SEQUENCIAMENTO GENÔMICO

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Fabiana G. S. Pinto
SEQSEQÜÜENCIAMENTO ENCIAMENTO 
GENÔMICOGENÔMICO
TTéécnicas e Aplicacnicas e Aplicaççõesões
Fabiana G. S. Pinto
Ácidos Nucléicos
* 2 tipos de ácidos nucléicos: DNA -Ácido desoxirribonucléico
RNA- Ácido ribonucléico
* Constituição dos Nucleotideos:
Base nitrogenada - Pentose - Grupo fosfato *
* Bases Nitrogenadas: *
Púricas: Adenina (A) ; Guanina (G) e Pirimídicas: Timina (T), Citosina (C) 
Uracil (U)
DNA: A, G, C, e T e RNA: A, G, C, e U
DNA X RNA
Fabiana G. S. Pinto
Seqüências não codificadoras 
e 
Seqüências codificadoras
(proteinas, rRNA, tRNA)
GENES 
Repertório total de genes do organismo vivo 
GENOMA
OrganizaOrganizaçção do DNA nos organismos vivos ? ão do DNA nos organismos vivos ? **
OrganizaOrganizaçção do Genoma nos organismos vivos?ão do Genoma nos organismos vivos?
Fabiana G. S. Pinto
Conceitos Básicos
GENÔMICA:GENÔMICA:
- Elucidar o genoma de um organismo e o papel dos genes que o compõem 
desde o ponto de vista estrutural e funcional
11-- GENÔMICA ESTRUTURAL:GENÔMICA ESTRUTURAL:
-- Identificar, isolar, localizar e caracterizar o conjunto deIdentificar, isolar, localizar e caracterizar o conjunto de genes genes de um de um 
organismo. (GENOMA)organismo. (GENOMA)
22-- GENÔMICA FUNCIONAL:GENÔMICA FUNCIONAL:
--Descrever a funDescrever a funçção biolão biolóógica dosgica dos genes genes mediante o conhecimento de mediante o conhecimento de 
como eles interacionam, para definir um fencomo eles interacionam, para definir um fenóótipo tipo determindodetermindo
2.12.1-- GENÔMICA COMPARATIVAGENÔMICA COMPARATIVA
- Comparação e estudos da evolução dos genomas
GENOMA: todo DNA existente num organismo
GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional 
(proteínas ou RNAs)
Fabiana G. S. PintoOS NOS NÍÍVEIS DA PESQUISA GENÔMICAVEIS DA PESQUISA GENÔMICA
Genômica EstruturalGenômica Estrutural
Mapeamento 
de genes
Seqüênciamento 
de DNA
Anotação das 
seqüências 
Genômica Funcional Genômica Funcional 
Expressão 
Transcriptoma
Análise de 
mutantes
Proteoma
Genômica Comparativa Genômica Comparativa 
Fabiana G. S. Pinto
mRNAmRNA
PrPréé--mRNA mRNA 
DNADNA
GENÔMICA GENÔMICA 
ESTRUTURALESTRUTURAL
MetabMetabóólitoslitos
ProteProteíínasnas
mRNAmRNA
GENÔMICA GENÔMICA 
FUNCIONALFUNCIONAL
TRANSCRIPTOMATRANSCRIPTOMA
PROTEOMAPROTEOMA
METABOLOMAMETABOLOMA
Fabiana G. S. Pinto
DNA
Pré-mRNA 
mRNA
Regulação
mRNA
Proteína
Metabólitos
citoplasma
núcleo
(Transcriptoma)
(Proteoma)
(Metaboloma)
(Genoma)
AnAnáálise do fluxo da informalise do fluxo da informaçção celular pela pesquisa genômicaão celular pela pesquisa genômica
•Mapeamento
•Seqüênciamento
•Anotação 
•Microarranjos de 
DNA
•Hibridização
•Eletroforese em 
Gel 2D
•Espectrometria 
de massa
•Seqüênciamento
de proteínas
•Cromatografia
•Espectrometria
Genômica 
Estrutural
Genômica 
Funcional
Fabiana G. S. Pinto
1866 Gregor Mendel – estabelece as leis da hereditariedade
1903 Walter Sutton - Cromossomos são unidades hereditárias 
1913 Thomas Morgan - Cromossomos arranjos lineares de gene
1944 Avery, McCarty, McLeaod, Griffith’s - O DNA é o material 
genético. Harshey, Chase (1950)
Histórico da Genética e a Corrida pelo Projeto Genoma
1945 Beadle, Tatum - Um gene codifica uma proteína
1953 Franklin, Wilkins, Watson, Crick - O DNA é uma dupla hélice 
1958 Meselson, Stahl - O DNA replica semicoservativamente
Fabiana G. S. Pinto
1961 Marshall Nirenberg - O código genético é formado por um códon 
de três bases – RNA mensageiro
1983 Kary Mullis cria a técnica do PCR 
1995 Haemophilus influenzae – 1º genoma completo sequenciado - TIGR
1978 GENENTECH, americana, produz insulina humana recombinante
1988 Início Projeto Genoma Humano Estatal-PGH (NIH-USA)
1972 Paul Berg produz a 1ª molécula de DNA recombinante, um grande 
passo para experimentos entre organismos diferentes, 
