Técnicas estudo expressão gênica 2016.2

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Técnicas de Estudo da 
Expressão Gênica
Biologia Molecular – GBI120
2016/2
Técnicas de Estudo 
da 
Expressão Gênica
1
Os Níveis da Pesquisa Genômica
Estudo dos genes e suas funções  Chegada com o projeto Genoma Humano
 Genômica Comparativa
Utiliza o produto da expressão gênica  RNA 
Tecido/Tempo/ambiente. 
SAGE. DNA Microarray , DD ...etc
Tenta descrever o conjunto completo de proteínas produto da expressão do genoma
Análise do fluxo celular pela pesquisa genômica
A concepção dos métodos de análise de transcriptomas
Baseiam-se na quantificação do mRNA em uma célula ou tecido sob determinadas condições
5
Transcriptoma
 Análise dos níveis de RNA de vários genes simultaneamente;
Um genoma possui vários transcriptomas
Transcriptomas temporais 
Ex: tempo após sujeição a um estresse
Ex: tempo após uma determinada fase do desenvolvimento
Transcriptomas espaciais
Ex: transcriptoma celular-específico
Ex: transcriptoma tecido-específico
Ex: transcriptoma orgao-específico
 Já conhecida desde 1930;
 Difundida em 1950-1960;
 Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico;
 Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida;
 Separa proteínas por cargas e peso molecular;
 Separa ácidos nucléicos por peso molecular.
Eletroforese
Eletroforese
Analogia - mais leve (menino de branco / magro)  chega primeiro;
Mais pesado  demora mais
9
Eletroforese
O impacto da descoberta da PCR
 Revolucionou a Genética Molecular  torna possível um melhor estudo e análise de genes;
Mark R. Hughes, director do National Center for Human Genome Research at the National Institutes of Health (mais conhecido como Projecto do Genoma Humano).
Causou um maior impacto na Biologia Molecular, Medicina, Paleontologia Molecular, etc.
 A técnica de PCR permite analisar e amplificar quantidades minúsculas de DNA rapidamente e sem grandes custos econômicos;
“PCR is the most important new scientific technology to come along in last hundred years”
PCR
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma metodologia que pode ser realizada inteiramente in vitro, e visa a amplificação de uma sequência específica de DNA
Síntese de fragmentos de DNA, através da enzima DNA-polimerase e de iniciadores (primer) que definem a seqüência a ser replicada.
Região que se pretende amplificar
1 ° - Extrair o DNA 
2° Uso de um primer (iniciador)
3° Duplicação, amplificação do gene escolhido  PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Gera a partir de uma única molécula de DNA milhões de cópias
Síntese de fragmentos de DNA, através da enzima DNA-polimerase e de iniciadores (primer) que definem a seqüência a ser replicada.
PCR – Requerimentos básicos
Amplificação de Seqüências
20 a 40 ciclos
Realizando por mudança de temperatura
Componentes
 Molde - DNA ou RNA
DNA polimerase (Taq)
Nucleotídeos (dNTPs)
Mg2+
Iniciadores de Oligonucleotídeos (Primers)
Solução Tampão de PCR (10x)
H2O ultra-filtrada (pH 7.0)
Termociclador
As fases do Ciclo da PCR
 A PCR é um processo cíclico; 
 Este ciclo é normalmente repetido 20-40;
Desnaturação
 A 94ºC a dupla cadeia de DNA molde é desnaturada dando origem a 2 cadeias simples. cadeias simples
Na fase de desnaturação a mistura reaccional é aquecida até à temperatura de desnaturação – 94ºC – durante um minuto, de modo a separar as duas cadeias da molecula de DNA molde. A esta temperatura ocorre quebra das ligações de hidrogénio que estabelecem a interacção entre as duas cadeias de DNA. 
No primeiro ciclo esta fase é mais prolongada (1 a 2 minutos) de modo a assegurar que o DNA molde desnature completamente e que os primers não hibridem com as cadeias simples obtidas. 
Após o 1º ciclo a fase de desnaturação dura apenas 30 segundos, e neste caso o calor é usado não só para desnaturar o DNA, mas também para parar todas as reacções enzimáticas, como por exemplo, a síntese que ocorre durante a fase de extensão do ciclo anterior. 
20
Hibridação / Annealing
 A mistura reaccional é arrefecida até à tempeatura de annealing (55ºC).
