AULA 8 LEISHMANIA

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Leishmanioses
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Leishmania é um gênero de protozoários da família Trypanosomatidae, que inclui os parasitas causadores das leishmanioses. 
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O gênero é dimórfico, possuindo duas formas principais, a amastigota intracelular e a promastigota flagelada. 
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O ciclo de vida é heteroxênico com um hospedeiro invertebrado e outro vertebrado. 
As espécies são transmitidas através de mosquitos do gênero Phlebotomus , e do gênero Lutzomyia. 
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Seus hospedeiros primários são mamíferos e répteis, afetando principalmente edentados, roedores, canídeos e humanos.
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			 Leishmania sp.
Classificação:
Filo 		 Sarcomastigophora
 Sub-filo	 Mastigophora
 Ordem 	 Kinetoplastida
 Família		Trypanosomatidae
	Gênero		 Leishmania
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Características gerais
 Protozoário flagelado
 Dois hospedeiros obrigatórios (igual ao T. cruzi /brucei ), heteroxénico 
 Habitat:
 - Vetor: lúmen do trato digestivo 
 (Subgenus Leishmania: intestino anterior/médio) 
 (Subgenus Viannia: intestino anterior/médio/posterior)
 - Hospedeiro vertebrado: células do sistema mononuclear 	fagocitário (SMF), principalmente macrófagos
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 Doença benigna ou mortal, na forma cutânea deixa cicatrizes grandes (“botão do oriente”), doença conhecida na America do Sul antes da chegada dos espanhóis
 
