Princípios de Microscopia de Luz

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Princípios de Microscopia de Luz
Prof. Eduardo C. Alves
Fundamentos da Microscopia de Luz
O microscópio de luz consiste num equipamento responsável pela ampliação de imagens não visualizáveis pelo olho humano;
Os equipamentos modernos contam com ao menos dois sistemas de lentes: objetivas e oculares;
Estas produzem uma imagem ampliada, invertida e virtual do objeto;
Além do conjunto de lentes, os microscópios também contam com um sistema de iluminação: as lentes coletoras e o condensador
Exemplo do processo de formação de imagem de uma preparação em um microscópio 
As Objetivas
É considerado o sistema de lentes mais importante, uma vez que produz uma imagem real do objeto e determina a resolução da imagem;
O tubo de lentes objetivas, na verdade, é um sistema de lentes alinhadas;
O número de lentes pode variar segundo o tipo de lente e a resolução do microscópio;
Além do simples aumento da imagem, as lentes devem ser capazes de corrigir aberrações ópticas inerentes à construção de lentes.
Tipos de Aberrações Ópticas Comuns
Aberrações cromáticas
São produzidas pelo desvio angular não igual de diferentes comprimentos de onda, quando atravessam uma mesma sessão da lente. 
Aberrações esféricas
Observadas quando raios luminosos de um mesmo comprimento de onda incidem em diferentes pontos da lente. São capazes de alterar o foco da imagem.
Aberração Cromática
Aberrações Esféricas
Curvatura de campo
Inerente ao formato das lentes, faz com que a produção de imagem não aconteça num plano achatado, mas num plano curvo.
Tipos de Lentes
Acromáticas
Semiapocromáticas
Apocromáticas
Lentes acromáticas
Tipo mais simples e barato;
São capazes de corrigir aberrações cromáticas de dois comprimentos de onda (vermelho e azul);
Também são capazes de corrigir aberrações esféricas no comprimento de onda da luz verde;
Não apresentam correção para a curvatura de campo;
Os poucos recursos de correção deste tipo de lente, tornam estas pouco eficientes para observação e fotomicrografia de material colorido.
Lentes Semiapocromáticas
Também chamadas de lentes Fluoritas;
São feitas com formulações especiais de vidros;
Apresentam correção de aberrações esféricas de duas cores;
Oferecem ainda melhor contraste e transparência;
 São muito utilizadas em Fotomicrografia pela relação custo X benefício
Lentes Apocromáticas
O mais alto nível de correção de aberrações;
Corrigem aberrações cromáticas de três ou quatro cores;
Corrigem aberrações esféricas de quatro cores;
São lentes de alto desempenho e também de alto custo;
Ideais para trabalhos de Fotomicrografia colorida com luz branca.
As Lentes Plan
Formam um grupo especial de lentes com correção de curvatura de campo;
A correção é obtida com a colocação de conjuntos extras de lentes no caminho óptico;
Desta forma existem lentes: Plan Acromáticas, Plan Fluorita e Plan Apocromática;
Na observação direta do material, a curvatura de campo não chega a ser um problema, pois basta ajustar o foco, entretanto nos trabalhos de Fotomicrografia ou Filmagem, este é um problema sério.
(a) Acromática (b) Fluorita (c) Apocromática
Resolução X Ampliação
Normalmente, associa-se a qualidade do microscópio à sua capacidade de ampliação da imagem de um dado objeto;
No entanto, a qualidade do microscópio esta, antes de tudo, associada ao seu poder de resolução, ou seja, a sua capacidade de fornecer imagens nítidas, com detalhes estruturais;
É possível definir o poder de resolução de um microscópio, para tanto devemos, estabelecer seu limite de resolução;
Limite de resolução é a distância mínima entre dois pontos que ainda podem ser observados separadamente
LR = K. λ
 