 A esta temperatura os primers hibridam com o DNA molde nas regiões complementares.
Na fase de annealing a mistura reaccional é arrefecida até à temperatura de hibridação dos primers com a cadeia molde – 55ºC, neste caso. A esta temperatura os primers vão hibridar com a cadeia de DNA molde nas regiões que delimitam a zona que se prentende amplificar.
A temperatura desta fase depende dos primers utilizados e é geralmente 5°C abaixo da sua temperatura de fusão.
21
Extensão
 Ocorre a síntese das cadeias complementares de DNA por acção de um polimerase;
 A temperatura aumenta até à temperatura óptima deste enzima (72ºC).
Na fase de desnaturação a mistura reaccional é reaquecida até à temperatura óptima para a actividade do DNA polimerase – 72ºC neste caso durante 3 min. O enzima começa a adicionar bases ao primer produzindo, assim, uma nova cadeia de DNA complementar a cada uma das cadeias molde. A temperatura de elongação depende do DNA polimerase utilizado. O tempo de duração desta fase depende do DNA polimerase e do comprimento do fragmento de DNA que se pretende amplificar. Normalmente considera-se 1 minuto por cada 1000pb.
22
 A utilização da PCR possibilitou grandes avanços:
Análise de genes – sequenciamento genoma
Diagnóstico de doenças genéticas
Detecção de agentes infecciosos
Expressão de genes
Medicina Forense
PCR 
DNA Polimerases termo-resistentes
Característica importante  Taxa de erro (Erro/pb)
 Taq  1  10-4 a 1  10-5
 Pfu   1,5  10-6
 Vent  4,5  10-5
24
Os DNA polimerases termofílicos, como outros DNA polimerases, catalizam a síntese dirigida do DNA a partir dos trifofatos de nucleótidos. 
Além do Taq DNA polimerase, outros DNA polimerases termo estáveis foram isolados e expressos a partir de genes clonados. Três dos polimerases mais usados são descritos na seguinte tabela: 
 Geralmente, têm actividade catalítica máxima de 75 a 80 ºC, e actividades substancialmente reduzidas a temperaturas mais baixas. 
A 37ºC, o Taq polimerase tem apenas aproximadamente 10% da sua actividade máxima.
As DNA polimerases utilizadas em PCR têm de ser termoestaveis, de modo a suportarem as elevadas temperaturas de desnaturação. 
As Taq que não possuem actividade de exonuclease de 3’ – 5’ têm geralmente taxas de erro mais elevadas (desvantagem da Taq)
A taxa de erro não é a única consideração na escolha do polimerase para PCR, se não o Taq polimerase de Taq não seria o enzima mais extensamente utilizado nesta técnica. 
PCR em Tempo Real
Definição
Técnica de PCR com a utilização de uma sonda fluorescente que se hibridiza com a sequência-alvo, gerando um sinal que é acumulado e emitido durante a amplificação, sendo proporcional à concentração de produtos amplificados. 
		
Sistema de detecção de PCR em tempo real é baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente.
PCR em Tempo Real
Técnica descrita como QUANTITATIVA porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas ciclo a ciclo sugerindo a denominação PCR em Tempo Real
PCR em Tempo Real
 Questões relativas às abreviações : 
• RT-PCR (reação da transcriptase reversa – síntese de cDNA)
• qPCR (PCR quantitativo ou Real Time PCR)
• RT-qPCR (reação da transcriptase reversa seguida de quantificação por PCR)
Baseado na detecção e quantificação de uma molécula repórter fluorescente.
O primeiro aumento significativo na quantidade de material amplificado da PCR (CT - threshold cycle) correlaciona-se com a quantidade inicial de amostra alvo (template).
Princípios
PCR em Tempo Real
Três métodos principais para ensaios quantitativos (sistemas de detecção de fluorescência): 
1. Agentes ligantes ao DNA (SYBR Green);
2. Sondas de Hidrólize (TaqMan, Lux, Beacons, Scorpions);
3. Sondas de Hibridização (Light Cycler).
Princípios
PCR em Tempo Real
Análise em tempo real
Constante detecção e monitoramento
dos produtos de amplificação durante toda corrida (emissão de fluorescência)
PCR tradicional
Detecção do produto em gel de agarose
PCR tradicional x PCR tempo real
 Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo. Reação específica e precisa.
 Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação).
 Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais produzidos e começam a ser degradados.
Fases da PCR 
Área de detecção real-time
Área de detecção PCR normal
PCR em Tempo Real
Vantagens do Real-time PCR
 Não influenciado por amplificação não específica (TaqMan);
 Não ocorre processamento Pós-PCR (baixo risco de contaminação);
Nenhum experimento de Hibridização é necessário;
 Ciclos mais rápidos (30 minutos a 2 horas);
PCR em Tempo Real
Vantagens do Real-time PCR
PCR em Tempo Real
Mais específico, sensível e reprodutivo;
 A amplificação pode ser monitorada em tempo real;
 
 Requer 1000x menos DNA/RNA que os ensaios convencionais;
Avaliação da especificidade por curvas de dissociação.
Desvantagens do Real-time PCR
É ideal para multiplex (múltiplas sequências alvo); 
A padronização requer alto treinamento técnico e suporte;
Alto custo do equipamento.
Sistema de Tempo Real
 Composição:
 Sistema óptico
 Termociclador
 Hardware 
 Software
Sondas de Hibridização
Sondas de Hidrólize
Agente Ligante
SYBR Green
No começo da amplificação, a reação contém DNA desnaturado, primers e fluorocromo;
As moléculas não ligadas emitem fluorescência fraca, produzindo um background que é subtraído durante a análise;
 A ligação ao DNA dupla fita resulta em aumento marcante da fluorescência, principalmente durante a elongação da fita. (Durante a desnaturação do DNA, a fluorescência é baixa).
Fluoresce quando ligado 
ao DNA fita dupla
SYBR Green
Intercalante de DNA dupla fita
• A emissão de fluorescência é proporcional ao número de moléculas e ao tamanho do amplicon
Sonda de Hidrólise
Conjugada com:
Fluorocromo “repórter” emite fluorescência;
Fluorocromo “quencher” absorve fluorescência da sonda intacta.
Sistema de Hibridização TaqMan
Requisitos:
Polimerase com atividade nucleásica 5’-3’.
Uma sonda oligonucleotídica marcada com o fluorocromo repórter na extremidade 5’ e um quencher na extremidade 3’.
Exemplo: FAM (repórter) e TAMRA (quencher).
Mecanismo:
Sonda hibridiza com o alvo.
Polimerase degrada a sonda hibridizada.
Repórter separa-se do quencher.
Ocorrência do sinal fluorescente.
40
Atividade Exonuclease 5' da DNA Polimerase 
(A) Utilizou-se 105 (vermelho), 104 (verde), 103 (laranja), 102 (azul), e 101 (roxo) cópias de DNA genômico. As curvas mostram aumento da fluorescência em 8 amostras replicadas em cada concentração inicial. 
Linear After The Exponential (LATE) PCR
 Detecção de produtos amplificados específicos em amostras contendo concentrações iniciais diferentes de DNA. 
(B) Gráfico da concentração inicial de DNA versus Ciclo, demonstram a natureza quantitativa dos valores dos pontos na linha (R2 = 0,974).
Linear After The Exponential (LATE) PCR
 Detecção de produtos amplificados específicos em amostras contendo concentrações iniciais diferentes de DNA. 
Sonda de hidrólise: Descriminação de alelos através de sondas TaqMan
Amplificação em Tempo Real
45
 Permitem, respectivamente, a detecção de DNAs ou de RNAs específicos por hibridação com sondas apropriadas, de DNA e RNA.
Hibridação Southern e Hibridação Northern 
Hibridação Southern e Hibridação Northern 
Estas técnicas envolvem as seguintes etapas:
Misturas de moléculas de RNA de cadeia simples (Hibridação Northern) ou de DNA de cadeia dupla obtidas por digestão com enzimas de restrição (Hibridação Southern) são separadas por eletroforese com base na dimensão.
2. As moléculas de RNA ou fragmentos de DNA desnaturados por exposição de DNA a condições alcalinas desnaturantes, são transferidos para membranas de nitrocelulose ou de nylon.
3. A membranas, contendo os ácidos nucléicos ligados, é cuidadosamente removida do gel.
Hibridação Southern e Hibridação Northern 
4. A membrana é depois colocada num saco selado ou numa garrafa de hibridação, juntamente com a solução de hibridação (uma solução salina tamponada) e a sonda de DNA ou de RNA, radioativamente marcada e na forma de cadeia simples, por um período de tempo prolongado em condições que favorecem a hibridação.