Leishmaniose: Aspectos históricos e sociais
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Agente etiológico descrito primeiramente por Borovsky em 1898 em um paciente no Usbequistão
 Leishman e Donovan (1903) descreveram o parasita independente- mente em um caso de calazar da Índia
 Ross (quem descreveu o cíclo de vida do plasmódio) batizou o parasita em 1903 Leishmania donovani, e Wright denominou um parasita vindo de uma criança da Armênia (forma cutânea) Leishmania tropica 
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 Em 1909, Lindenberg, Paranhos & Carini demonstraram a presença dos parasitos em lesões de pacientes brasileiros, Gaspar Vianna denominou-os Leishmania braziliensis e detectou em 1912 a ação curativa do tártaro emético
 Em 1987, Lainson e Shaw sugerem um novo subgênero de Leishmania: o subgênero Viannia, que inclui espécies das Americas
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Os principais sintomas da leishmaniose visceral no homem são:
 - febre intermitente com semanas de duração, 
 - fraqueza, 
 - perda de apetite, emagrecimento, anemia, palidez, 
 - aumento do baço e do fígado,comprometimento da medula óssea, problemas respiratórios, diarreia, sangramentos na boca e nos intestinos. 
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Na maioria dos casos, o período de incubação é de 2 a 4 meses, mas pode variar de 10 dias a 24 meses.
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Em casos do aparecimento de alguns dos sintomas acima, deve-se procurar imediatamente a unidade básica de saúde mais próxima de sua residência para o possível diagnóstico da doença e as demais providências necessárias.
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A leishmaniose visceral é uma doença transmitida pelo mosquito-palha ou birigui (Lutzomyia longipalpis) que, ao picar, introduz na circulação do hospedeiro o protozoário leishmania chagasi. 
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Não é contagiosa, nem se transmite diretamente de uma pessoa para outra, nem de um animal para outro, nem dos animais para as pessoas. 
A transmissão do parasita ocorre apenas através da picada do mosquito fêmea infectado.
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Macrófago com amastigotas
Inseto
Polimórfico: 	Promastigota
	 	Paramastigota
	 	Promastigota metacíclico
	 	Amastigota 
 Reprodução por divisão binária
Hospedeiro mamífero
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 Organização celular
 Genoma com 36 chromossomos (L. major, Projeto genoma
 completo), 8305 genes identificados (4/2005) 
- K(C)inetoplasto, trans-splicing
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Ciclo de vida
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Formas promastigotas metacíclicas regurgitadas por mosquitos
são depositadas na dermis, onde são fagocitados por macrófagos
 Vetores (Diptera, Phlebotomidae: Lutzomiya, Phlebotomus), no 
território brasileiro: Lutzomiya longipalpis, L. wellcomei e outros
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Promastigotas dentro do fagolisossomo se transformam em 
amastigotas, que se multiplicam no macrófago. A célula
hospedeira é rompida liberando amastigotas que são fagocitados
por outros macrófagos
M
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Macrófagos infectados com Leishmanias do subgênero 
Viannia (espécies das Américas) contém menos parasitas
em vários vacúolos parasitóforos (ajuda no diagnóstico por microscopia)
M
Subgênero Leishmania Subgênero Viannia
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Macrófagos infectados são ingeridos por Lutzomiya 
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Membrana peritrófica
Após ingestão, amastigotas se transformam em promastigotas
e se multiplicam dentro de uma membrana formada pelo vetor
Trato digestivo
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Promastigotas se desenvolvem para paramastigotas que aderem em pontos diferentes no trato digestivo (critério da localização: subgenênero de Leishmania), a proliferação é estimulada se a fêmea ingere sucos vegetais
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Após 3-5 dias, promastigotas metacíclicos migram ativamente
para partes anteriores do tubo digestivo
Somente promastigotas metacíclicos são infecciosos para os hospedeiro vertebrado!
Assim, o parasita parece interferir ativamente com a 
capacidade de ingestão do hospedeiro mosquito! A 
saliva do flebotomíneo é muito importante para a 
infecciosidade da Leishmania
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Patogenia e interação parasita-hospedeiro
C3b
Após deposição de promastigotas na pele complemento
liga à superfície do parasita mas a clivagem de C3b em iC3b 
não permite ligação do complexo lítico
iC3b
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M
Proteína gp63 cliva o fator do complemento C3b para iC3b. 
Complemento ajuda na aderência das promastigotas
nos macrófagos (receptor principal CR3). Interação de LPGs
e gp63 com fibronectina também ocorre. Esta via de internalização
não leva a produção radicais de oxigênio ou NO (“silent entry”)
Receptor de complemento
CR3
(Mac1)
iC3b
CR1
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Porque uma célula profissional do sistema fagocitário não 
consegue eliminar um parasita dentro do fagossomo?
1. A sinalização para ativação do macrófago está impedido
 por ação de LPG: Tradução de sinais, mobilização de cálcio,
 ativação de Proteina kinase C.
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M
2. Indução de resposta disfuncional: inibição da produção de radicais de OH e NO
Falha na apresentação em MHC2 após estimulação com IFN 
Fosfoglicanos bloqueiam produção de IL-12
?
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3. 
Inativação da 
Fosfotirosinaquinase:
reação atenuada a IFN 
Proteina tirosina quinases também são bloqueados
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A espécie infectante é importante para o fenótipo da
patologia desenvolvida em indivíduos imunocompetentes
A expressão diferencial ou presença/ausência de genes 
provavelmente causa as diferenças nas patologias observadas
(Leishmanias que ocorrem no Brasil)
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Os diferentes tipos de Leishmaniose na clínica 
 Visceral ou Calazar (L. donovani, L. infantum, no Brasil
 causada por L. chagasi ):
 - Enfermidade crônica 
 - Caracterizada por:
 febre irregular e de longa duração
 hepatoesplenomegalia
 linfoadenopatia
 Anemia com leucopenia
 Hipergamaglobulinemia
 Emagrecimento
 Edema
 Caquexia e morte se não for tratado, dentro de 2 anos
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- Formas clínicas calazar: assintomática, oligossintomática, aguda e crônica
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Tegumentaria: 
 