1998 Craig Venter – CELERA GENOMICS- sequenciar genoma humano
2003 Grupo PGH finalização sequenciamento: 3,2 bilhões pb – U$ 4 bilhões
Fabiana G. S. Pinto
GENOMAS NO MUNDO
www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/
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GENOMAS NO BRASIL
1997: ONSA criada pela FAPESP – Rede 30 laboratórios
2000: Publicado 1º genoma patógeno vegetal: Xylela fastidiosa 
(CVC) – U$12 milhões
Fabiana G. S. Pinto
Fabiana G. S. Pinto
2000: REDE PROJETO GENOMA BRASILEIRO 2000: REDE PROJETO GENOMA BRASILEIRO –– BRGENE BRGENE 
-- 25 centros25 centros em todo o paem todo o paííss
-- CNPq e MCTCNPq e MCT
2001 : 2001 : ChromobacteriumChromobacterium violaceumviolaceum -- RR$26 $26 milhõesmilhões
http://www.brgene.lncc.br/http://www.brgene.lncc.br/
Fabiana G. S. PintoGENOMAS REGIONAIS BRASILEIROS GENOMAS REGIONAIS BRASILEIROS 
Rhizobium tropici
Crinipellis perniciosa
Gluconacetobacter
diazotrophicus
Herbaspirillum seropedicae
ÁÁrea de rea de 
AgriculturaAgricultura
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de Genomas
Complexidade de Genomas
10000033200 MbGenoma Humano
1200010125 MbArabidopsis thaliana
1360013180 MbDrosophila melanogster
190992598 MbCaenorhabditiselegans
58857012 MbSaccharomycescereviciae
4432904,7 MbChromoacteriumviolaceum
4288904,6 MbEscherichia coli
Tamanho
Seqüências
Codificantes 
(%)
Número de 
genes
Fabiana G. S. Pinto
• Definição :
- Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) 
em um segmento de DNA
Seqüênciamento de DNA
•Importância:
- O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece 
importantes informações sobre sua estrutura, função e relação 
evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de 
organismos diferentes)
* No caso do Projeto Genoma Homem, foi 
determinada a ordem exata dos 3 bilhões de 
pares de bases que constituem o DNA dos 24 
cromossomos
Fabiana G. S. Pinto
Etapas para Seqüênciamento Genômico
* Isolamento DNA organismo – Biblioteca Genômica
* Fragmentar DNA: métodos químicos ou físicos
* Separação DNA tamanho de interesse (gel) e Reparo do DNA
* Clonagem: fragmento DNA interesse + Vetor (plasmídeo)
- Transformação: Escherichia coli
* Seleção dos transformantes em meio seletivo e crescimento colônias
* Extração de plasmídeo+inserto : PCR seqüênciamento com marcação fluorocromos
* Injeção amostras no Sequenciador Automático: Leituras fragmentos (READS)
* Obtenção grande nº seqüências: BIOINFORMÁTICA
* Processamento e Montagem das seqüências e Anotação do Genoma
Fabiana G. S. PintoESTRATESTRATÉÉGIAS DE SEQGIAS DE SEQÜÜENCIAMENTO DE GENOMASENCIAMENTO DE GENOMAS
“shotgun” Hierárquico “shotgun” genoma inteiro
Geração de milhões 
de fragmentos a 
serem seqüenciados 
Construção 
de mapas 
de clones 
(BAC) e 
seleção 
dos clones 
mapeados
Geração de 
centenas de 
fragmentos 
a serem 
seqüenciados 
Montagem Montagem
Fabiana G. S. PintoSeqüênciamento shotgun do genoma inteiro
DNA DNA 
GenômicoGenômico
Clones Clones ShotgunShotgun
(Plasmideos ou 
Cosmídeos)
SeqSeqüüênciaência
ShotgunShotgun
MontagemMontagem
Montagem Montagem 
finalfinal Gap Virtual Gap real
Desenho de primer 
PCR
Clones para conectarClones para conectar
Fabiana G. S. PintoSeqüênciamento shotgun Hierárquico
DNA DNA 
GenômicoGenômico
ClonesClones
ShotgunShotgun
SeqSeqüüênciaência
ShotgunShotgun
MontagemMontagem
Montagem Montagem 
finalfinal
Clones para conectarClones para conectar
SeqSeqüüênciamento ênciamento 
dos BACdos BAC
Biblioteca BACBiblioteca BAC
ContigsContigs dos dos 
clones clones 
organizados e organizados e 
mapeadosmapeados
Fabiana G. S. Pinto
• Seqüênciamento shotgun do genoma inteiroCobertura rápida do genoma
Dificuldades para finalizar e fechar o genoma
• Seqüênciamento shotgun hierárquico
Construção de clones de fragmentos maiores e 
mapas genéticos e físicos permite verificação da 
montagem das seqüências.
