Micro clinica aula dia 21.03 final

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Microbiologia Clínica - Aula do dia 21/03 
Faringite Estreptocócica - 
A causa da faringite por Streptococcus pyogenes pode ser sugerida clinicamente observando-se uma mucosa faringeal edematosa e inflamada, em um paciente que relata dor de garganta, dificuldade em engolir e sintomas secundários como febre, cefaléia, sensibilidade dos linfonodos...
As manifestações clínicas da faringite estreptocócica e não-estreptocócica são muito superpostas (suporte laboratorial). 
Os estreptococos do grupo A são as espécies mais patogênicas para o ser humano, embora o mesmo seja o seu hospedeiro natural. Podem causar infecção estreptocócica da orofaringe, tonsilite, infecções de feridas e da pele, septicemia e pneumonia. Esse grupo pode causar infecções não supurativas como doença reumática, Coréia de Sydenham (Dança de São Vito) e glomerulonefrite difusa aguda. Porém inclusive pode causar a morte do indivíduo acometiodo em cerca de 1 mês.
• Faringite por Estreptococos dos grupos B: causam mais frequentemente infecções perigosas nos recém-nascidos (ex: sépsis neonatal) e infecções articulares (artrite séptica) e cardíacas (endocardite);
• Faringite por Estreptococos dos grupos C e G: frequentemente são transportados por animais, mas também crescem na orofaringe, no intestino, na vagina e no tecido cutâneo do ser humano. Esses estreptococos podem causar infecções graves, como a faringite estreptocócica, pneumonia, infecções cutâneas, sépsis pós-parto e neonatal, endocardite e artrite séptica. Após uma infecção por uma dessas bactérias, pode ocorrer inflamação dos rins.
 • Faringite por Estreptococos dos grupos D: crescem normalmente no trato digestivo baixo, na vagina e na pele adjacente.
Faringite por Arcanobacterium haemolyticum -
 Causa faringite aguda, geralmente em adolescentes e jovens adultos (diferente da faringite estreptococos β-hemolíticos, que tipicamente causam doença em crianças pequenas. 
Faringite Gonocócica -
Infecção na orofarínge por Neisseria gonorrhoeae;
É um diplococo gram-negativo, não flagelado, não formador de esporos, não hemolítico, aeróbio ou facultativamente anaeróbio que habita o trato respiratório superior do homem, sendo responsável pela gonorréia - doença sexualmente transmissível, com formato de rim;
Geralmente assintomática.
INFECÇÕES BACTERIANAS DO TRS
 DIFTERIA – Corynebacterium diphtheriae
Extremamente rara nos EUA, membrana espessa branco-azulada ou acinzentada que recobre a faringe posterior, difere da faringite que apresenta vermelho fogo para o diagnóstico;
 A Corynebacterium diphteriae é uma bactéria com formas pleomórficas bacilares Gram-positivas, agrupando-se em configurações semelhantes a "caracteres chineses"
 A Corynebacterium diphteriae não é invasiva e limita-se à multiplicação local na faringe. Contudo, a doença tem efeitos sistémicos potencialmente mortais, devido à produção e disseminação pelo sangue da sua poderosa toxina da difteria.
Apenas as cepas toxigênicas são capazes de causar a infecção.
Produz um exsudato escurecido nas amígdalas, eritema e inflamação local grave.
A toxina diftérica pode causar obstrução respiratória, insuficiência cardíaca e polineurite.
A difteria pode ser prevenida através de imunização (Vacina Tetravalente: DTP + Hib)
Como distinguir clinicamente uma faringite estreptocócica de uma difteria? 
R: As regiões da orofaringe estarão esbranquiçadas, mas quando o paciente tem difteria, existe uma linha negra ou azulada na região. O problema da difteria é a toxina liberada pelo Corynebacterium diphtheriae, que pode levar á uma insuficiência cardíaca. 
