Replicação de DNA[1]

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http://www.marketingemsaude.com.br/video/video1.htm
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REVISÃO
http://www1.folha.uol.com.br/folha/especial/2003/dna/fe0703200313.shtml
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Replicação de DNA
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Dogma Central da Biologia Molecular
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Uma característica essencial à continuidade da vida em nosso planeta é a capacidade que os organismos tem de fazerem cópias de si mesmos. 
Essa capacidade de copiar está associada ao material hereditário, o DNA. Agora, de que maneira os organismos fazem as cópias?
Essas cópias são feitas através da duplicação do material hereditário, ou seja, do DNA. Esse processo de duplicação do DNA, chamamos de replicação.
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A replicação do DNA é catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas enzimas sintetizam a nova fita de DNA, utilizando como molde ("template") a fita complementar da molécula existente. Para que ocorra a síntese, a molécula de DNA deve ser desnaturada, ou seja, as fitas devem ser separadas pelo rompimento das ligações que mantêm a dupla hélice. 
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Além da fita molde, é necessário a presença de um iniciador ou "primer", ou seja, um pequeno fragmento de RNA simples fita complementar à fita molde. 
Nas manipulações in vitro, os iniciadores podem ser criados pela ação de uma dada enzima (RNase H) ou produzidos em máquinas de síntese de oligonucleotídeos e adicionados ao tubo de reação. 
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O crescimento da cadeia de DNA sempre se faz no sentido 5' para 3', ou seja, um novo nucleotídeo é adicionado à cadeia pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último nucleotídeo presente na cadeia em crescimento. A transcriptase reversa é um tipo de DNA polimerase capaz de sintetizar uma nova fita de DNA utilizando como molde um RNA mensageiro; portanto, trata-se de uma DNA polimerase RNA dependente. 
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Replicação do DNA é semi conservativa
Watson e Crick propuseram que um dos filamentos de cada molécula filha de DNA é recém sintetizado, enquanto o outro fica inalterado, vindo da molécula original de DNA. Esta distribuição de átomos parentais é chamada de semiconservativa.
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Modelo Semiconservativo
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Experimento que prova isso
Células de E.coli crescidas por várias gerações, num meio onde a única fonte de nitrogênio era cloreto de amônio (NH4Cl) com a substituição do nitrogênio normal (14N ) por nitrogênio "pesado" (15N). 
Desta forma, todos os componentes nitrogenados das células que cresceram neste meio, incluindo as bases do DNA, estariam enriquecidos por nitrogênio "pesado". A densidade dos componentes das células crescidas em 15N é maior do que a dos componentes das células crescidas em meio "normal" (14N) , no caso o DNA das células "parentais". 
A análise do experimento foi feita por ultra-centrifugação utilizando uma solução concentrada de cloreto de césio
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Com estas observações concluiu-se que a replicação do DNA é semi-conservativa. 
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DNA Polimerase I
Foi a primeira enzima dirigida por um molde a ser descoberta. 
A DNA polimerase I não é a enzima que replica a maior parte do DNA em procariotos. Entretanto, ela tem um papel crítico na replicação, e também no reparo de DNA.
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A DNA polimerase I requer todos os quatro desoxirribonucleotídeos 5' trifosfatos - dATP, dGTP, dTTP, dCTP e magnésio para a síntese de DNA. A enzima adiciona   desoxirribonucleotídeos às extremidades 3'- OH livre da cadeia que está sendo alongada, que ocorre no sentido 5' para 3'.
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Um molde de cadeia (primer) com uma 3'- OH livre é necessário no início da replicação. 
Também é essencial um molde de DNA contendo uma região unifilamentar. A polimerase catalisa o ataque nuceofílico do terminal 3'- OH do primer no átomo de fósforo mais interno de um dNTP. É formada uma ligação fosfodiéster, sendo liberado um pirofosfato. A reação é ativada pela hidrólise subseqüente de PPi pela pirofosfatase inorgânica.
A polimerização é catalisada por um único centro ativo que pode ligar-se a qualquer um dos quatro dNTPs. Qual o que se liga irá depender da base correspondente
no filamento molde.
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A reação de polimerização de cadeias polidesoxirribonucleotídicas
As polimerases do DNA atuam adicionando um nucleotídeo por vez na extremidade 3´-OH livre de uma cadeia polinucleotídica em formação, que se encontre emparelhada com a cadeia molde. Por isso dizemos que a síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´.
O primeiro passo na adição de um novo nucleotídeo à nova cadeia que está sendo sintetizada, é o emparelhamento deste ao nucleotídeo correspondente na cadeia molde. A identificação do dNTP (desorribonuleotídeo trifosfatado) a ser incorporado é feita através de um emparelhamento de bases entre o dNTP e o nucleotídeo da cadeia molde. Como se dá esse emparelhamento?
