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Sequenciamento de DNA

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SEQUENCIAMENTO DE DNA
Métodos de Sequenciamento
- Método Manual
(Sanger & Coulson)
TERMINAÇÃO DE CADEIA
- Método de sequenciamento automatizado
Método de Sanger & Coulson
Clonagem gênica PCR modificado
DNA fita simples
Método de Sanger & Coulson
- Molécula a ser sequenciada é clonada em M13
Método de Sanger & Coulson
- Síntese da fita complementar
INICIADOR
KLENOW
Método de Sanger & Coulson
- Síntese da fita complementar
INICIADOR
KLENOW
ddXTP dNTP
1:100
Método de Sanger & Coulson
“terminador de cadeia”
*
Método de Sanger & Coulson
Método de Sanger & Coulson
Método de Sanger & Coulson
Condições de eletroforese:
- Gel de poliacrilamida (< 0,5 mm)
- Uréia ou formamida
- Voltagem elevada
- Aquecimento 60°C
Método de Sanger & Coulson
E
l
e
t
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o
f
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r
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s
e
p
o
l
i
a
c
r
i
l
a
m
i
d
a
Método de Sanger & Coulson
Método de Sanger & Coulson
Sequenciamento em ciclos térmicos
- Combinação PCR X SEQUENCIAMENTO
- Apenas um dos iniciadores
- Taq polimerase
- Quatro reações distintas
- dNTP e ddNTP
Sequenciamento em ciclos térmicos
Sequenciamento automático
- Marcadores fluorescentes diferentes
ligados aos ddNTP
- Reação ocorre no mesmo meio reacional
- Detecção através de laser
Sequenciamento automático
Sequenciamento automático
eletroforese capilar
Sequenciamento automático
Sequenciamento automático
Sequenciamento automático
Montando uma sequência de 
DNA extensa
- Método manual capaz de fornecer 
sequências em torno de 400 nucleotídeos
- Método automatizado capaz de fornecer 
sequências em torno de 750 nucleotídeos
Montando uma sequência de 
DNA extensa
- Como sequenciar um genoma?
- Tratamento com várias endonucleases de 
restrição (4 a 5 enzimas)
- Sonicação da amostra de DNA (ultra-som)
Tratamento com enzimas restrição
Tratamento com enzima restrição
4 a 5 enzimas 
restrição
Montando uma sequência de 
DNA extensa
Montando uma sequência de 
DNA extensa
Montando uma sequência de 
DNA extensa
Montando uma sequência de 
DNA extensa
	SEQUENCIAMENTO DE DNA
	Métodos de Sequenciamento
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Método de Sanger & Coulson
	Slide Number 14
	Sequenciamento em ciclos térmicos
	Sequenciamento em ciclos térmicos
	Sequenciamento automático
	Sequenciamento automático
	Sequenciamento automático
	Sequenciamento automático
	Sequenciamento automático
	Sequenciamento automático
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Tratamento com enzimas restrição
	Tratamento com enzima restrição
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Montando uma sequência de DNA extensa
	Slide Number 31
	Slide Number 32
	Slide Number 33
	Slide Number 34
	Slide Number 35
	Slide Number 36
	Slide Number 37

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