 a) Cutânea: 
	 - Infecção confinada na derme, com epidermis ulcerada
	 - Velho mundo, L. tropica, L. major e L. aethiopica
	 - Novo mundo, leishmanias do complexo mexicana e 				 braziliensis
	 - no Brasil:	 L. braziliensis, L. guyanensis
			 L. chagasi, L. lainsoni
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Leishmaniose cutânea (“oriental sore” “botão do oriente”, “Úlcera de Bauru”
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b) Muco-cutânea:
 - Infecção na derme (ulceras), invasão de mucosa e 		 
 destruição da cartilagem
 - No novo mundo: L. braziliensis, L. guyanensis,
L. 
 mexicana (“espundia”), no Sudão/Etiópia L. major, L. tropica
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c) Cutânea difusa:
 - Infecção confinada na derme, formando nódulos não
 		ulcerados. Disseminação por todo o corpo
	- Associado a deficiência imunológica do paciente
 	- Novo mundo, L. pifanoi, L. amazonensis
	- Velho mundo, L. aethiopica
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Responsável pela patologia é o estado imunológico do hospedeiro
predominância de resposta celular (Th1) leva a imunidade e cura,
resposta humoral (Th2) leva às formas crônicas
I
II
Th1
Th2
IFN, TNF, IL-2
IL 4-6, IL-10, TGF
indução da atividade 
policlonal de células B
MHC
Células T helper
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No modelo L. major e camundongo
Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30
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Quais são os motivos para tanta diversidade da patologia da infecção?
- Na forma cutânea, há uma inflamação ativa. Células dentríticas apresentam antígenos em MHC2 e expressam ICAM-1. Ativação de Th1 por IFN e TNF resulta no recrutamento de células T CD8+ para a região infectada. Cura.
- Na forma mucocutânea, pouco envolvimento ou destruição de células Langerhans, mas há apresentação em MHC2 e células com ICAM1, mas TH1 e Th2 estão ativados. IL10 promove o decréscimo da apresentação de antígenos e de produção de IFN. Pode ter hiperprodução de IL1, TNF e ICAM1, resultado é um estado pró-inflamatório e destruição sucessiva de tecido. 
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- Na forma visceral, não há resposta Th1 e nem aumento de atividade Th2. Fatores parecem ser do próprio macrófago infectado. Possivelmente, lipofosfoglicanos da Leishmania estão envolvidos.
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Diagnóstico:
As Leishmanias são vistas nas formas amastigotas
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 Clínico
 	Caraterísticas da lesão e dados epidemiológicos
 Laboratorial
 - Exame direto de esfregaços corados (Romanowsky, Giemsa ou
 Leishman)
	- Exame histológico
	- Cultura
	- Inóculo em animais
 - PCR (reação em cadeia da polimerase, permite a identificação da
 espécie infectante)
 Importante para exclusão de tuberculose cutânea, hanseníase, 
 	infecções por fungos, úlcera tropical, neoplasmas
Diagnóstico 
Leishmaniose Tegumentaria
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 Imunológicos 
	- Teste de Montenegro (teste da resposta contra formas 	 promastigostas mortas do parasita, resposta celular)
	- Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) (resposta 	 humoral)
	- Hemaglutinação indireta
Diagnóstico 
Leishmaniose Tegumentaria
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Diagnóstico 
Leishmaniose visceral (Calazar)
 Clínico: sintomas
	- Febre baixa recorrente, envolvimento linfohepático, 
	 esplenomegalia, caquexia e dados epidemiológicos
 Laboratorial:
1. Exames Parasitológicos
a) Demonstração direta do parasita 													 	Esfregaços corados com Giemsa ou Leishman de:
	 -	Material obtido por punção de medula óssea, fígado ou baço	 - Biopsia (menos eficiente ~ 50%)		 
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- Fase aguda 80-90% de positividade
- Fase sub-clínica 10%
- Co-infectados com HIV recomendado exame de medula 	 	óssea
- Aspirado esplênico 100 %, sangue periférica 30%
b) Isolamento em cultivo in vitro
		 Aspirado ou biopsia
 LIT, MEM, Schneider’s e Evans (Meio monofásico) a 26ºC
					 Exame microscópico							 ( 2x semana/4 semanas)
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c ) Isolamento em cultivo in vivo
 Inoculação em animais
 - Hamsters ou camundongos isogênicos (BALB/c)
 - Cepas dermatotrópicas: pata ou tocinho dos animais
 (positivo após 2 a 4 semanas)
 - Cepas vicerotrópicas via intraperitoneal (positivo após 6 meses)
 - Recomendado para o isolamento do parasita nas formas sub-	clínicas
 Xenodiagnóstico
 - Flebótomos		
 - Usado em pacientes com AIDS portadores de Leishmaniose visceral
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2. Testes Imunológicos
 a) Teste de Montenegro
	
