Biologia Molecular

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INTRODUÇÃO
*DOGMA DA BIOLOGIA MOLECULAR: não costuma cobrar, mas é importante ver.Teve um ano que ela perguntou o que é o dogma.
*proteínas são compostas por aminoácidos,carboidratos por monossacarídeos, e DNA e RNA por ácidos nucleicos, que são compostos menores.
*ácido nucleico é composto por:
-açúcar: é uma pentose central;
é um anel fechado, que tem seu carbono 5 para o lado de fora;
liga o fosfato à base nitrogenada;
é uma ribose: tanto o açúcar do DNA quanto do RNA é uma ribose, pois a desoxirribose (do DNA) é um tipo de ribose.
-base nitrogenada:
purinas (1 anel de 5C e 1 anel de 6C): adenina e guanina. TEM 2 ANEIS.
pirimidinas (1 anel com 6C) : citosina, uracila, timina. TEM 1 ANEL.
É um anel heterocíclico de Nitrogênio e Carbono;
O N na posição 9 (ATENÇÃO: não é o Nitrogênio 9, não tem 9 Nitrogênios) se liga na pentose através do carbono 1 da purina;
O N na posição 1 se liga na pentose através do carbono 1 da pirimidina.
DICA: A que tem 1 anel só, não tem N9.
-fosfato:
vem do ácido fosfórico, que perde hidrogênio;
se liga na pentose pelo C5.
PROVA: 'A uracila é uma timina com um grupo metil (CH3) a mais.' 
FALSO. É a timina que tem um grupo metil a mais que a uracila. (é o contrário).
PROVA: 'A ribose só está presente no RNA.'
FALSO. A ribose está presente também no DNA (desoxirribose).
*C3 tanto do DNA quanto do RNA tem hidroxila.
C2 do RNA tem hidroxila.
C2 do DNA tem hidrogênio.
PROVA: 'A presença do grupamento H no C2 da pentose define se meu nucleotídeo é de DNA ou de RNA.'
FALSO. Ambos tem H na posição 2(mesmo que escondido, já que o carbono faz 4 ligações). Então o que define é a presença do OH, que será RNA e não DNA.
PRIMEIRA PERGUNTA DA PROVA: 'Como são formados os nucleotídeos?'
Através de uma molécula de ribose ligada pelo cabono 1 ao N9 das purinas e ao N1 das pirimidinas, e ligada ao carbono 5 ao grupamento fosfato.
*Como formar as fitas de DNA ou RNA?
Ligando os nucleotideos, dentro da mesma fita, por ligações chamadas pontes de fosfato (envolve H da posição C3 da pentose do primeiro nucleotídeo e envolve o fosfato que está na posição C5 da pentose do segundo nucleotideo).
*Sempre será assim: ligação da OH ao P.
*Extremidade 5'= quer dizer que o P da extremidade 5' está vazia
Extremidade 3'=quer dizer que a OH da extremidade 3' está vazio
*DNA é dupla fita ou seja, além dessa ligação pontes de fosfato, que ocorre entre os nucleotídeos (na mesma fita) haverá também a ligação de hidrogênio (não fale ponte de hidrogênio) entre as fitas.
*obs.: ligação ponte de fosfato é um tipo de ligação covalente.
*estrutura dos ácidos nucleicos estão diretamente relacionadas com suas funções.
Ex.: a função do DNA é perpetuar a informação genética, então sua estrutura tem que ser muito estável, não pode sofrer alteração de uma geração para a outra e sim manter-se conservado. Por isso ele tem estrutura secundaria (dupla helice).
 a função do RNA é decodificar a linguagem de acido nucleico para proteína. Tem 3 tipos de RNA, então precisa ter uma estrutura dinamica, e por isso é fita simples. O RNAt é igual um trevo de 4 folhas porque pareia sobre si mesmo. 
*DNA tem timina, e RNA tem uracila
*OH no C2 do RNA garante que ele faça muitas reações, garante ser mais instável e mais reativo que o DNA.
*pareamento do DNA:
entre Adenina e Timina forma 2 ligações de hidrogênio e entre citosina e guanina formam-se 3 ligações de hidrogênio. Esses pares são ditos obrigatórios ou de Watson e Crick.
Porém consegue-se fazer o pareamento de Adenina e Guanina, por exemplo.Mas entre adenina e timina forma 2 ligações, já se parear A com G a disposição espacial permite formar só 1 ligação de hidrogênio, ou seja, não é estavel suficiente para serem consideradas complementares. 
