padronização de western blotting para diagnostico do mormo em equídeos

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XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro. 
 
PADRONIZAÇÃO DE WESTERN BLOTTING PARA DIAGNÓSTICO 
DO MORMO (Burkholderia mallei) EM EQUÍDEOS 
 
Marcus Vinícius Dias Falcão
1
, Vania Lucia de Assis Santana
2
, Cristiane de Melo Vasconcelos
3
 Cecilia Maria de Souza 
Leão e Silva
4 
Marcília Maria Alves de Souza
5
 Luiz Evandro da Silva
6
 Mariana Lumack do Monte Barretto
7
 
 
 
Introdução 
O mormo constitui-se em uma doença altamente contagiosa dos solípedes causada pela Burkholderia mallei, uma 
bactéria Gram-negativa, não móvel e cocobacilo aeróbio (Loeffler, 1886; Yabuuchi et al., 1992), composta de uma 
cápsula de polissacarídeo, sendo esta estrutura responsável pela sua virulência (Popov et al., 1995, 2000; Fritz et al., 
1999, 2000; Deshazer et al., 2001). A B. mallei primariamente infecta cavalos, burros e mulas, entretanto humanos são 
considerados hospedeiros acidentais (Waag & Deshazer, 2004). 
 Animais infectados assintomáticos são a principal via de transmissão do mormo, sendo a bactéria carreada por meio 
das secreções contaminadas oriundas das lesões pulmonares, constituindo-se deste modo, as vias aéreas a principal via 
de eliminação da B. mallei (Radostits et al., 2002). A via oral é a principal via de infecção, podendo também ocorrer à 
contaminação por via respiratória, cutânea ou genital (Radostits, 2002). Ocasionalmente, pode infectar felídeos através 
da ingestão de carne de cavalo contaminada (Galati, 1973; Hart, 1916). 
 A B. mallei está relacionada na lista de doenças da Organização Mundial para a Saúde Animal (OIE) como doença de 
importância de saúde pública, e devido ao seu alto potencial de infecção é referenciada como agente de bioterrorismo 
(Derbyshire 2002; Ulrich et al., 2006; Witlock et al, 2007; Losada et al., 2010). O diagnóstico precoce de mormo 
constitui um dos mais importantes e difíceis tarefas que enfrentam médicos e médicos veterinários no trabalho sanitário 
(Moller & Eichhorn, 1911) e ainda depende de provas sorológicas. De acordo com a OIE (2013) o diagnóstico 
compreende o teste sorológico, alérgico e o isolamento bacteriano. Para o teste da maleína, observa-se uma resposta 
celular evidenciada por reação inflamatória intradermo-palpebral. Já o teste de fixação do complemento (TFC) o qual 
apresenta alta especificidade, baseia-se na detecção de anticorpos específicos contra a B. mallei que podem ser 
detectados uma semana após a infecção. Western Blotting (WB), também conhecido como imunoblotting (IB), é uma 
técnica bem estabelecida e amplamente utilizada para a detecção e análise das proteínas. O método é baseado na 
construção de um complexo anticorpo-proteína através da ligação de anticorpos específicos em proteínas imobilizadas 
sobre uma membrana e a detecção de anticorpo ligado a partir de vários métodos de detecção (GE Handbook, 2011). A 
técnica de IB foi usada como padrão ouro por Elschner, et al. 2011. O teste detecta animais com clínica inaparente e 
aqueles infectados na fase crônica (Schlater, 1992). Os benefícios do WB em soros anticomplementares já foi destacado 
por Katz, et al., 1999 & Elschner, et al. 2011. No Brasil, aplica-se o TFC para trânsito animal e, em alguns casos, a 
aplicação da maleína (BRASIL, 2004). 
O presente trabalho objetivou padronizar a técnica de Western Blotting para o diagnóstico de mormo em equídeos. 
 