 NA
Sendo: 
K = uma constante experimental estimada em 0,61 μm; 
λ = comprimento de onda utilizada (luz ou feixe de elétrons) 
NA = abertura numérica da lente objetiva.
n= índice de refração do meio entre a lente frontal da objetiva e a lamínula (Ar= 1,00; óleo de imersão= 1,51)
μ= metade da abertura angular, semi-ângulo com vértice no cone formado pelos raios que,
saindo da preparação, atingem a lente frontal da objetiva
Abertura Numérica
Responda
Você participa de uma equipe que trabalha no desenvolvimento de equipamentos de microscopia:
Qual fonte luminosa escolheria: de maior ou menor comprimento de onda?
Escolheria lentes com maior ou menor NA?
Qual o meio ideal para “mergulhar” a objetiva?
Efeito do óleo de imersão na refração dos raios luminosos que atingem uma objetiva de microscopia
Informações nas Objetivas
As objetivas podem ter uma grande quantidade de informações gravadas em seu corpo;
Quatro informações são obrigatórias:
1- Ampliação Linear;
2- Abertura Numérica;
3- Comprimento mecânico do canhão;
4- Espessura recomendada da lamínula
Sistema Óptico ao Infinito
Informações Adicionais
Outras informações podem estar presentes no corpo das objetivas, entre eles:
Correções ópticas;
Distância de trabalho;
Meio de imersão
Código de cores de ampliação
- Propriedades ópticas especiais.
Correções ópticas
Acro ou Achro indicam lentes acromáticas;
Fl, Fluar, Flour, Neofluar ou Fuotar indicam lentes do tipo Fluorita;
Plan, Pl, EF, Plano, Plan Apo ou Acroplan indicam lentes com correção para curvaturas de campo.
Distância de Trabalho (WD)
É a distância entre a lente frontal da objetiva e a superfície da lamínula quando o objeto está em foco;
Quanto maior a ampliação da lente, menor a distância de trabalho.
Meio de Imersão
A informação sobre o meio ideal de observação está gravada na objetiva;
Oil, HI ou OEL significam óleo
Wi significa água;
Esta informação também pode vir na forma de um anel colorido na extremidade da lente. 
Código de cores de Ampliação e Imersão
Código decores
Meiode Imersão
Negro
PPRETO
Óleo
LARANJA
Glicerol
BRANCO
Água
VERMELHO
Especial
 
 
Código decores
Aumento
PRETO
1x, 2.5x
MARROM
2x, 2.5x
VERMELHO
4x, 5x
AMARELO
10x
VERDE
16x, 20x
AZULTURQUESA
25x, 32x
AZULCLARO
40x, 50x
AZULESCURO
60x, 63x
BRANCO
100x, 250x, 200x
Oculares
As lentes oculares funcionam em conjunto com as objetivas para produzir a imagem que será observada;
Sua função básica é ampliar a imagem intermediária produzida pela objetiva e projetá-la a uma distância de 25cm do observador;
Produzem uma imagem ampliada, virtual e direita da imagem intermediária;
Existem dois arranjos básicos para construção das oculares: Negativa (Huygeniana) ou Positiva (Ramsdeniana).
(a) Negativa (b) Compensadora (c) Positiva
Exemplo de gratícula que pode ser inserida nas oculares positivas
As oculares mais simples não possuem qualquer mecanismo de correção para aberrações ópticas;
Uma lente ocular com apenas a inscrição do aumento é provavelmente do tipo negativo e sem correção de aberrações ópticas;
Oculares positivas são úteis na colocação de gratículas de medição;
Algumas oculares possuem um sofisticado sistema de correção de aberrações ópticas residuais e são identificadas como Periplan;
Oculares com as inscrições: UW (Ultra Wide), UWF, SW, SWF, H ou HE (High Eyepoint) indicam a possibilidade de observação com o olho posicionado mais distante;
Oculares com algum tipo de correção de aberrações estão indicadas por K, C, Comp ou Compens
Esquema de uma ocular Periplan
Ampliação total = ampliação da ocular x ampliação da objetiva. 
Limite de resolução (LR) = k x λ/ AN, onde: 
k = 0,61 (constante) 
λ= 0,55 (em μm, é o comprimento de onda que corresponde à radiação na banda do amarelo-verde e para a qual o olho humano apresenta maior sensibilidade).