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dT emparelha-se com dA e dG emparelha-se com dC.
Estando o dNTP emparelhado corretamente, a polimerase do DNA catalisa a formação de uma ligação fosfodiester 5' - 3' entre o novo nucleotídeo e a cadeia em formação. A ligação fosfodiéster ocorre como consequência de um ataque nucleofílico do grupo 3'-OH livre da cadeia em formação sobre o fosfato do dNTP que está sendo incorporado. A hidrólise do trifosfato do nucleotídeo fornece a energia termodinâmica para a polimerização. Após a formação da ligação fosfodiéster, a polimerase do DNA avança um resíduo de nucleotídeo na cadeia molde posicionando-se para promover a ligação de um novo dNTP à cadeia em crescimento.
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Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
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Polimerização
http://www.biomol.org/design/assets/animacoes/dna_repl/polimeriz.htm
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Replicação: o sentido da síntese de DNA
A replicação semi-conservativa do DNA exige que duas cadeias polinucleotídicas que formam a hélice do DNA se separem, de modo a expor as bases que irão orientar o emparelhamento dos nucleotídeos para formação das novas cadeias complementares às cadeias moldes.
A separação de duas cadeias da hélice do DNA ocorre à medida que as novas cadeias vão sendo sintetizadas. A região de separação das cadeias tem a forma de uma letra Y e é denominada forquilha de replicação.
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Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
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A síntese semi-descontínua do DNA 
Os experimentos mostraram que ambas as cadeias filhas são sintetizadas na forquilha de replicação por um complexo de enzimas que inclui a polimerase III do DNA. Como, no entanto, as duas cadeias moldes são antiparalelas, em uma delas a síntese da cadeia complementar ocorre no sentido 5´ => 3´, mas na outra cadeia essa síntese teria que se dar no sentido inverso, ou seja, 3´ => 5´. No entanto, as duas cadeias são sintetizadas pela DNA polimerase III, que só catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´ => 3´.
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A explicação para esse paradoxo é que, na forquilha de replicação, uma das cadeias é sintetizada continuamente por uma polimerase que se move no mesmo sentido do deslocamento da forquilha. Já a cadeia com polaridade inversa é sintetizada no sentido inverso ao do deslocamento da forquilha de replicação, portanto, também no sentido 5´ => 3´. Isso é possível porque, nesse último caso, a polimerase sintetiza segmentos polinucleotídicos curtos, que são, posteriormente, unidos para formar a nova cadeia contínua.
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A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
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A cadeia que cresce no mesmo sentido que o deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre continuamente, é chamada de cadeia leading.
 A cadeia que cresce no sentido oposto ao deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre descontinuamente, é chamada de cadeia lagging.
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Esse modo de replicação do DNA, em que uma das cadeias é sintetizada continuamente e a outra, descontinuamente, é chamado de síntese semidescontínua. Costuma-se dizer também que a síntese do DNA na forquilha de replicação é assimétrica, pois em uma das cadeias (cadeia leading) ela ocorre continuamente, enquanto que na outra (cadeia lagging) ela ocorre de modo descontínuo, em fragmentos. Esses fragmentos são denominados fragmentos de Okazaki.
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A descoberta dos fragmentos de Okazaki
A hipótese da síntese descontínua da cadeia lagging foi corroborada por um experimento realizado pelo pesquisador Reiji Okazaki, no final da década de 1960. Okazaki forneceu, a bactérias em divisão, timina tritiada, isto é, um desoxirribonucleotídeo com a base timina (=timidina) marcado com átomos de trítio (um isótopo radioativo do hidrogênio). 
Esse precursor do DNA, altamente radioativo, foi deixado em contato com as bactérias por apenas alguns segundos, de modo que somente o DNA recém-sintetizado, ou seja, aquele imediatamente após a forquilha de replicação, se tornasse radioativo. 
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DNA foi então isolado e analisado, mostrando que parte da radioatividade estava contida em fragmentos de cadeias polinucleotídicas, com cerca de mil a dois mil nucleotídeos.
Quanto maior fosse o tempo de contato das bactérias com o precursor radioativo maior era quantidade de radioatividade em cadeias de DNA de grande tamanho. A conclusão foi que os nucleotídeos eram primeiramente polimerizados em fragmentos de mil a dois mil nucleotídeos, os quais eram, em seguida, reunidos para formar cadeias longas. 
Esses pequenos pedaços de DNA que aparecem transitoriamente durante a síntese da cadeia lagging foram denominados fragmentos de Okazaki.
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Atividade exonucleásica revisora 3'-5' 
A DNA polimerase I também catalisa a hidrólise de nucleotídeos não pareados um de cada vez, na ponta 3' das cadeias de DNA ( atividade de exonuclease 3'-5'). O centro ativo de exonuclease é diferente do da polimerase.