Otite média e sinusite - Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b Moraxella catarrhalis, S. pyogenes
Ouvido médio e seios paranasais são conectados às vias respiratórias por ductos;
Infecção ocorre quando vírus e bactérias caminham em direção às vias estéreis do ouvido e seios nasais;
As infecções agudas são causadas por vírus e por algumas bactérias;
Infecção crônica outros bacilos e fungos assumem o papel proeminente em uma infecção polimicrobiana.
É virtualmente impossível obter uma amostra passível de ser interpretada por meio de amostras das vias aéreas;
Felizmente os patógenos nas doenças agudas são previsíveis e o uso de antimicrobianos é necessário.
Em ambos os casos, otite média e sinusite, são regiões de difícil coleta. Nesses casos, o médico prescreve antibiótico, que vai atingir todos os microorganismos. 
Na otite média o diagnóstico é geralmente clínico. Faz-se uma anamnese e um exame físico com otoscopia. Cultura é realizada quando o tratamento não está tendo efeito. Logo, cultura não é exame de rotina.
Otite externa -
Fatores predisponentes: calor, ambiente úmido, usos de aparelho de amplificação sonora, uso de cotonetes e natação;
Cor esverdeada é comum ser infecção por Pseudomonas aeruginosa (pigmento piocianina);
Presente no ambiente.
Epiglotite -
Infecção grave da epiglote, potencialmente fatal mas que felizmente foi praticamente eliminada pela imunização è Problema do edema bloquear as vias aéreas (traqueostomia= abertura na região anterior ao pescoço);
Mais comumente causada por Haemophilus influenzae do tipo B;
Diagnóstico clínico para não causar agravamento da doença.
Melhor forma de evitar é com a vacina contra H. influenzae tipo B.
Na infância, tomamos a vacina da meningite. Essa vacina é produzida a partir de H. influenzae tipo B. Por isso são raros os casos de epiglotite, pois já estamos imunizados. 
Laringite - Mais comumente causada por vírus. A cultura bacteriana é raramente indicada, exceto para descartar difteria ou infecção estreptocócica.
CULTURA DE AMOSTRAS DO TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR:
Precisa-se de um ambiente adequado para a coleta. 
Luz na cavidade oral. Solicita-se que o paciente abra bem a boca e diga “aaa” (serve para levantar a úvula e não deixar dar ânsia de vômito).
Língua é pressionada com uma espátula de língua e um swab é orientado sobre a língua até a faringe posterior especialmente nas áreas edemaciadas, adjacentes aos pontos com pus ou placas;
Cuidado para não encostar nas paredes laterais da cavidade bucal ou a língua para minimizar a contaminação com bactérias comensais;
Após a coleta o swab deve ser colocado imediatamente em um tubo estéril;
Encaminhar ao laboratório em até 12 horas em temperatura ambiente
Para melhorar o isolamento de Streptococcus pyogenes, a extremidade do swab pode ser colocada em um desidratante, tal como sílica gel.
Serão necessários dois swab: um para cultura e outro para microscopia. 
Teste Rápido -
Detecção direta de antígeno de estreptococo do grupo A (S. Pyogenes);
 Teste disponível comercialmente e pode ser liberado em 20 minutos após a chegada do material ao laboratório;
 Detecção é por coaglutinação, ELISA ou aglutinação em partículas de látex (possuem anticorpos);
 Vantagem: rapidez e possibilidade de fazer o diagnóstico da infecção mesmo em pacientes com uso de antimicrobianos;
 Desvantagem: Pode dar negativo quando o número de bactérias é reduzido. É recomendável que o teste negativo seja confirmado com a cultura.
Exames Microscópicos -
Diagnóstico de candidíase oral: 
Principalmente em recém-nascidos e adultos debilitados.
Candida albicans;
Coletar a amostra com swab e introduzi-lo em 0,5 ml de solução fisiológica estéril.
Preparar uma lâmina a partir da solução homogeneizada e cobrir com lamínula. Observar ao microscópio com objetiva de 10x a presença de células leveduriformes.
Exame para o método de GRAM também pode ser utilizado.
