a carência de conhecimentos sólidos sobre as interações e a interdependência entre os três níveis principais de investigação (quantidade, composição da lignina e as ligações com ferulato), impossibilitam respostas mais concisas e mais animadoras no trabalho de melhoramento genético.
	Jung et al. (1996) citam dados que verificaram aumentos na degradação por enzimas de fungos nas células da parede celular de milho lignificado quando foram reduzidas as ligações com ferulato (ferulate cross-linking), durante o crescimento das células do milho com a inibição da enzima fenilalanina amônealiase, a qual está envolvida na síntese de do ácido ferúlico. Os resultados estão apresentados no gráfico abaixo.
	Lechtemberg et al. (1974) citados por Fukushima e Paneto (1995) mostraram um aumento significativo de 35 - 60% de desaparecimento da parede celular por unidade de tempo em uma variedade de milho com baixo teor de lignina, quando comparado com o grupo controle.
	Ressalva-se que outros fatores nutricionais e não nutricionais estão relacionados com a digestibilidade de determinado volumoso, destacando a taxa de passagem, efeitos associativos entre alimentos, equilíbrio energia/proteína, manejo alimentar, características inerentes ao animal, entre outros. Goering et al. (1973) testaram a digestibilidade in vitro e in vivo de palhadas de cevada com e sem o tratamento com clorito de sódio (tratamento que visa aumentar a digestibilidade de materiais lignificados) e verificaram que a digestibilidade in vitro foi maior que a in vivo para a silagem, sugerindo que fatores como a taxa de passagem podem influenciar a resposta para a utilização de materiais lignificados.
09. ANÁLISES PARA DETERMINAÇÃO DE LIGNINA
Destacando o animal ruminante com sua notável adaptação evolutiva para transformar alimentos fibrosos em carne, leite e lã, inserido em um sistema de produção no qual a constante busca pela economicidade da exploração aliados a fatores de ordem fisiológicas e comportamentais, exigem mecanismos mais refinados para que a alimentação forneça um equilíbrio de nutrientes capaz de maximizar o objetivo esperado. Assim, dentro de um conjunto de fatores envolvidos, a correta determinação da composição, digestibilidade e fornecimento final de nutrientes, confere a grande importância dos métodos para determinação de FDN, FDA e lignina dos alimentos.
A concentração de lignina é um excelente indicador da maturidade da planta, implicando em um dado importante na formulação de rações, caracterizando os alimentos volumosos. 
	Segundo Fukushima et al. (1999), a concentração de lignina não é o principal e único fator a explicar um dado valor de digestibilidade. O arranjo estrutural, a concentração e a composição da lignina e dos ácidos fenólicos são fatores fundamentais. Deve se levar em consideração que a queda da digestibilidade não ocorre somente tão somente em virtude do aumento da concentração de lignina, mas também com o tipo de lignina que é depositado na parede celular ao longo do processo de crescimento. Corroborando, Jung e Allen (1995) e Sudekum et al. (1997) destacaram que a digestibilidade é mais afetada devido as variações na estrutura e na composição macromolecular da lignina com o amadurecimento da planta forrageira, do que propriamente pela quantidade de lignina.
9.1. Métodos de isolamento de lignina
Os métodos para quantificação de lignina podem ser classificados basicamente em 3 categorias (Giger, 1985):
(	Gravimétricos: métodos analíticos de lignina em detergente ácido (LDA) e lignina Klason.
(	Diferença de pesagens após remoção da lignina: permanganato de potássio.
(	Medições de absorvância: espectofotômetro.
Com relação aos diferentes métodos, Van Soest (1994) considerou que reagentes que contem enxofre (ácido sulfúrico) adicionam esse elemento a lignina, e métodos que utilizam de fervuras e aquecimentos tendem a gerar polímeros de Maillard, que são difíceis de serem removidos ou distintos da lignina, podendo assim promover resultados não verdadeiros.
Considerando especialmente o método de Klason, esse pode englobar polímeros de aldeído fenol, taninos e complexos taninos-proteina, cutina, plástico (contaminação) e polímeros de Maillard com a lignina (Van Soest, 1994).
A LDA tem como principal obstáculo à solubilização parcial dos componentes de lignina sendo que particularmente em gramíneas, valores de 2 a 4 vezes inferiores foram encontrados contrastando a metodologia de LDA com a lignina de Klason (Jung et al. 1997; Taxier, 1998).
