RNA transcrição e processamento

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RNA : 
Transcrição e Processamento
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Conceitos Gerais
DNA
mRNA
proteínas
tRNA
acoplador
transportador
rRNA
estrutural
ribossomos
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Transcrição 
Decisão de iniciar
	- controle da situação
Temporal / Momento
	- estado fisiológico
Específico / Seletivo
	- privilégio de poucos
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Transcrição 
Complementaridade e antiparalelismo 
( T = U)
Síntese 5'  3' 
RNA Polimerase (RNAP)
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Transcrição 
“bolha de transcrição”
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Transcrição 
RNAPs:
	reconhecem e ligam-se
	desnaturam DNA
	mantém estável a dupla fita aberta
	mantém estável DNA:RNA
	 terminam síntese
	 restauram DNA
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Procariotos e Eucariotos
Procariotos: transcrição e tradução são simultâneas, logo o RNA não sofre processamento.
Eucariotos: transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. O transcrito inicial (pré-mRNA) sofre processamento e gera o mRNA.
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Transcrição 
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PROCARIONTES
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Transcrição - Eucariotos 
RNAPol I
rRNAs (exceto rRNA 5S)
Localização: nucléolo
RNAPol II
pré - mRNA nucleares	Localização: núcleo
RNAPol III
tRNA, 5S rRNA e snRNA Localização: núcleo
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Transcrição 
RNAPols : eucariotos
	proteínas acessórias = fatores de transcrição
	sítio de início da transcrição
	seqüências regulatórias (promotor e enhancer)
Cada RNAPol utiliza promotores e fatores transcricionais diferentes
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Transcrição 
Iniciação – ligação do complexo RNAPol II ao DNA
Alongamento – adição de nt ao mRNA crescente 
Terminação – liberação de mRNA e RNAP II
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Initiation in prokaryotes and eukaryotes
 initiation can occur at internal AUG codons in prokaryotic mRNA
 initiation in eukaryotes occurs only at the first AUG codon
 lac operon in E. coli is transcribed as a polycistronic mRNA
 with multiple AUG codons
 eukaryotic mRNA
lac I
P
O
lac Z
lac Y
lac A
AUG
AUG
AUG
AUG
SD
AUG
SD
AUG
initiation codon with
 Shine-Dalgarno site
initiation codon with
 Shine-Dalgarno site
internal Met codon
does not have
Shine-Dalgarno site
5’
5’ cap
AUG
initiation can only occur at
first AUG codon downstream of the 5’ cap
AUG
internal (downstream) Met codon
 cannot serve as an initiation site
AUG
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Transcrição 
Resumindo...
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Transcription and promoter elements for RNA polymerase II
exon
exon
promoter
P
TE
transcription
 element
Promoter (DNA sequence upstream of a gene)
 determines start site (+1) for transcription initiation
 located immediately upstream of the start site
 allows basal (low level) transcription
Transcription element (DNA sequence that regulates the gene)
 determines frequency or efficiency of transcription
 located upstream, downstream, or within genes
 can be very close to or thousands of base pairs from a gene
 includes
	enhancers (increase transcription rate)
	silencers (decrease transcription rate)
	response elements (target sequences for signaling molecules)
 genes can have numerous transcription elements
+1
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Sequence elements within a typical eukaryotic gene1
GC
TATA
CAAT
GC
-25
-50
-80
-95
-130
1 based on the thymidine kinase gene
 octamer
transcription
 element
promoter
TATA box (TATAAAA)
 located approximately 25-30 bp upstream of the +1 start site
 determines the exact start site (not in all promoters)
 binds the TATA binding protein (TBP) which is a subunit of TFIID
GC box (CCGCCC)
 binds Sp1 (Specificity factor 1)
CAAT box (GGCCAATCT)
 binds CTF (CAAT box transcription factor)
Octamer (ATTTGCAT)
 binds OTF (Octamer transcription factor)
+1
ATTTGCAT
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Cascata de fatores
+ RNAP II
Complexo de iniciação
Promotor
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Transcrição 
Enhancers 
em ação
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+1
TBP
TFIID
B
E
F
H
J
RNA pol II
initiation
 RNA pol II is phosphorylated by TFIIH on the carboxy terminal
 domain (CTD), releasing it from the preinitiation complex and
 allowing it to initiate RNA synthesis and move down the gene
Initiation of transcription and promoter clearance
P
P
P
CTD
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Transcrição 
Alongamento
	CIT desfeito
	Síntese do mRNA propriamente dita
	Duplex híbrido DNA:RNA
	Correção de erros
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Transcrição 
rRNA - RNAP I
	3 complexos protéicos acessórios
	promotores: 
		-2 domínios semelhantes RNAPII
tRNA - RNAP III
	3 complexos protéicos acessórios
	promotores: 
		- 1 domínio semelhante RNAPII
		- 2 regiões controladoras internas (ICRs)
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Messenger RNA (mRNA)
 m7Gppp
Cap
5’
5’ untranslated region
AUG
initiation
 codon
translated (coding) region
(AAAA)n
poly(A) tail
3’ untranslated region
UGA
termination
 codon
3’
AAUAAA
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Transcrição 
Terminação
	regiões consenso no DNA molde – ricas em T
	clivagem (corte)
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Terminação da Transcrição em Procariotos - hairpin loop 
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Terminação de Transcrição dependente de Rho - Procariotos
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A possible scheme for termination of transcription by RNA polymerase I 
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 RNA
 Processamento