 Diagnóstico de Angina de Vincent: Gengivite ulcerativanecrosante aguda (GUNA)
 Ulceração da faringe ou gengiva e causada pela associação entre espiroquetas e bacilos fusiformes;
Exame laboratorial direto em lâmina corada pelo método de Gram;
Coletar a amostra da região ulcerada com swab e confeccionar uma lâmina para coloração;
A presença de numerosos leucócitos polimorfonucleares, espiroquetas e bacilos fusiformes confirma essa infecção.
Cultura -
Semeadura:Rolar o swab em uma pequena área de uma placa contendo o meio de cultura;
 Se a amostra for líquida, depositar de 3 a 4 gotas sobre a pequena área da placa do meio de cultivo selecionado;
 Estriar com o auxílio de uma alça bacteriológica em três direções próximas uma da outra para obter colônias isoladas e para, se necessário, semiquantificar;
Semeadura em meios sólidos em tubos:
Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de intensa massa de microorganismos.
Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de pequena massa de microorganismos.
Picada Central (mais utilizada): semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Não usar alça bacteriológica pois ela pode rasgar o meio de cultura. Em alguns casos, pode-se fazer estrias na superfície, para ver a fermentação da bactéria e seu metabolismo.
Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.
Semeadura em meios sólidos em placas de petri:
Pour-plate ou disseminação (método em profundidade):
Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares.
Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de microorganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada.
Estria simples (mais utilizado): transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zig- zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos. A intenção das estrias é visualizar múltiplas colônias individualizadas. 
Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:
 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.
 
4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.
Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.
Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica/swab/alça Drigalsky. Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.
Semeadura em meios líquidos:
Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.
Incubação
Placas em estufa com 5 a 10% de CO2 a 35 graus por 24 a 48 horas.
 No caso de suspeita de Arcanobacterium haemolyticus, N. meningitidis e N. gonorrhoeae, as placas devem ficar 72 horas na estufa.
Avaliação das Culturas
 Após 18h e 24h de incubação, realizar a primeira leitura das placas para verificar a presença de microrganismos.
Cultura de material de garganta
Objetivo:
 Dirigido para infecção causada por estreptococos hemolíticos do grupo A;
 Diagnóstico da difteria e da coqueluche;
 Pesquisa de portadores de Neisseria meningitidis.
 
Flora normal da garganta:
Inclui estreptococos alfa-hemolíticos e mesmo beta-hemolíticos não pertencentes ao grupo A, Moraxella catrrhalis e neisserias saprófitas, Staphylococcus epidermidis (eventualmente Staphylococcus aureus), bacilos difteróides e enterobactérias.
Finalidade: Detectar estreptococos beta-hemolíticos do grupo A;
 Detectar meningococos;
 Verificar predominância de Staphylococcus aureus;
 Haemophillus influenzae;
 Isolamento de Corynebacterium diphtheriae;
 Diagnóstico da angina de Vincent.
 Resultado do exame: Dependerá não somente do organismo presente mas também do número relativo de colônias.
Testes diagnósticos para Estafilococos
Prova da catalase: 
Catalase é a enzima que quebra H202, gerando H20 + O2. Podemos fazer esse teste em uma lâmina, colocando o material nela. Esfregue a colônia na lâmina, coloque uma gota de peróxido de hidrogênio. Se por acaso houver a formação de bolhas, o teste será positivo. Se não formar bolhas, o teste é negativo. 
No caso de trato respiratório superior com material de orofaringe, se der bolhas, será positivo para staphylococcos (o primeiro a se pensar é no aureus). Se não der bolhas, começamos a pensar em outras bactérias. 
Prova da coagulase:
Identifica a capacidade do microorganismo formar coágulos no plasma. Existe o teste ''livre'' e o ''ligado''.
Ligado: Coloca-se plasma humano ou de coelho, diluido 1:5 em solução fisiológica estéril. O plasma pode ser liofilizado. Coloca a bactéria com o plasma na lâmina, esperar 5min á temperatura ambiente e olha. Se por acaso em alguma bactéria for observada a presença de grumos esbranquiçados, o teste será positivo para staphylococcos aureus. Caso não forme nada, será negativo. Só fazemos isso quando o teste da catalase der positivo. 