A atividade de exonuclease da DNA polimerase I tem uma função de revisão na polimerização.
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Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação
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DNA polimerase I é uma cadeia polipeptídica única com três atividades enzimáticas:
1 - polimerização no sentido 5´ => 3´
2 - atividade exonucleotídica no sentido 3´ => 5´
3 - atividade exonucleotídica no sentido 5´ => 3´
A polimerização e a revisão podem ocorrer quase que simultaneamente sem que o DNA se separe da enzima, pela proximidade entre o centro de ação exonucleásica 3'-5' e o de polimerase, porque assim, permite que o terminal 3' da cadeia em crescimento desloque-se para trás e para frente entre eles.
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Existem proteases que cortam a polimerase I em dois fragmentos polipeptídicos de tamanhos diferentes. O maior, denominado fragmento Klenow, conserva a capacidade de polimerização e a atividade exonucleotídica 3´ => 5´. Já o fragmento menor, que não recebe denominação especial, mantém a atividade exonucleotídica 5´ => 3´.
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DNA Polimerase II
Similar à DNA polimerase I e III em vários aspectos: 
Catalisa uma síntese de DNA dirigida por molde a partir de precursores desoxirribonucleosídeos 5'- trifosfato,
é necessário um primer com uma 3'-OH livre.
a síntese é no sentido 5'-3',
possui atividade de exonuclease 3'-5'.
A DNA polimerase II participa no reparo do DNA, mas não e necessária para a replicação do DNA.
 
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DNA Polimerase III
Possui todas as características que a DNA polimerase II tem similares a DNA polimerase I. Além disso é ela que sintetiza a maior parte do novo DNA.
Tem como característica alta processividade, potência catalítica e fidelidade. Isso a diferencia da DNA polimerase I que tem como função o reparo e preenchimento de espaços, além de ter uma processividade muito menos eficiente.
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Resumindo:
A atividade de síntese das polimerases do DNA é adicionar nucleotídeos na extremidade 3´OH livre de uma cadeia em crescimento. Isso quer dizer que as polimerases do DNA requerem a presença de uma extremidade 3´OH livre de um nucleotídeo corretamente emparelhado à cadeia molde, para poderem atuar.
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A primase do DNA e a síntese do primer de RNA
Para que a polimerase III do DNA comece uma polimerização é necessário que uma outra enzima adicione os primeiros nucleotídeos. Essa enzima é uma polimerase especial que catalisa a síntese de um pequeno fragmento de RNA sobre a cadeia molde do DNA, o qual atua como iniciador para a polimerase III do DNA adicionar desoxirribonucleotídeos.
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O fragmento de RNA iniciador de uma cadeia de DNA que, em bactéria, tem cerca de 2 a 3 nucleotídeos, é chamado de primer de RNA e a enzima que catalisa sua síntese é denominada primase do DNA.
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A primase do DNA atua no início da replicação, sintetizando o primer necessário para começar a síntese da cadeia leading, e também, durante todo o processo, sintetizando os primers necessários para o início da síntese de cada fragmento de Okazaki. Isso é necessário porque após completar um fragmento de Okazaki, a polimerase do DNA da cadeia lagging precisa iniciar a síntese de um novo fragmento.
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Os primers de RNA são feitos a intervalos regulares sobre a cadeia molde da cadeia lagging e são, em seguida, alongados pela polimerase III para gerar os fragmentos de Okazaki. A síntese de cada fragmento de Okazaki termina quando a polimerase do DNA atinge o primer de RNA ligado à extremidade 5´ do fragmento sintetizado anteriormente.
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http://www.biomol.org/design/assets/animacoes/dna_repl/anim2/replicacao_dna.htm
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A substituição do primer por um segmento de DNA
Nas proximidades da forquilha de replicação, a cadeia lagging é constituída, portanto, por fragmentos de Okazaki, ligados à seus respectivos primers de RNA, dispostos linearmente ao longo da cadeia molde. Os primers de RNA precisam ser removidos e substituídos por segmentos de DNA, antes dos fragmentos de Okazaki serem unidos entre si. A eliminação dos primers é feita pela atividade exonucleotídica 5´ => 3´ de uma enzima que pode ser tanto uma "Rnase H" quanto a "polimerase I" do DNA.
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A Rnase é uma enzima que degrada especificamente moléculas de RNA que formam híbridos com DNA, ou seja, cadeias de RNA emparelhadas a cadeias de DNA. Assim, elas podem detectar o primer de RNA, que se encontra emparelhado à cadeia molde de DNA, e degradá-lo. Quando isso ocorre, cria-se uma falha entre dois fragmentos de Okazaki contiguos, a qual é preenchida por ação de uma polimerase de reparo de DNA, a polimerase I do DNA.
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http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.html
(replicação-animação)