*para ocorrer o pareamento de 2 pares de bases, é necessario formar ligaçoes de hidrogenio, que depende deles estarem perto. Como os fosfatos são negativos, ele devem estar longes um do outro para não haver repulsão, e as bases proximas para formar ligação de hidrogênio.
*sempre pareia purina com pirimidina
*Classificação de proteínas quanto à natureza quimica:
-simples= formada apenas por aminoácidos.
-conjugada= além dos aminoácidos, é formada por um grupo prostético, que varia. Se for um lipídio, a proteina será uma lipoproteína. Se for um carboidrato, a proteina será uma glicoproteína.
-derivada= quando gera proteínas menores a partir da hidrólise parcial de proteínas muito grandes.
*Classificação das proteínas quando ao papel biológico:
-reguladoras=enzimas e hormonios.
-estruturais=como quitina, queratina.
-protetoras=anticorpos.
*Classificação das estruturas das proteínas:
-primária=é o colar de pérolas; aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas.
-secundária=aminoácidos começam a formar estruturas como a dupla hélice.
-terciária=novelo; os aminoácidos se enovelam sobre eles mesmos.
-quaternária=quando há mais de uma cadeia.Uma cadeia se liga à outra
PROVA: classifique as proteínas quanto ao papel biológico
REPLICAÇÃO=duplicação
*DNA vai ser duplicado, em sua maioria, na fase S da intérfase celular
*é necessário duplicar para se dividir, como na mitose, por exemplo
*ocorre simultaneamente nas 2 fitas e na mesma direção nas 2 fitas
*é semicpnvervativa pois de uma molecula velha, forma 2 moleculas novas. As moléculas novas terão uma fita da molécula velha e uma fita nova.
*o corpo tem um maquinário de replicação e que envolve muitas enzimas. Tais enzimas passam todas juntas, mas para fins didáticos, são separadas como se cada uma fizesse o serviço separado.
*DNA fica embolado dentro da célula porque é muito extenso. Se ficasse esticado, não caberia dentro da célula. Preciso de enzimas que exponham uma parte dele, já que não tem tendencia de se esticar pois está em fita dupla e assim, muito estável (já falamos isso).
*proteinas iniciadoras:
-sintetizadas na fase G1 da intérfase
-fazem igual uma tesoura: dão um pique do DNA, um pequeno corte que expõe um pequeno numero de bases em fita simples. Mas o DNA em sua maioria continua ligado em fita dupla.
*topoisomerase:
-alivia a torção do DNA, esticando ele. Isso facilita a replicação, porque ela libera a passagem das próximas enzimas.
*helicase:
-gasta ATP pra romper a ligação de H
-transforma a fita dupla em 2 fitas simples
*SSB:
-tipo bolinhas que se ligam temporariamente nas fitas
-como a ligação de H é muito forte, precisa dessa enzima para impedir que as fitas se liguem
*primase:
-é uma RNA polimerase, ou seja, sintetiza um primer de RNA
-o primer permite que ocorra a ligação da DNA polimerase(próxima enzima) que fará a sintese do DNA, que sera complementar à fita velha
*DNA polimerase:
-faz a síntese de DNA
-antes de adicionar um nucleotideo, ela volta e confere o nucleotideo anterior. Logo, também tem uma função revisora.
*2 fitas moldes:
-fita líder (velha) = dá origem a fita contínua (nova)
-fita retardatária (velha) = dá origem a fita descontinua (nova)
*replicar fita líder:
DNA polimerase se liga 1 vez na fita e replica do inicio ao final
*replicar fita retardatária:
-DNA polimerase se liga e desliga da fita várias vezes, formando vários pedaços independetes de DNA que são os fragmentos de Okasaki.
-ainda terá, além da enzima DNA polimerase, a DNA ligase, que liga os fragmentos de Okasaki.
PROVA: 'Cite todas as enzimas envolvidas na replicação da fita líder': falar até a DNA polimerase.
 'Cite todas as enzimas envolvidas na replicação da fita retardatária': falar até a DNA ligase.
*sentido da vida, sentido da replicação do DNA= 5'-3'. Pra dar origem a uma fita de replicação 5'-3', a fita líder tem que ser 3'-5'. 