	Comparando os dois métodos, Hatfield et al. (1994) destacaram que a maior diferença entre esses dois procedimentos é a sequência na qual a concentração de ácido e a temperatura são utilizadas para a hidrólise dos polissacarídeos e consideraram que principalmente para gramíneas, o método lignina Klason mais adequado do que LDA. Contudo, a finalidade da determinação de lignina por certo método pode ser mais adequado que outro devido as suas particularidades. Por exemplo, a análise de lignina pelo método de Klason é inflacionado por unidades de açúcares condensados nos resíduos insolúveis em ácidos e não teria importância para análise de um experimento que testasse o aumento da digestibilidade de determinada forragem com e sem tratamento químico, ao passo que se o enfoque do experimentofosse o rendimento exato da glicose após hidrólise, esse método não seria o mais adequado.
	O permanganato de potássio é um agente oxidante utilizado na separação da parede celular para a determinação da lignina por diferença de peso, sendo menos corrosivo e mais rápido mais do que LDA e lignina Klason (Giger, 1985). Porém, esse método pode superestimar o valor de lignina pela remoção de outros componentes da parede celular, pela interferência de outros compostos solubilizados e por não tratar igualmente as partículas de tamanhos diversos (Jung, 1997; Goering e Van Soest. 1970).
	A natureza aromática das unidades constituintes da lignina sugere a possibilidade do uso de métodos espectrofotométricos para sua determinação. O método colorimétrico da lignina solúvel em brometo de acetila foi modificado para uso analítico na planta forrageira intacta, bem como em suas frações de parede celular. Em uma comparação entre lignina em detergente ácido (LDA, método gravimétrico) e lignina solúvel em brometo de acetila (LSBA, método colorimétrico), com base na parede celular de Morrison, houve melhor concordância dos valores quando foi corrigido o fator cutina nas determinações em LDA, portanto o LSBA parece ser confiável e preciso instrumento para quantificar lignina em amostras de plantas forrageiras (Fukushima e Dehority, 2000).
Contudo, ainda existe generalizada falta de consenso quanto à técnica que, com aceitáveis graus de acuracidade e precisão, forneça confiáveis estimativas de lignina, afim que se otimizem balanceamentos de rações.
10. CONSIDERAÇOES FINAIS
A lignina é necessária para melhorar o suporte mecânico da planta, para dar resistência e vigor para a parede celular, além de apresentar uma importante função de defesa contra doenças, insetos, abaixamento da temperatura e outras formas de estresses (Jung et al., 1996). Assim sendo, uma vez que sabido as funções vitais para proporcionar a estabilidade agronômica para a planta, o entendimento da fisiologia e prioridades metabólicas do desenvolvimento, produção e persistência da planta forrageira, consistem em importantes ferramentas para a melhoria no aproveitamento das forragens na nutrição animal.
Discussões no âmbito de manipulações de genes e consequente melhoria no mérito genético das plantas forrageiras são fundamentais e a longo prazo. Os fatores ambientais, tais como: manejo da pastagem, tratamentos químicos ou fisicos na forragem, manejo no fornecimento da ração, correto balanceamento de nutrientes, além de condições ótimas para os fatores inerentes ao animal, constituem medidas a curto e médio prazo para aumentar a digestibilidade da forragem. Por fim, a lignina é uma fator importantíssimo na produção vegetal e na nutrição animal, sendo necessário maiores estudos e desenvolvimento de novas pesquisas, objetivando a promoção de um maior domínio desse assunto tão complexo.
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BESLE, J., CORNU, A., JOUANY, J. 1994. Roles of structural phenylpropanoids in forage cell walI digestion. J. Sci. Food Agric., 64:171-190.
CASLER, M.D., JUNG, H.G. 1999. Selection and evaluation of Smooth Bromegrass clones with divergent lignin or etherified ferulic acid concentration. Crop Sci., 39:1866-1873.
CORREIA, D.A.A. Bioquímica no solos, nas pastagens e forragens. Lisboa: 1980. p.439 e 727.
CHESSON, A. Mechanistic Models of Forage Celi Wall Degradation. In: JUNG, H.G.; BUXTON. D.R.; HATFIELD, R.D.; RALPH, J (Eds) Forage Cell Wall Structure and Digestibility. Madison, WI. p.347-376. 1993
FUKUSHIMA, R.S., DEHORITY, B.A. 2000. Feasibility of using lignin isolated from forages by solubilization in acetyl bromide as a standard for lignin analysis. J. Anim. Sci., 78:3135-3143.
FUKUSHIIMA, R.S., DEHORITY, B.A., LOERCI-I, S.C. 1991. Modification of a colorimetric analysis for lignin and its use in studying the inhibitory effect of lignin on forage digestion by rumen microorganisms. J. Anim. Sci.. 69:295-304.