“a arte de proteger e tornar útil”
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Conceitos Gerais
mRNA
Proteína
pré-mRNA
mRNA
DNA
tradução
transcrição
processamento
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Processamento
Capping - cap 5'
Polyadenylation - cauda poly A
Splicing – excisão de introns
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Processamento
Capping – cap 5'
O que é:
adição de grupo metil
Local:
primeiro nucleotídeo 5'
Funções:
proteção
facilitar transporte e splicing
Quando:
assim que possível
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Processamento
O Cap
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Processamento
Capping
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Adição do CAP 5’
Um dos 3 fosfatos é removido
É adicionada uma guanina
A guanina é metilada (CH3)
O 2o e 3o nt são metilados
Função: proteínas reconhecem e se ligam ao CAP e o ribossomo se liga a elas
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Adição da cauda Poli - A
Função: confere estabilidade ao mRNA no citoplasma
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Ligação entre poliadenilação e terminação de transcrição pela RNA polimerase II
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Poliadenilação de mRNA eucariótico
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Processamento
Polyadenylation
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Processamento
Estrutura protegida
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Processamento
Tornar útil:
- Exons
	porção codificadora 
	presente no mRNA
- Introns
	porção “não codificadora”
	não presente no mRNA
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Processamento
Splicing
O que é:
retirada de introns, fusão de exons
Local:
regra GU-AG, sinalizado por branch point A
Função:
tornar útil
Quando:
logo após cap e poli A
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Processamento
DNA molde
Pré-mRNA
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Processamento
Splicing mediado por spliceossomo:
	spliceossomo = vários snRNPs (U1, U2...) + ptns
		- ajuda a clivar no sítio de splicing
		- remove intron
		- impede afastamento dos exons
		- une os exons
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Splicing 
por spliceossomo
Processamento
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Processamento
Auto-splicing
	sem atuação de spliceossomos
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Auto-splicing
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Íntrons auto-removíveis
(tipo I)
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Íntrons auto-removíveis
(tipo II)
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Processamento
Bases em comum
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Structure of U1-snRNP
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RNA transportador: estrutura
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RNA transportador: processamento
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Processing of an Escherichia coli pre-tRNA
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The cloverleaf structure of a tRNA
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Splicing of the Saccharomyces cerevisiae pre-tRNATyr
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METILAÇÃO
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DESAMINAÇÃO
A*= Inosina
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SUBSTITUIÇÃO POR SULFÚRIO:
4-Thiouridine
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ISOMERIZAÇÃO DE BASE
URIDINA= PSEUDOURIDINA
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SATURAÇÃO DE DUPLA-LIGAÇÃO:
uridine= dihydrouridine
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RNA ribossômico
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	Initiation of protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes is fundamentally different. Many prokaryotic mRNAs are polycistronic, meaning that a number of different proteins can be produced from a single mRNA. In contrast, eukaryotic mRNAs are monocistronic. Polycistronic mRNAs have multiple AUG initiation codons – one for each protein being
translated. How does the bacterial cell distinguish between initiation codons and internal methionine codons? The answer lies in the fact that mRNAs have a Shine-Dalgarno sequence just upstream of their initiation codons. This sequence interacts with the 16S rRNA and thus helps bring the ribosome to these internal initiation codons. The internal methionine codons (the ones that are not involved in initiation) do not have upstream Shine-Dalgarno sequences. Eukaryotic protein synthesis is initiated by a different mechanism - one that involves the binding of the ribosome to the 5' cap followed by scanning down the mRNA until the first AUG is found. This identifies it as the initiation codon - all other AUG codons are then, by definition, internal.
	There are exceptions to the scanning mechanism for some eukaryotic mRNAs. Some mRNAs can recruit ribosomes directly to initiating AUG codons through 5' UTR elements termed internal ribosome entry sites (IRESs). Mutation of the IRES in the connexin-32 gene is a cause of Charcot-Marie-Tooth disease. Mutation of the IRES of the c-myc gene causes increased translation of this oncogene, leading to multiple myeloma (Mendell and Dietz, Cell 107:411; 2001).
	The figure shows the lac operon in E. coli, which is transcribed into a polycistronic mRNA that encodes the three structural proteins of the operon. Each one of the proteins is initiated at an AUG codon adjacent to a Shine-Dalgarno sequence. The lower part of the figure shows a eukaryotic mRNA, which has one and only one AUG initiation codon - the first AUG downstream of the 5' cap.
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Eukaryotic mRNAs have a 5' cap followed by a 5' untranslated region. Unlike prokaryotic mRNAs, they do not have a Shine-Dalgarno sequence. Eukaryotic mRNAs also have a 3' poly(A) tail.