*primer tem a mesma polaridade da fita, ou seja, na extremidade 5' tem fosfato e na 3' tem OH. A polimerase liga no OH e começa a fazer replicação do OH para o P e vai me dar uma fita contínua.
*fita líder: 3'-5' fita contínua: 5'-3'
 fita retardatária: 5'-3' fitadescontínua: 3'-5'
*todo primer que a primase fizer, vai ter a mesma polaridade: P - OH. Como não é o P que se liga ao OH, e sim o OH que se liga ao P, ela começou a fazer a replicação de trás pra frente: do OH do segundo para o P do primeiro e assim sucessivamente, sintetizando pequenos fragmentos de DNA que são os fragmentos de Okazaki. Apesar da fita descontínua ser 3'-5', a replicação ocorre no sentido 5'-3'.
Depois disso, os primers serão substituidos por DNA. Vem uma enzima que liga os fragmentos de Okazaki: DNA ligase.
*cada lugar que a replicação começa é chamada de ORI, origem de replicação.
* se no DNA circular (de bacteria) eu tenho 1 ORI, haverá a ação de todas as enzimas, as proteinas iniciadoras abrirão em fita simples, formando a bulha de replicação, que é um monte de base em fita simples.
*a replicação é bidirecional. Toda vez que houver uma ORI, ela vai replicar tanto de um lado quando para o outro
*se fosse ter uma origem de replicação para duplicar todo o DNA, a duplicação seria infinita. Entao o organismo faz varias ORIs em que a replicação vai ser bidirecional e em certos momentos vão se encontrar
*A cada ORI eu tenho a bulha de replicação que vai me dar essa forquilha
*fita lider= anda pro mesmo sentido da forquilha, sentido que a forquilha esta andando
 fita retardataria= anda pro sentido contrario da forquilha
Por isso que nem sempre uma fita é lider ou retardataria, depende da forquilha.
*OBS.: Slide errado: a enzima desliza no sentido 3'-5' pra originar a 5'-3'
*todo cromossomo tem sequencia que sao codificaveis (DNA que passa pra RNA e que é traduzido em proteina) e partes não descodificaveis, que são partes correspondentes ao centromero e telomero
*telomero
-ponta dos cromossomos
-quando há divisao celular, na fita lider ocorre tudo bem, mas no último primer da tardia, nao vai ter OH pra substituir, então nao vai substituir esse primer por DNA, e vai sumir esse pedaço. Como consequencia, a extremidade 5' da fita nova fica mais curta que a fita original. Entao esse pedaço que o DNA perde a cada divisao é o telomero.
A cada divisao a celula fica mais curta mas nao tem problema, porque o telomero é uma parte que nao seria traduzida mesmo. Entao enquanto a celula perde telomero, a celula se mantem normal. O problema é quando encurta tanto que acaba o telomero, e começa a perder parte do material genetico que viraria proteina, e a celula entra em apoptose. Logo, a função do telômero é proteger esse material genetico, alem de marcar o inicio de um cromossomo e o fim do outro. 
Cada telomero dura mais ou menos 125 divisões celulares. A partir da 126 divisão, celula entra em apoptose.
Celula sem telomero: na primeira divisão ela perderia o material genético.
*enzima telomerase:
-quando o DNA fica curta, ou seja, perdeu telomero, ela completa esse pedaço. Assim, a celula nunca terá telomero encurtado, então nao entrara em apoptose, torna-se imortal.Todos os tecidos tem essa enzima, mas tem um=ns que tem mais. Ex.: celula de cancer e celulas que se dividem muito, tem alta atividade dessa enzima, enquanto o neurônio não.
-é uma ribonucleoproteína= é de RNA e proteína.
-tem atividade de transcriptase reversa= através de um molde de RNA ela sintetiza um pedaço de DNA.
-quem substitui o primer por DNA é a propria polimerase.
*SO VOLTANDO, ESQUECI DE FALAR: por que o primer nao pode ser de DNA, e tem que ser de RNA?
Polimerase tem atividade revisora, e por isso so consegue trabalhar com fita dupla. Se não tivesse primer de RNA, antes de adicionar o primeiro nucleotideo ela ia querer voltar pra trás, so que nao ia ter nnucleotidoe pra trás, então ela não consegue. Com o primer de RNA ela consegue conferir. Ela alonga a fita de cima, a fita molde de 5' pra 3'. (TEM UM VIDEO NO YOUTUBE EXPLICANDO BEM).E tem atividade transcriptase reversa. Com isso consegue completar a fita.