FUKUSHIMA, R.S., ROSA, A.J.M., LIMA, C.G. et al. 1999. Comparação entre dois métodos analíticos para determinação da lignina de algumas gramíneas forrageiras. Pesq. Agropec. Bras., 34 (6):1025-1030.
GIGER, 5. 1985. Revue sur le methods de dosage de la lignine utilisees en alimentation animale. Ann. Zootech., 34:85.
GOERING, H.K. et al. Digestibility of roughage materiais ensiled with sodium chlorite. J. Dairy Sci., 56 (2):.233. 1973.
GOERING, H.K., VAN SOEST, P.J. 1970. Forage fiber analysis: apparatus. reagents, procedures. and some applications. Agric. Handbook No. 379; USDA/ARS: Washington. DC, 1-19.
HARTLEY, R.D. JONES, E.C. Phenolic components and degradability of cell walls of grass and legume species. Phytochemistry, Oxford, 6 (1531), 1977.
HATFIELD, R.D., JUNG, H.G., RALPH, J. et al. 1994. A comparison of the insoluble residues produced by the klason lignin and acid detergent lignin procedures. J. Sci. Food Agric.. 65:51 -58.
HATFIELD, R.D.; RALPH, J.; GRABBER, J.H. Celi wall structural foundations: molecular basis for improving forage digestibilities. Crop Sci., 39:27-37. 1999.
IIYAMA. K.; LAM, T.B.T.; STONE, B.A. Covalent cross-links in the ceil wall. Plant Physiology. 104: 3 15-320. 1994.
IIYAMA. K., WALLIS, A.F.A. 1990. Determination of lignin in herbaceous plants by an improved acetyl bromide procedure. J. Sci. Food Agric., 51:145-161.
JUNG, H.G. 1997. Analysis of forage fiber and cell walls in ruminant nutrition. J. Nutr., 127:810-813.
JUNG, H.G., ALLEN, M.S. 1995. Characteristics of plant celi walls affecting intake and digestibility of forages by ruminants. J. Anim. Sci., 73:2774-2790.
JUNG, H.G., BUXTON, D., HATFIELD, R. et al. 1996. Improving forage fiber digestibility. Feed Mix, 4:30-34.
JUNG, H.G., MERTENS, D.R., PAYNE, A.J. 1997. Correlation of acid detergent lignin and klason lignin with digestibility of forage dry matter and neutral detergent fiber. J. Dairy Sci, 80:1622-1628.
LAPIERRE, C. Application of new methods for the investigation of lignin structure. In: FORAGE CELL WALL STRUCTURE AND DIGEST1BILITY. H.G. Jung et al. (Ed.). p. 133. ASA, CSSA, and SSSA, Madison, WI. 1993.
MESHITSUKA. G., ISOGAI. A. Chemical structures of cellulose, hemicelluloses and lignins. In: CHEMICAL MODIFICATION OF LIGNOCELLULOSIC MATERIALS. D. N. S. Hon (Ed.). p. 11. New York, NY. 1996.
RALPH, J. Cell wall cross-linking in grasses — The importance of understanding plant chemistry and biochemistry. In: INFORMATIONAL CONFERENCE WITH DAIRY AND FORAGE INDUSTRIES. L.D. Satter (Ed.). p. 1. U.S. Dairy Forage Research Center. Madison. WI. 1996.
SUDEKUM, K.H., VOIGT, K., STANGASSINGER. M. 1997. Spectrophotometric investigations on lignin in wheat (Triticum aestivum L.): Influence of celI wall preparations, solvent, and standard. J. Agric. Food Chem., 45:1220-1228.
TERASHIMA, N., FUKUSHIMA, K. Comprehensive model of the lignified plant ceIl wall. ln: JUNG, H.G.; BOUXTON, D.R.; HATFIELD, R.D.; RALPH. J (Eds) Forage Cell Wall Structure and Digestibility. Madison, WI. p.247-269. 1993
TRAXLER, M.J., FOX, D.G., VAN SOEST, P.J. et al. 1998. Predicting forage indigestible NDF from lignin concentration. J. Anim. Sci., 76:1469-1480.
VAN SOEST, P.J. 1964. Symposium on nutrition and forage and pastures: new chemical procedures for evaIuating forages. J. Anim. Sci., 23:838.
VAN SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2. ed. Ithaca: CornelI University Press. 1994. 
WILSON, J.R. 1994. Cell wall characteristies in relation to forage digestion by ruminants. J. Agric. Sci., 122:173-182.
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