Ambos casos, o número de seqüências 
geradas deverá ter uma cobertura de 
> 8 vezes o tamanho do genoma total
Fabiana G. S. Pinto
Mapa genético – marcadores 
morfológicos clássicos, bioquímicos, 
genéticos, moleculares.
Mapa físico – clonagem de grandes 
regiões genômicas:
1000 Kb
YACs: Cromossomo Artificial 
Levedura
100 – 300 Kb
BACs: Cromossomos Artificial 
Bacterias
PACs: Cromossomo Artificial Fago 
45 Kb
Cosmídios: Híbridos fagos e 
plasmidios
Seqüênciamento – plasmídios ou fagos
≥ 4 kb
Seqüênciamento shotgun Hierárquico
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento final dos clones para ambas estratégias
“Eletroferograma”
Fabiana G. S. PintoClonagem de DNA em vetores para seqüênciamento
* Clonagem de fragmentos 
randômicos de DNA de um 
genoma completo.
* Clonagem de DNA de um gene 
de interesse.
* Diversos tipos de Vetores
PCU18/19 para insertos 
≥ 4 kb
Inserto DNA no plasmídio 
vetor 
* Diversos tipos de Vetores
PCU18/19 para insertos 
≥ 4 kb
Fabiana G. S. Pinto
Inserto de DNA e 
Vetor cortados com a 
mesma endonuclease de 
restrição 
EcoRI
Fabiana G. S. Pinto
Seleção de clones recombinantes, contendo inserto DNA
X-Gal = Substrato cromogênico.
β Galactosidase funcional usa X-Gal → colônias azuis
β Galactosidase inativa → colônias brancas
Inserto de fragementos DNA 
que queremos sequenciar
interrompe a expressão do 
gene LacZ. Portanto, o 
fenótipo resultante de uma 
célula de E. coli
transformada com um 
plasmideo recombinate com 
DNA exógeno é uma enzima β
Galactosidase inativa β
Fabiana G. S. PintoConstrução de Bibliotecas Genômicas para seqüênciamento
• DNA genômico total: 500 ug.
• DNA fragmentado: 
Método físico, Nebulização. Sonicação.
Enzimático, Sau3AI, DNaseI. 
1- Fragmentos randômicos de DNA
Fabiana G. S. Pinto
2- Reparo das pontas dos fragmentos DNA
GTACTTTACG
CATGAAATGCAAT
GTACTTTACG 
** TGAAATGC
GGTA CTTTACG***
* CATGAAATGCAAT
GTACTTTACG “blunt”
CATGAAATGC
SmaI 1 único sítio de 
clonagem no polylinker
“Blunt” *
Fragmento klenow da 
DNA Polimerase I 
DNA Polimerase I Fago 
T4
Fabiana G. S. Pinto
2- Reparo das pontas dos fragmentos: fosforilação
5’ pGTACTTTACG “blunt”
CATGAAATGCp 5’
5’ monofosfato
Polinucleotídeo
quinase do fago T4
PNK
Função do vetor usado para clonagem: 
- Kit utilizam sistema TOPO – topoisomerase II
( desfosforilar os fragmentos em função do vetor 
fosforilado)
- Vetor pUC 18 (inverso do Kit TOPO)
Fabiana G. S. Pinto
3-Seleção dos fragmentos de DNA do tamanho desejado
Low Melting Agarose
Cortar fragmentos entre 
1 – 3 Kb
KB
3 KB
1 KB
Fabiana G. S. Pinto
4-Ligação dos fragmentos no vetor pUC18 e transformação
Seleção Ampicilina 
e colônias brancas 
Fabiana G. S. Pinto
Seleção de clones: Ampicilina (250 μg/mL) e colônias brancas
Colônias 
azuis sem 
inserto
Colônias brancas 
contém inserto
serão picadas para 
placas
Fabiana G. S. Pinto
Crescimento de clones para extração do DNA plasmidial: mini-prep.