5. A membrana é um seguida removida do saco ou da garrafa de hibridação e lavada vigorosamente, de modo que apenas as moléculas de sonda que hibridaram com o RNA ou com o DNA imobilizado na membrana permanecem ligadas. Após auto-radiografia, o DNA ou o RNA que hibridou com a sonda marcada é visualizada como uma banda.
 Estas técnicas envolvem as seguintes etapas:
 E. M. Southern (1975);
 Fragmentos de DNA são separadas em gel de agarose;
 Transferidos para a membrana por ação capilar;
 DNA é desnaturado antes ou durante a transferência;
 Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana;
 Detecta polimorfismo de DNA ou mutação.
Southern Blotting
Southern Blotting
Aplicação: Alteração em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo.
 Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado!
Northern Blotting
 Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose;
 RNAs devem ser desnaturados (formaldeído);
 Sensibilidade a RNAses;
 Transferência para a membrana por ação capilar;
 Sondas de RNA ou DNA para hibridar;
 Úteis em estudo de expressão gênica;
 Estudo de diferentes tecidos;
 Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento de indivíduos 
controle
mutante
Northern Blotting
Zoo-blotting
Northern Blotting
Western Blotting
 Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida;
 Separação e caracterização de proteínas;
 Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação;
 Transferência para a membrana por força elétrica;
 Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal;
 Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo;
 Informa o tamanho e a quantidade das proteínas.
Western Blotting
Gene Repórter
 Alguns exemplos de gene repórter
	Gene	 Produto Gene
	lacZ   -galactosidase
	uidA	 - glucoronidase
	lux 	Luciferase
	GFP 	 Proteína fluorescente verde
Gene Repórter
 A recombinação homóloga com genes repórteres permite determinar em quais células os genes são expressos:
 Como identificar o local da célula em que os genes são expressos?
 Imunocitoquímica
Green Fluorescent Protein
Expressão da proteína phot1 em fusão com GFP em brotos com 3 dias de germinação:
 (A) Imagem completa do broto obtida por microscopia de fluorescência.
(B) Imagem confocal da região do gancho do hipocótilo . 
(C) Imagem confocal do cotilédone. 
(D) Imagem confocal da ponta da raiz. 
(E) Fototropismo do mutante nulo de phot1-5 e do mutante transformado com PHOT1-GFP visualizado sob luz branca. 
(F) ) Fototropismo do mutante nulo de phot1-5 e do mutante transformado com PHOT1-GFP visualizado sob luz azul. 
Barras = 300 µm.
58
DNA-arrays (Macro/Microarranjos)
 Extração do mRNA;
 Síntese de uma sonda que consiste em cDNA marcado com nucleotideos radiativos (dNTP) com P-33 P-32;
 Hibridização;
 Leitura do Sinal;
59
Construção de Sondas
DNA-arrays (Macro/Microarranjos)
60
Hibridização
DNA-arrays (Macro/Microarranjos)
61
Leitura do Sinal
DNA-arrays (Macro/Microarranjos)
62
Microarray – Chip de DNA
Microarranjos de DNA
 É uma técnica que emprega arranjos (arrays), que contém um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro.
Microarray – Chip de DNA
Microarranjos de DNA
 Existem lâminas de 400.000 pontos. São feitas com ponteiras de titâneo.
 Pode comparar a expressão de um grande número
de gene, simultaneamente.
 Microdisposição de oligo ou de sondas:
 - Microssíntese de oligos ou in situ ( no chip);
 - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré-fabricadas;
 - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA.
Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes;
Leitura por scanners
 Detecção de mutações gênicas e de polimorfismo;
 Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais;
 Sequenciamento do DNA e genotipagem.
Microarray – Chip de DNA
Microarranjos de DNA
Aplicação
Contras
Utilização
Técnica cara
Mapear mutações
Sensibilidadereduzida
Oncogenes
Lâminasnão são reutilizadas
Expressão das vias metabólicas
Repetirvárias vezes
Regiões regulatórias de genes de levedura
Grande quantidade demRNA
(2 a 5μg)
Expressãode genes anônimos
Analisar 10.000amostras em 12 horas.
Microarray – Chip de DNA
Microarranjos de DNA