PROVA: funçao de enzimas, ou dar enzimas envolvidas na replicação (da lider ou retardataria), função do telômero, da telomerase.
TRANSCRIÇÃO
Quando a gente faz síntese de proteína temos que passar o DNA pra RNA, e pra passar o DNA pra RNA o processo chama transcrição. Diferente da replicação, a transcrição acontece somente em uma das fitas. A transcrição vai fazer o uso de uma enzima, que é a RNApolimerase. Essa RNApolimerase só consegue começar a transcrição na extremidade 3'. A transcrição só vai acontecer em uma das fitas. Aqui eu vou transcrever as duas fitas, a de verde é a fita 1 e a de vermelho a fita 2. A RNApolimerase só consegue se ligar na 3'. Se ela falar assim: transcreve para mim a fita 1, eu vou procurar a extremidade 3' e vou começar a transcriçao da extremidade 3'. <------------
1) 5' ATC AAG TCG OH-3' 
 -----------> 
2) 3'-OH TAG TTC AGC 5'
Assim temos o RNAm Transcrito :
1) 5' CGA CUU GAU 3'
Transcrevendo a fita 2, procure a extremidade 3', lembrando que o RNAm Transcrito é 5' -> 3' 
2) 5' AUC AAG UCG 3'
O transcrito de um não tem nada a ver com o transcrito do outro!!!TRANSCRIÇÃO 3'->5' ; TRANSCRITO 5'-> 3'
SEMPRE COMEÇAR A TRANSCRIÇÃO DA PORÇÃO 3'!!!
A transcrição vai ser feita por uma enzima, a RNApolimerase. No meu DNA eu vou ter uma região chamada TATA BOX (um monte de TIMINA e ADENINA em sequência). Vai ter uma proteína que é o FATOR DE TRANSCRIÇÃO que vai ligar na região do tata box. A RNApolimerase vai reconhecer essa proteína (fator de transcrição) e aí vai começar a transcrição logo na frente. Esse local que começa a transcrição é chamado de REGIÃO PROMOTORA. E a partir daí corre a transcrição normal.
Quando eu transcrevo RNA, eu transcrevo em RNAt, RNAm, RNAr...Sempre que eu transcrever na prova, vai ser RNA mensageiro!!! Vai ser esse RNAm que eu vou ler no código genético. Na prova vai ter o código genético. Na prova, ela vai dar a fita e vai falar: transcreve a fita 1 e me fala qual é a proteína. 
 
1) 5' CGA CUU GAU 3'
 Arg - Leu - Asp proteína sintetizada
Não coloca Arginina, pra não ter erro, coloca Arg.
Prestar atenção no comando, na mesma questão ela pode pedir uma mutação. Vamos supor que troca uma base ou uma proteína, e ela pede a proteína nova, ou então ela pede o aminoácido que sofreu a mutação. 
MODIFICAÇÕES PÓS TRANSCRICIONAIS
Quando eu acabo de transcrever o meu RNA ele não tá pronto, ele é um pré-RNAmensageiro, porque? A replicação e a transcrição acontece no núcleo, e a tradução acontece no citoplasma. Pra uma proteína entrar no núcleo eu preciso de um transporte, o núcleo é mais protegido do que o citoplasma. Eu tenho DNA e RNA no meu núcleo, pra que que eu vou ter DNAase e RNAase no núcleo, pra degradar? não vou , mas no citoplasma tem. Então tenho que proteger meu RNAm pra dar tempo do ribossomo chegar nele e traduzir ele em proteína antes que ele seja degradado. Por isso acontece uma série de reações que vão me garantir que ele consegue ser traduzido. São 3 alterações: capeamento, calda polyA e splicing.
1) Capeamento, formação do capacete 5' ou cap 5'
Essa modificação acontece na porção 5' do meu pré-RNAm. O meu pré-RNAm vai ser constituido assim:
Quando o pré RNAm acabar de ser transcrito ele vai ser assim, grande, com éxons e íntrons, e sem nada na extremidade 5' e 3'. Pra ele ser maturado ele vai sofrer as modificações.
CAP5': Na porção 5' vai ser adicionado um nucleotídeo extra, e na base desse nt extra vai ter ser adicionado um grupamento metil. E vai ser adicionado um grupo metil no açúcar de um ou mais nucleotídeos que já estão na fita.