Placas deep well para crescimento 
dos clones de E. coli. 
Meio LB Ampicilina. 12 a 16 h. 
37°C. 150 rpm.
Mini-prep – Lise alcalina
Placa de fundo U
Placa Millipore – filtro para 
purificar DNA plasmidial na 
ultima etapa da mini-prep
Fabiana G. S. PintoCrescimento de clones para extração do DNA plasmidial: mini-prep.
• Ressuspensão.
Tampão Tris-HCl. EDTA. Glicose. 
RNAse.
• Lise
NaOH/SDS. Solubilizar componentes de 
membranas celulares e lise celular.DNA 
cromossomal e plasmidial e proteinas 
desnaturados. RNA degradado.
• Neutralização.
Acetato de potássio. Precipitação 
proteína, restos celulares e DNA 
cromossomal em complexo sal-
detergente insolúvel. DNA plasmidial 
re-natura corretamente em 
sobrenadante.
• Purificação DNA plasmidial.
Centrifugação. Filtração (millipore). 
Sobrenadante DNA plasmidial 
precipita Isopropanol/Etanol.
Fabiana G. S. Pinto
Eletroforese em gel de agarose
Gel de Mini-prep em placa de 96 poços
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA
1977. Duas técnicas de seqüênciamento. 
MAXAM-GILBERT – Método Químico.
FREDERICK SANGER – Método Enzimático.
Fred SangerGilbert
Fabiana G. S. Pinto
MAXAM-GILBERT:
alteração química das bases
Walter Gilbert
Fabiana G. S. Pinto
Método de Maxam-Gilbert
• Preparações de DNA. 
Marcação com fosforo
radiativo (32P) no extremo 5’. 
• Alteração química das 
bases. Remoção e clivagem.
• Separação dos fragmentos 
por eletroforese em gel de 
poliacrilamida.
Fabiana G. S. Pinto
Frederick Sanger
Método Didesóxi/ Enzimático 
ou
Terminadores de Cadeia
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA
4 dNTPs
desoxinucleotídeos
trifosfatos
ddNTPs – Terminadores marcados 
ddG, ddA, ddT, ddC
( fluorescência) 
4 ddNTPs
di-desoxinucleotídeos
trifosfatos
Método de Sanger
Fabiana G. S. Pinto
Método de Sanger
Química de terminação da cadeia com di-desoxinucleotídeos. ddNTP.
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA Manual : Método de Sanger
DNA molde
A T T G G C G A A
A T T G G
A
A T T G G C
CA CA CT ATT C G T T T A T C
3´ 5´
T A A
5´
T A A
5´
T A A
5´
T A A
5´
A
3´
C
3´
CCA CT AATT C G T T T A T C
5´3´
TCA CT AATT C G T T A T C C
5´3´
T
3´
CA CT AATT C G T T T A T C C
5´3´
G
3´
Video: Sequenciamento Manual
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA
Auto-radiografia de Gel de 
seqüênciamento clássico para 
ambos métodos Maxam-
Gilbert e Sanger.
Gel desnaturante. Formamida 
ou Uréia.
ddNTPs marcados com 32P
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA Automatizado
Seqüênciamento automatizado ABI 377
ABI 377
Sistema de eletroforese 
gel de poliacrilamida.
Capacidade para 48 
leituras 
em 5 a 6 horas. 
Seqüências de boa 
qualidade > 400 pb.
Fabiana G. S. Pinto
MegaBace 1000.
Sistema de eletroforese 
capilar.
Capacidade para 96 
leituras 
em 1 a 3 horas. 
Seqüências de boa 
qualidade > 400 pb.
