Clonagem Gênica2016.2

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
Clonagem 
gênica
Lavras – 2016/2
*
Revolução Agricultural 10000 anos atrás - Primeiros agricultores Selecionavam as melhores sementes (de interesse) para plantio. 
Século XXI – Selecionamos genes de interesse – inserção em genomas/ investigação e análise
Domesticação – Seleção visual – Melhores genótipos permaneciam = melhores alelos permaneciam na pop. 
Clonagem Gênica
*
 Transferiram o DNA de um vírus para uma bactéria, produzindo o primeiro organismo com DNA recombinado.
S. Cohen e H. Boyer (1973)
Materias Geneticamente Modificados
*
A clonagem gênica e feita pela introdução de vetores recombinantes únicos em bactérias receptoras, seguida de amplificação dessas moléculas como um resultado da tendência natural desses vetores em se replicar.
Griffths , 2008
Clonagem Gênica
*
Sequenciamento; 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE - técnicas coletivas para obter, amplificar e manipular fragnmentos específicos de DNA.
ENGENHARIA GENÉTICA - aplicação da tecnologia do DNA a problemas específicos biológicos,médicos ou agriculturais.
MANIPULAÇÃO DO DNA 
Genômica e ômicas...
Clonagem Gênica
*
A tecnologia do DNA recombinante tem sido usada para criar plantas geneticamente modificadas
 Milho geneticamente modificado:
produz uma toxina que mata as pestes de insetos 
hoje constitui mais de 30% de todo o milho cultivado nos
 EUA
Clonagem Gênica
*
Métodos para localizar seqüências especificas de DNA;
Técnicas para cortar o DNA em locais precisos;
Procedimentos para amplificar determinadas seqüências;
Métodos para mutar e unir fragmentos de DNA para produzir seqüências desejadas;
Procedimentos para transferir seqüências de DNA para células receptoras.
Técnicas de DNA Recombinante
Clonagem Gênica
*
Reconhecem e fazer cortes bifilamentares em sequências específicas de nucleotídeos nas moléculas de DNA.
- Pontas Adesivas;
Enzimas de Restrição
Envolvida na proteção da bacteria contra infecção de DNA estranho;
Endonucleases;
3,139 ER conhecidas.
Clonagem Gênica
Tesouras moleculares
*
Modo de ação de enzimas de restrição
As enzimas de restrição cortam o DNA em fragmentos de
tamanho manejável, e muitas delas geram pontas adesivas
unifilamentares adequadas para fazer DNA recombinante.
Clonagem Gênica
*
Figura 22: Modo de ação de enzimas de restrição. 
Enzyme Site Recognition 
Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site;
Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC).
Clonagem Gênica
*
Enzyme cuts  5’ versus 3’ overhang 
 Generates 5’ overhang 
Clonagem Gênica
*
EcoRI
Escherichia coli
5’ overhang
PstI
Providencia stuartii
3’ overhang
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
5’ CTGCAG 3’
3’ CACGTC 5’
Common Restriction Enzymes
Clonagem Gênica
*
As enzimas de restrição fazem:
cortes bifilamentares na estrutura açúcar-fosfato do DNA
 pontas coesivas ou adesivas
Clonagem Gênica
*
 O número de sítios de restrição está relacionado ao número de fragmentos produzidos quando o DNA é cortado por uma enzima de restrição.
Clonagem Gênica
*
 Visualização dos fragmentos de DNA
Clonagem Gênica
*
A eletroforese em gel pode ser usada para separar moléculas de DNA com base em seu tamanho e carga elétrica.
Clonagem Gênica
*
DNA genômico Enzima de Restrição  milhões de fragmentos  seqüência continua no gel (arraste) impossível visualização dos fragmentos!!
 Pedaço relativamente curto de DNA  Enzima de restrição  visualização dos fragmentos em bandas distintas em gel de eletroforese
Clonagem Gênica
*
Precast Ready 
Agarose Gel
Bio-Rad’s Electrophoresis Equipment
Clonagem Gênica
*
 Transferência de Southern e hibridização com sondas podem ser usadas para LOCALIZAR ALGUNS FRAGMENTOS ESPECÍFICOS em uma grande quantidade de DNA.
Clonagem Gênica
*
 Localização dos Fragmentos de DNA com a Transferência de Southern (Edwin M. Southern) e Sondas;
 Localizar fragmentos portadores de genes específicos  SONDA
Clonagem Gênica
*
 Muitos métodos de DNA recombinante necessitam de numerosas copias de um fragmento especifico de DNA. 
