172816-Aula_2_HPLC

Prévia do material em texto

Denise Coutinho Endringer 
HPLC 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif 
FASE MÓVEL (ELUENTE) 
1. Propriedades 
- Alto grau de pureza (ou ser de fácil purificação) 
- Inerte 
- Ter polaridade e viscosidade adequadas 
- Não degradar a fase estacionária 
- SER COMPATÍVEL COM O DETECTOR 
- Não ser tóxico 
 
Solvente água 
 Mono ou bidestilada e deionizada  
INADEQUADAS 
Partículas em suspensão, inclusive coloides, Sais 
inorgânicos 
Substâncias orgânicas dissolvidas, Pirogênios, Gases 
dissolvidos 
 Água grau HPLC produzida no dia da utilização 
Sais inorgânicos em solução: C+ ou A-  transmitem 
uma corrente elétrica quando uma voltagem é 
aplicada entre dois eletrodos dentro da água. 
Quanto mais íons estão presentes na água, maior é 
a corrente e maior a condutividade (e portanto menor 
a resistividade). 
 
 Condutividade é expressa em microSiemens por 
centímetro (μS/cm) e é usada como uma das 
medidas da qualidade da água. Resistividade é a 
reciproca da condutividade e é expressa em 
megaohm-cm (MΩ-cm). Esta forma é mais 
conveniente para se medir a qualidade da água de 
alta pureza. 
 Água grau HPLC= 18, 2 MΩ-cm 
FASE MÓVEL - cuidados 
2. Filtro do reservatório 
-10-40 µm 
-Evitar que partículas suspensas na Fase Móvel 
obstruam os capilares ou contaminem a bomba 
-LIMPEZA PERIÓDICA 
 
3. Filtração da fase móvel 
 
FASE MÓVEL - cuidados 
4. Desgaseificação da fase móvel 
a) o bom funcionamento do sistema; 
b) reprodutibilidade da vazão; 
c) Estabilidade na linha de base. 
 
Métodos 
I. Ultrassom: lento, necessita de agitação, pouco 
eficiente 
II. Ultrassom + vácuo: rápido, eficiente, 12h-12h 
III. Purga com hélio; eficiente, alto custo operacional 
IV. Desgaiseficador “on-line”: eficiente, alto custo 
inicial, melhor opção a longo prazo 
 
Série Eluotrópica 
 
http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0022113902002063-gr2.jpg 
Força Cromatográfica 
 Ajustada com o gradiente ou com solventes 
0 (SiO2)= 0,77 0 (Al2O3) 
 
 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif 
Bomba de alta pressão 
 Produzir um fluxo constante e reprodutível 
 Requisitos 
- Ser de material inerte 
- Ser de fácil limpeza 
- Gerar pressão de 0,01 a 35 Mpa 
- Permitir variação de solventes (duas bombas ou 
sistema de bombas) 
Eluição 
 Isocrática 
 Gradiente 
 
 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12
90% MeCN 
80% MeCN 
70% MeCN 
60% MeCN 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif 
Injetores 
 Manual 
http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/overview_images/ManualInjectorKit_overview.jpg 
 
Injetor automático 
 
 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif 
http://images.aprolab.com.br/images/_product/610/610276/8ba728549845a18452e05394f13459ce.jpg 
Guardar a coluna sempre com solvente ORGÂNICO 
PARTÍCULAS DE PREENCHIMENTO 
 
http://www.teknolab.no/pdf/Restek_p290-329_HPLCcolumns.pdf 
Botoli, C. UNICAMP 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif 
Detectores 
 ter alta sensibilidade: detectar pequenas 
quantidades de amostra; 
 ser estável: insensível a variações de 
temperatura e de fluxo, no caso de eluições com 
gradiente; 
 linearidade: o sinal deve manter uma relação 
linear com a concentração da amostra; 
 uma leitura contínua; 
 resposta universal: capaz de trabalhar com 
todos os tipos de amostra 
Principais tipos 
 
Botoli, C. UNICAMP 
Detector UV-Vis 
 Com base em transições electrônicas da molécula. 
 Tipo mais comum de detector para LC 
 Comprimento de onda fixo, Hg lâmpada 254 nm (π 
=> * π) 
 Comprimento de onda ajustável, selecionável para 
comprimentos de onda específicos, 
monocromadores ou filtros. Ainda limitados a 
comprimentos de onda individuais. 
 -Limite de detecção = 1 pg 
 Limitações do solvente com UV-vis abs. 
 Espectrofotômetro: mais versátil 
 UV cut off for solvents used: 
n-hetano, 220 nm; 
acetonitrila, 200 nm; 
água, 190 nm; 
etanol, 210 nm; 
metanol, 220 nm). 
Photo diode array detector 
Botoli, C. UNICAMP 
Detectores de índice de refração : 
 Detecção quase universal, mas baixo limite de 
detecção 
 Limite de detecção (LOD)= 10 ng de soluto 
 Sofre influencia do tipo de eluição isocrática X 
gradiente 
Detectores de fluorescência: 
 com base na emissão de moléculas estado excitado. 
 LOD 10 fg; Hg ou Xe lâmpada; Fluorímetro e 
espectrofluorômetro; Espécies fluorescentes ou 
derivados fluorescentes 
Botoli, C. UNICAMP 
Registradores e integradores: 
 Registradores  gravar as respostas obtidas a partir 
de detectores após a amplificação. 
 Gravam a linha de base e todos os picos obtidos, 
em relação ao tempo. O tempo de retenção de 
todos os picos pode ser encontrado a partir de tais 
gravações, mas a área de picos individuais não 
pode ser conhecida. 
 Integradores são a versão melhorada de 
registradores com algumas capacidades de 
processamento de dados. 
 Eles podem gravar os picos individuais com tempo 
de retenção de altura e largura de picos, área de 
pico, o percentual de área, 
http://hplc.galeon.com/hplc_archivos/IMAGENES/esquemaC.gif