Seqüênciamento de DNA Automatizado
Seqüênciamento automatizado MegaBace 1000
Vídeo Sequenciamento Automático
Fabiana G. S. PintoSeqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Reação Seqüênciamento:
•Primer: Universal ou Reverso para
plasmídeos ou cosmídeos.
* DNA: 200 – 400ng plasmídeo (+/-4 kb)
> 800ng cosmídeo (+/-40 kb)
* Dye ET Mix
Termociclador: Ciclos de PCR 
•Kit de seqüênciamento: DyeET Mix. Mistura contendo enzima de 
seqüênciamento, “Thermo Sequenase” (DNA Polimerase com alta 
processividade e afinidade para dNTP). ddNTP, Dye terminators com duas 
marcas de fluorescência. 
•Seqüênciamento de insertos em vetores (plasmídeos ou cosmídeos)
Placa de 96 well
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Preparação para injeção 
das amostras
• Matriz Poliacrilamida
• Placa com Tampão 
• Placa com amostras
* Ajustar parâmetros de 
injeção.
* Eletro-injeção. 
•Voltagem (Kv) e 
•tempo de injeção (s).
Após Reação de seqüênciamento: 
* Precipitação dos produtos de 
PCR. Eliminar os dNTP, ddNTP
não incorporados, enzimas 
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Compartimentos internos de cátodo e anodo
cátodo anodo
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Interior da câmara contendo 6 conjunto de 16 Capilares c/u (96)
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNAem MegaBace 1000
Sistema de detecção e identificação de terminators ddNTP
• Cada um dos quatros dideoxy terminators – ddG, ddA, ddC, ddT – estão 
marcados com dois tipos de dye – fluoresceína e rodomina.
•A fluoresceína alto coeficiente de extinção (488nm) no laser de argon. 
Atua como um dye doador absorve a energia da luz do laser incidente e a 
transfere para o dye aceptor (rodomina)
•A rodomina emite a luz em um comprimento de onda característico para a 
identificação dos 4 nucleotídeos que terminam a fita de DNA. 
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Seqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Detecção de fluorescência no sequenciador automático
Fabiana G. S. Pinto
Seqüênciamento em MegaBace 1000
Eletroferograma e seqüência em nucleotídeos
A = verde G= preto
C= azul T= vermelho
Tamanho da seqüência= 400 – 700 bp
Fabiana G. S. Pinto
Eletroferograma completo
Fabiana G. S. PintoSeqüênciamento de DNA em MegaBace 1000
Score Card
Vídeo Sequenciamento Automático 2
Fabiana G. S. Pinto
Obtenção de Seqüências geradas pelo MegaBace 1000
* PHRED: 
- Transforma os dados brutos em seqüências de bases, atribuí valores 
de qualidade a cada base na seqüência e gera arquivos de saída FASTA 
e PHD
* PHRAP:
- Leitura Montagem dos pequenos fragmentos de DNA seqüenciados em 
seqüências maiores: CONTIG
* CONSED:
- Visualização e edição das montagens das seqüências de alta qualidade
• Dados brutos (medidas analógicas) de saída do seqüênciamento→ Base calling
BIOINFORMÁTICA
Fabiana G. S. Pinto
Valores de qualidade gerados pelo PHRED
Quando arquivos de seqüências de DNA são analisados pelo phred
→ a cada base é assinada um valor de qualidade, o qual é uma 
estimativa da probabilidade de erro para essa base.
Bases com um valor de qualidade de 20 são consideradas com um 
alto valor de qualidade. 
q = -10 log10(pe) onde pe= erro estimado
q20 = 1/100 probabilidade de erro
q30= 1/1000 probabilidade de erro
q40= 1/10000 probabilidade de erro 
Fabiana G. S. Pinto
Regiões genômicas que podem ser melhoradas re-seqüênciamento. 
Fabiana G. S. Pinto
Análise e Montagem das Seqüências
Seqüências shotgun analisadas Phred, Phrap e Consed
Resultado 
Seqüências ordenadas com consenso formam um “CONTIG”
Fabiana G. S. PintoEvoluEvoluçção do seqão do seqüüênciamento ênciamento shotgunshotgun
Projeto genoma → depositar as seqüências para a central de Bioinformática
Evolução dos contigs
com a submissão
das seqüências
shotgun.
Finalização
40% a 50% 
do tempo total do 
projeto
Fabiana G. S. Pinto
PCR
Animações
•http://www.dnalc.org/Sockwave/pcranwhole.html
MUITO
OBRIGADA!!!!!!!