CLONAGEM  produção de copias idênticas do trecho original de DNA
Inserir o fragmento em uma bactéria e deixar que ela replique o DNA.
Clonagem de Genes
A amplificação aproveita-se de processos genéticos procarióticos, incluindo os de transformação bacteriana, replicação
de plasmideos e crescimento de bacteri6fagos
*
Fonte : Griffths , 2008
*
Vetor de Clonagem  molécula de DNA estável, replicante, a qual um fragmento de DNA exógeno pode ser ligado para introdução em uma célula. 
 Três características de um vetor de clonagem idealizado 
 1 Uma origem de replicação;
 2 Um ou mais marcadores selecionáveis;
 3 Um ou mais sítios de restrição
Clonagem Gênica
*
Plasmídios  moléculas circulares de DNA presentes em bactérias.
Ampicilina  antibiótico que normalmente mata as bactérias
Bactéria + pUC19  resistente 
O Plasmídeo pUC19 é um vetor típico de clonagem. Ele contém um grupo de sítios de restrição, e dois marcadores selecionáveis, um gene de resistência á ampicilina e um gene lacZ.
*
*
Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmídeo com o uso de:
a) Clonagem de Restrição
*
Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmideo com o uso de:
b) Clonagem por Ramificação
*
Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmideo com o uso de:
c) Clonagem usando ligadores
*
Clonagem dentro do Plasmideo
*
DNA Recombinante
*
*
O gene lacZ pode ser usado para triar bactérias contendo plasmídeos recombinantes.
*
*
Transformação  capacidade de as bactérias captarem DNA do ambiente externo.
 PlasPlasmídeo recombinante introduzido em uma bactéria
Clonagem Gênica
*
Bacteriófagos vetores
 Fagos recombinantes são embalados em capas protéicas e adicionados em bactérias 
 Injeção do DNA recombinante para ser replicado
Clonagem Gênica
*
 O fago λ é um efetivo vetor de clonagem
*
Vetor de expressão  garante a transcrição e a tradução do gene exógeno inserido seqüências adicionais
DNA exógeno
*
*
Esquema simplificado da construção de um OGM. 
Organismo Doador
 ( Realiza a Função “A”)
Organismo Receptor 
(Não realiza a função “A”)
Organismo Receptor 
(Passa a realizar a função “A”)
*
O que é transgenia?
É a inserção, no genoma de um organismo receptor, mediante técnicas de Engenharia Genética, de um ou mais genes obtidos de indivíduos diferentes da mesma espécie do indivíduo receptor, ou de espécie diferente.
*
Localização de um gene 
 Como encontrar seqüências de DNA em uma célula a serem clonadas?
 CLONAR primeiro para depois encontrar
*
Localização de um gene 
Shotgun  clonagem de espingarda 
 clonar um número grande de fragmentos de DNA (um ou mais contém o DNA de interesse). 
Biblioteca de DNA  coleção de clones contendo todo os fragmentos de DNA.
*
Uma biblioteca genômica contém todas as sequências de DNA encontradas no genoma de um organismo.
*
Uma biblioteca de cDNA contém apenas as sequências de DNA que são transcritas em mRNA.
Criação de uma biblioteca de cDNA
*
Uma biblioteca de cDNA contém apenas as sequências de DNA que são transcritas em mRNA.
Criação de uma biblioteca de cDNA
*
Criação de uma biblioteca de cDNA
 Primers de oligo(T)
*
Triagem de bibliotecas de DNA 
 As bibliotecas genômicas e de cDNA podem ser triadas com uma sonda para encontrar o gene de interesse.
*
*
 Uma sonda sintética pode ser criada com base no código genético e na sequência de aa conhecido da proteína codificada pelo gene de interesse.
Sonda Sintética
*
*
 No “caminhar” no cromossomo, os genes vizinhos são usados para localizar
um gene de interesse.
*
 O uso das sequências de DNA para identificar uma pessoa é chamado fingerprinting de DNA.
Fingerprinting
*
Todas essas tecnologias em necessitam e usam da clonagem
*
uma enzima de restri<;ao cortara o DNA
em urn con junto de fragmentos de restri.;ao determinados
pelos locais dos sitios de restri<;ao.
*
*
*
*
*
Fonte : Griffths , 2008
*