Livre: Usar o tubo de ensaio estéril. Colocar a colônia e incubar á 37°C, em banho-maria. Essa incubação pode ter resultado em até 24h. Inverte-se o tubo de ensaio e se ele ainda estiver líquido, é um teste negativo. Se inverter o tubo e ele estiver sólido, o resultado é positivo para staphylococcos aureus. Esse teste é o mais indicado pois é o mais controlado e coloca a bactéria em condições ótimas. 
Prova da DNAase:
Usado para identificar staphylococcos. Semeia-se a bactéria em um meio com DNA. As colônias que suspeitamos que sejam staphylococcos crescerão. Se forem mesmo staphylococcos, eles secretam DNAase, que quebra DNA do meio. Uma maneira de evidenciar o DNA é colocar ácido clorídrico, mas vai condensar o DNA. Se por acaso a bactéria secreta DNAase, na hora em que colocarmos o HCl, há a formação de um halo, pois o DNA já foi degradado (não foi condensado). Nesse caso, o teste é positivo para S. Aureus. Se por acaso, quando o HCl for colocado, condensando o DNA e o que estiver ao redor das colônias, significa que a bactéria não secretou DNAase, tornando o teste negativo. 
Testes diagnósticos para Estreptococos
Prova da CAMP: 
Para identificar Streptococcos agalactiae. É realizado sempre em ágar-sangue. Teremos uma placa de petri, que é ágar-sangue. Semeia-se a bactériaem ágar-sangue, mas primeiro é preciso semear a bactéria S. aureus. Coloca o S. aureus, coloca a bactéria que não sabemos qual é e semeia-a perpendicularmente, sem encostar no aureus. Incubar á 37°C e deixar por 24h, esperando a bactéria crescer. Se por acaso a bactéria formar ''setas'', o teste é positivo para S. agalactiae. A seta, como está em ágar-sangue, significa a hemólise das hemácias. Isso porque o S. agalactiae é beta-hemolítico. Quando ele está perto do aureus, as hemolisinas do mesmo potencializa a hemólise total do agalactiae. 
Prova da bile-solubilidade:
Para identificar S. pneumoniae. Utiliza a bile de boi. Se tiver presença de pneumococos, a bile de boi acaba ativando enzimas autolíticas do pneumococos, que fazem degradação da bactéria. Coloca-se a bile de boi em um tubo de ensaio e aguarde. Se o tubo continuar turvo, o teste é negativo. Se o tubo ficar limpo, com depósitos de bactérias apenas, o teste será positivo para S. pneumoniae. 
Prova da optoquina: 
Também serve para identificar pneumococos. A optoquina é um antibiótico. Semeia a bactéria de maneira confluente na placa de petri, contendo a optoquina. Incuba-se o material. Se na incubação houver a formação de um halo de inibição ao redor do disco, significa que a bactéria é sensível á esse antibiótico. Com isso, se ela for sensível, o teste é positivo para pneumococos. 
Testes diagnósticos para Haemophilus influenzae
Prova do satelismo:
Identifica H. influenzae do tipo B. Pega-se uma placa de petri e utiliza ágar-sangue para cultivar. O H. influenzae B não cresce nesse meio (cresce em ágar-chocolate). Utilizamos o S. epidermidis e o semeamos. Eles secretam fator V de crescimento, que ajudam o H. influenzae a crescer. Se houver mesmo crescimento junto ao S. epidermidis, chegamos ao diagnóstico de H. influenzae B. 
Teste dos discos com fatores de crescimento:
A bactéria não cresce muito bem em ágar-sangue, a não ser que possuam fatores de crescimento. Semeia a bactéria em um meio que não seja ágar-chocolate e vai colocar discos que contenham fator X e fator V. Se por acaso houver crescimento da bactéria ao redor desses discos, o teste é positivo para H. influenzae.