Material e métodos 
 Foram processadas 45 amostras de asininos e 19 amostras de muares, totalizando 64, utilizando-se a técnica de 
Western Blotting segundo Elschner et al. (2011) no Laboratório Nacional Agropecuário de Pernambuco (LANAGRO-
PE). A técnica preconiza a preparação do antígeno lipopolissacarídeo (LPS) parcialmente purificado a partir dos três 
cepas virulenta de B. mallei (Bogor, Zagreb e Mukteswa) (Elschner, et al., 2011). O antígeno é transferido para uma 
membrana de 0,45µM de nitrocelulose (Invitrogen®) usando o Novex Blot Module (Invitrogen®). A membrana foi 
acondicionada em Blocking solution (Candor Bioscience®), durante noite, lavada e cortada em tiras de 3 mm e 
armazenado a -20 ° C. As tiras foram colocadas para reagir com soro testado na diluição de 1:50 com solução Low 
Cross (LC) (Invitrogen®) por 1,5h em seguida realizou-se a lavagem com solução Washing buffer (Candor 
Bioscience®), três vezes de 20 minutos. Prosseguindo, as tiras foram incubadas durante 1,5 horas em conjugado IgG 
com fosfatase alcalina antihorse (IgG AP antihorse) (Sigma® ) na diluição de 1:5000 com LC . Realizou-se outra 
lavagem com a mesma solução anteriormente citada. Na fase indicadora da reação, utilizou-se o substrato NBT-BCIP 
 
1 Primeiro Autor é discente da Universidade Federal do Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 
52171-900. E-mail: mdfalcao@gmail.com. 
2 Segunda Autora é Fiscal Federal Agropecuária do Laboratório Nacional Agropecuário, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Rua 
Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 52171-900. 
3 Terceira Autora é discente da Universidade Federal do Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 
52171-900. 
4 Quarta Autora é discente da Universidade Federal do Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 
52171-900. 
5 Quinta Autora é Fiscal Estadual Agropecuária do Laboratório Nacional Agropecuário, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Rua 
Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 52171-900. 
6 Sexto Autor e Licenciado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois 
Irmãos, Recife, PE, CEP: 52171-900. 
7 Sétima Autora é discente da Universidade Federal do Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP: 
52171-900. 
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(Invitrogen®), durante 10 minutos ou até surgirem as bandas de lipopolissacarídeos (LPS). A reação foi parada com 
água ultrapura. Os resultados positivos são bastantes confiáveis devido à detecção dos lipopolissacarídeos por peso 
molecular de 37 kDa, enquanto que o negativo não apresenta marcação no strip e o resultado inconclusivo apresenta-se 
entre o negativo e o positivo, porém não marcado na fita (figura 1). 
 
Resultados e Discussão 
Dentre as amostras de asininos processadas, 15 apresentaram-se positivas e 30 negativas. Dentre as amostras dos 
muares, 4 foram positivas e 15 negativas. Todos os testes foram acompanhados de soros controles cujos resultados eram 
anteriormente conhecidos, para certificação do resultado apresentado no teste. Comparado ao TFC, o Western Blotting 
apresenta-se apto a suplementá-lo, por evitar os falsos positivos existentes no primeiro (Elschner et al. 2011). 
Entretanto, o teste de WB para diagnóstico da B. mallei apresenta reação cruzada, devido aos epítopos produzidos pelos 
anticorpos durante a infecção com os epítopos dos anticorpos produzidos por infecção por B. Pseudomallei, levando ao 
aparecimento de animais falsos positivos (Elschner et al. 2011). 
Com a realização do teste segundo Elschner et al. (2011), foi comprovada a eficiência do WB como teste confiável 
em muares e asininos, por se tratar de uma detecção por peso molecular dos lipopolissacarídeos. Mesmo com a 
utilização de anticorpo anti IgG específico para equinos, o teste mostrou-se eficiente quando utilizado para muares e 
asininos, portanto, não é relevante o anticorpo conjugado para a realização da prova, porque os muares e asininos 
pertencem ao mesmo gênero, apenas com diferença na espécie. Desta forma, o uso do WB na detecção do mormo em 
muares e asininostorna-se um aliado no diagnóstico desta doença nas áreas endêmicas, mostrando-se como teste 
complementar quando comparado ao teste oficial preconizado pela OIE (2013), o qual apresenta variação quanto à 
técnica e o antígeno utilizados (Khan, 2011). 
 
Agradecimentos 
 Agradeço ao CNPq pela concessão da bolsa e aos colaboradores. 
 
Referências 
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Figura 1. 1, Resultado negativo; 2, Resultado inconclusivo; 3, Resultado positivo (Elschner et al., 2011).