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SEQUENCIAMENTO DE DNA Métodos de Sequenciamento - Método Manual (Sanger & Coulson) TERMINAÇÃO DE CADEIA - Método de sequenciamento automatizado Método de Sanger & Coulson Clonagem gênica PCR modificado DNA fita simples Método de Sanger & Coulson - Molécula a ser sequenciada é clonada em M13 Método de Sanger & Coulson - Síntese da fita complementar INICIADOR KLENOW Método de Sanger & Coulson - Síntese da fita complementar INICIADOR KLENOW ddXTP dNTP 1:100 Método de Sanger & Coulson “terminador de cadeia” * Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Condições de eletroforese: - Gel de poliacrilamida (< 0,5 mm) - Uréia ou formamida - Voltagem elevada - Aquecimento 60°C Método de Sanger & Coulson E l e t r o f o r e s e p o l i a c r i l a m i d a Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Sequenciamento em ciclos térmicos - Combinação PCR X SEQUENCIAMENTO - Apenas um dos iniciadores - Taq polimerase - Quatro reações distintas - dNTP e ddNTP Sequenciamento em ciclos térmicos Sequenciamento automático - Marcadores fluorescentes diferentes ligados aos ddNTP - Reação ocorre no mesmo meio reacional - Detecção através de laser Sequenciamento automático Sequenciamento automático eletroforese capilar Sequenciamento automático Sequenciamento automático Sequenciamento automático Montando uma sequência de DNA extensa - Método manual capaz de fornecer sequências em torno de 400 nucleotídeos - Método automatizado capaz de fornecer sequências em torno de 750 nucleotídeos Montando uma sequência de DNA extensa - Como sequenciar um genoma? - Tratamento com várias endonucleases de restrição (4 a 5 enzimas) - Sonicação da amostra de DNA (ultra-som) Tratamento com enzimas restrição Tratamento com enzima restrição 4 a 5 enzimas restrição Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa SEQUENCIAMENTO DE DNA Métodos de Sequenciamento Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Método de Sanger & Coulson Slide Number 14 Sequenciamento em ciclos térmicos Sequenciamento em ciclos térmicos Sequenciamento automático Sequenciamento automático Sequenciamento automático Sequenciamento automático Sequenciamento automático Sequenciamento automático Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Tratamento com enzimas restrição Tratamento com enzima restrição Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Montando uma sequência de DNA extensa Slide Number 31 Slide Number 32 Slide Number 33 Slide Number 34 Slide Number 35 Slide Number 36 Slide Number 37
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