3 Funções do Cap5': 
O ribossomo vai reconhecer a proteína que está ligada no cap5' e ai vai ligar no RNAm. Sem o cap5' o ribossomo nao vai conseguir se ligar e reconhecer o RNAm, não ia ter a síntese de proteína!!
Ele vai aumentar a estabilidadedo RNAm no citoplasma.
Influenciar o splicing. 
Consequência de não ter o cap5':
Não vai ter síntese de proteína, não vai ter um splicing adequado e o RNAm vai ficar mais instável.
Teve um ano que ela perguntou a função, no outro ano ela perguntou a consequência.
2) Formação da cauda PolyA ou poliadenilação
São adicionados cerca de 250 adeninas na porção 3'.
Questão: No DNA tem uma sequência correspondente a essas adeninas, como se estivesse 250 Timinas, é mentira!!!! essas adeninas foram adicionadas após a transcrição.
A função da calda polyA é aumentar a estabilidade e a molécula vai ficar mais tempo disponivel pra ser traduzida.
A consequência de não ter a calda polyA: vai ficar mais instável e vai ter menos tempo disponível pra ser traduzida em proteína.
3) Splicing ou processamento
Remoção dos íntrons.
Questão:
5' AAA UUU GGG CCC AUG GCG 3'
 éxons íntrons éxons 
Ela vai te dar o RNAm e vai falar transcreva, vc vai transcrever os éxons e os íntrons.
Na hora da tradução, vc traduz só os éxons, porque o RNAm já sofreu a remoção dos íntrons. 
Tradução
Saber as 5 fases da tradução, geralmente ela pede pra descrever 1 delas.
1) Ativação do Aminoácido
Ativação do aminoacil-RNAt, é o RNAtransportador, e eu vou ativar ele. Como? Eu vou ter o RNAt e na pontinha 3 pares de bases nitrogenadas. Se o meu RNAm vai ter os códons, esses 3 pares de bases vai ser o anticódon. Todo códon que eu ler no RNAm, no código genetico vai corresponder a um aminoacido, exceto os códons de parada. 
Ex: AUG é a metionina, pro meu RNAt parear com o AUG, ele tem que trazer o UAC. 
A ativação desse aminoacil-RNAt, como é? Ele é sintetizado e ele está vazio. Quando ele é ativado pela Aminoacil-RNAt sintetase, que é a enzima, vai acontecer a ligaçao dele com o aminoácido dele correspondente, a metionina. Ele tem o anticodon UAC e ele é programado para carregar a metionina. A enzima liga a metionina ao RNAtransportador. 
2) Iniciação
Vai ter uma proteína que vai reconhecer o cap5' e vai se ligar aí, a subunidade menor do ribossomo vai vim e vai reconhecer essa proteína ligada ao cap5', e nesse momento ele vai se ligar na fita. A subunidade menor do ribossomo e o RNAt com anticodon da metionina vai se ligar na fita e vai começar a procurar o codon da metionina(AUG). Achou o AUG, a subunidade maior do ribossomo vai vim nesse momento e o Ribossomo vai se tornar funcional, agora ele vai começar a síntese de proteína. 
O ribossomo tem 3 sítios ( E, P , A )
O RNAt que vai carregar a metionina vai ligar no sítio P, "P de primeiro". 
Ele vai ligar no sítio P e nesse momento vai ter a formação do COMPLEXO DE INICIAÇÃO. 
3) Alongamento
-> Crescimento da proteína
O ribossomo vai se deslocar na fita, começa na extremidade 5' para a 3'. ATÉ AGORA TUDO QUE EU COMECEI FOI NA 3'
O ribossomo vai andar e encontrar a próxima trinca, que tem um RNAt correspondente a ela, com o anticodon correspondente a ela, com um aminoácido correspondente a ela. 
Quando o Ribossomo andar na fita, esse novo RNAt vai tentar entrar no sítio P mas ele está ocupado, ai ele entra no sítio A, com o aminoácido correspondente a ele, um GTP e um fator de alongamento.
O GTP vai ser quebrado , liberar energia e um fator de alongamento.
Vai acontecer a formação de uma ligaçao peptidica entre a metionina e o segundo aminoácido. Com isso a metionina sai do RNAt dela e se liga no RNAt do segundo aminoacido. 
O ribossomo: o sítio E está vazio, o sítio P agora está com um RNAt vazio, já que a met saiu dali e o sítio A eu vou ter um RNAt, que alem do aa dele está carregando também a metionina.
Aí o ribossomo vai andar de novo na fita pra ler a próxima trinca.
O RNAt que esta vazio vai vim pro sítio E (E de exit - saindo), o RNAt que estava no sitio A vai vim pro sítio P, e o sítio A vai ficar vazio pra ler a proxima trinca. e assim sucetivamente....
4) Finalização
Sítio E está com o RNAt vazio, o sítio P vai tá com o RNAt com muitos aminoacidos pois a proteina ja esta pronta, o sitio A vai ter um RNAt com um anticodon que corresponde ao codon de parada(STOP CODON). Isso significa que não tem mais sintese de proteina. a subunidade do ribossomo se dissocia e nao tem mais sintese de proteina. 
5) Modificações Pós Traducionais
A proteina vai sofrer alguma modificaçao de acordo com a funçao dela na celula, ela pode sofrer : acetilaçao, glicosilaçao, oxidaçao, ubiquitaçao, adp-ribolisaçao. (Geralmente ela pede pra citar 1 modificaçao)
Código Genético
A sequência de base no DNA é correspondente a um aminoácido. O código é degenerado, várias trincas podem codificar o mesmo aminoácido.
Se ela falar "reescreva a proteína toda", eu tenho que reescrever e só modificar o aminoácido.
A mutação errônea ou missense ocorre quando a troca de uma base leva a uma alteração final da proteína. Por exemplo, TAC é transcrito em GUA que codifica valina, se trocar a citosina por uma guanina: TAG é transcrito em CUA que codifica a leucina, mudando a proteína a ser traduzida.
Toda vez que eu fizer uma mutação, a segunda mutação eu vou voltar na fita original. Não vou fazer uma mutação em cima da primeira mutação. Se a timina da quarta trinca (CAT) fosse trocada por uma guanina, na hora de transcrever CAG vai virar GUC que codifica valina. A CAT também codificava valina, então essa mutação é chamada de mutação pontual neutra ou silenciosa, ou seja, a troca de uma base não resulta na troca da proteína.
Quando o produto da tradução for um STOP códon, a proteína para de ser produzida, essa é a mutação pontual sem sentido ou nonsense. Não precisa escrever o stop códon, só até onde foi feita a tradução.
Quando eu adiciono ou retiro um par de base, tipo, se eu adicionar uma guanina na penultima trinca: ATG GGT CAA TAC CCG → ATG GGT CAA TACG CCG, a primeira trinca iria traduzir normal, mas a segunda ja mudaria e o T ficaria pra proxima como o C também, sobrando uma base no final. Ocorreu uma mutação Frameshift ou deslocamento do quadro de leitura, que é quando eu acrescento ou retiro uma base e com isso mudo todos os aminoácidos que serão sintetizados.
PCR/EXTRAÇÃO 
Ela vai falar assim, o sangue de 3 pacientes serão analisados para ver se eles estão com doença de Chagas. Ela pode te pedir o enunciado(ai ela dá o diagnóstico) ou pedir o resultado(ela dá o enunciado). O DNA do t.cruzi amplifica em 400pb. O sangue de 3 pacientes foram mandados para o laboratório, sendo que 2 pacientes estão com a doença. Ela vai falar: monta o pcr pra mim. Ai a primeira coisa é desenhar o gel ou ele ja vem desenhado na prova, agr a conta de quantas canaletas vou precisar: 1 pro padrão de peso, 1 pro controle positivo, 1 pro controle negativo (esses 3 são obrigatórios sempre), 1 pra cada paciente = 6 canaletas. Padrão de peso é o dna que eu sei o tamanho dele, e sempre lembrar que o mais leve corre mais. Tem que ter legenda de tudo. Controle positivo na canaleta 2 é o dna que eu tenho certeza que é o microrganismo que eu procuro, eu tenho certeza que o do t.cruzi é 400pb, então, meu controle positivo só pode amplificar a banda de 400 pb, se amplificar mais de uma banda quer dizer que o exame está inválido. Legenda: DNA do microrganismo + solução de PCR. Canaleta 3,4 e 5 são as amostras de cada paciente como solução de PCR. NA canaleta 6 eu vou colocar o controle negativo que é só a solução de PCR, não tem nenhum DNA, se tiver algum DNA amplificado o exame foi contaminado e tem que repetir. Ela deu no enunciado que 2 estão contaminados, então escolho os pacientes e amplifico a banda relativa aos 400 pb. Esse é o jeito mais simples de cobrar. Ela pode fazer o contrário, te dar o quadro completo e a legenda. Você vai falar que analisou as amostras de sangue para o vírus da hapatite e que esse virus amplifica 500pb, e que testou o sangue de 3 pacientes pra ver se estavam contaminados. Explica o que tem em cada canaleta, e depois o resultado de cada canaleta: na do controle positivo não amplificou nenhuma banda sem ser a do vírus, por exemplo. Somente o pacienteX amplificou a banda, sendo diagnosticado com a doença.
Tem chance dela perguntar sobre o funcionamento do gel, das temperaturas ¿ Teve um semestre que ela pediu sobre as fases do termociclador, vai ser bem específica usando essa palavra. 
Outra variação de questão de PCR será sobre Duchenne, que é ao contrário, quando tem a banda é saudável, quando não amplifica a banda é porque tem a doença, é só prestar bem atenção no enunciando.
Questão polêmica: ela deu a sequencia da proteína e falou que ela tinha 8 aminoácidos, e perguntou quantos pares de base tinha essa proteína, e depois mandou fazer o pcr. 1 aminoácido é uma trinca, uma trinca são 3 pb, entao 8 aminoácios tem 24 pb. Você ia fazer o controle positivo e colocar o padrão de peso. Você coloca em cada legenda solução de PCR, porque todas têm. E não precisa colocar os reagentes que estão na solução de PCR.
Outra questão possível é você ter que desenhar os pares e ter que flanquear o primer na região desejada. O primer conta na contagem de pb. Você vai pegar os 20 primeiros e os 20 ultimos pb para nao ter erro. 
A eletroforese é um meio de quantificar o DNA. Teve semestre que ela perguntou como faz o gel de eletroforese. Você pega o ágar, pesa, dissolve no tampão de corrida, coloca no microondas, depois vira no molde com pente dentro, espera esfriar, tira o pente e fica o poço. Coloca o gel na cuba, cobre com tampão de corrida(passagem de corrente elétrica), coloca o DNA no poço com tampão de amostra(colore e pesa o DNA pra entrar no poço), fecha a cuba, liga corrente eletrica, o pocinho fica perto do polo negativo para o dna andar em direção ao positivo, desliga a corrente, cora com brometo de etídio e leva ao transiluminador. No transiluminador algumas bandas são mais brilhantes devido a quantidade de DNA. O brometo de etídio é um agente intercalante, é importante saber.
Na extração tem que saber a função dos reagentes, e outra coisa, a extração tem 3 tampões: de corrida que permite a passagem de corrente elétrica e dissolve o ágar, o tampão de amostra que pesa e colore o DNA, e o tampão que mantem o pH8.
Na extração são 3 fases: Lise: adiciono tampão de lise que permite a quebra das membranas, só que antes tem que ter os cuidados pré lise, se for DNA: devo usar material livre de dnase, material novo e luva. RNA: material livre de rnase, material novo, livre de dnase, gelo(para inativar rnase) e RNAsin (detergente). Coloco no tubo o tampão de lise, o material, o tampão que mantem ph, EDTA(agente quelante que rouba todos os íons 2+), centrifuga, e tenho 2 fases: sobrenadante e pellet. DNA fica no sobrenadante, e o resto no pellet, descarto o pellet e coloco o sobrenadante em outro tubo, vou para a próxima fase que é a purificação, adiciono fenol, clorofórmio e alcool isoamílico, desnaturam a proteína, dissolvem, e estabilizam a interfase onde ficam proteínas desnaturadas, repito o processo ate a interfase sumir. A terceira etapa é precipitação, acrescento alcool 100% e Na+, álcool desidrata o dna/rna, e o sal estabiliza a carga negativa do fosfato. Faço lavagem do pellet pra tirar o sal com alcool 70% que tem 30¢ de agua para hidratar o material. Se eu quero trabalhar com o DNA, eu tenho que degradar o RNA adicionando RNase. Se eu quero trabalhar com o RNA, tenho que adicionar DNase para degradar o DNA. Ai faço a quantificação por eletroforese ou espectofotometria.
O sarcozil e a lisozima são tampões de lise especiais, a lisozima é mais forte e degrada parede de bacteria, o sarcozil é usado em planta, pois degrada parede celular. 
O gel é 110% de chance de cair.