 b) Testes serológicos
Antígenos (parasitas inteiros, inativados)
- Reação de aglutinação direta
	
	Cave: Reatividade cruzada com Chagas e tuberculose
	Visualiza títulos até de 1:51.200
	Leishmaniose visceral título > 1:1.600 (sensibilidade 		100%) no Brasil o título > 1:6.400
 c) Detecção do antigeno rK39 na urina
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3. Análise do DNA de material recolhido	
a) Por reação em cadeia da polimerase (PCR)
 Usa oligonucleotídeos espécie-específicos do DNA dos 		 minicírculos do DNA do cinetoplasto
	100% sensível e mais específico que sorologia
 
b) Possibilita discriminação de espécies
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Tratamento Leishmaniose Tegumentaria
1. Quimioterapia
 Antimoniais
 Tártaro emético
 antimonial trivalente
 Glucantime (antimoniato de N-metil-glucamina)
 antimonial pentavalente
 Pentostan (estibogluconato de sodio)	
 - antimonial pentavalente
 - inibe glicolise e síntese 				 
 - administração intramuscular ou
 intravenosa absorção rápida 
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- Excreção rápida e pela urina, vida media 24 horas
- Droga recomendada para os três tipos de leishmaniose
Glucose
 
Glucose 6-phosphate 
Pentose
 Phosphate Pathway
 Fructose 6-phosphate
 
 Fructose 1,6-bisphosphate
 
Glyceraldehyde 3-phosphate
 
 1,3-Diphosphoglycerate
 3-Phosphoglycerate
 2- Phosphoglycerate
 
 Phophoenolpyruvate
 
 
 
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PK 
 Antimoniais
 
 Pyruvate
Acetyl- CoA
Krebs
 Cycle
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 Pentamidina
 
 - liga ao DNA, inibindo a replicação
 - Inibe a dihidrofolate reductase, interfere 		 
 com o metabolismo de poliaminas
 - Administração intramuscular
 - Excretado lentamente, é seqüestrado nos 		
 tecidos (tem uso profilático contra tripanossomiase)
 - Produz hipo- ou hiperglicemia
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Anfotericina B
 - lipofílico
 
 
- Liga a esterois (ergosterol) da membrana 		formando poros. Funciona como um ionóforo
- 2-5% excretado na urina 
- 90% ligado a proteínas do plasma
- Meia vida 18 horas
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Continuação tratamento Leishmaniose Tegumentaria
2. Imunoterapia
	Leishvacin seriado
	Leishvacin associado ao BCG
	Leishvacin seriado associado ao BCG	
	Leishvacin associado ao BCG com Glucantime 
 	Interferon gamma humano recombinante (Rhifn-g)
	anti-IL10-receptor
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Tratamento Leishmaniose visceral
1. Quimioterapia
 Antimoniais
 Tártaro emético
 Glucantime
 Pentamidina
 Anfotericina B
 Miltefosin
2. Imunoterapia
 Interferon gamma recombinante (Rhifn-g) 
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Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30
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Medidas de prevenção
 Identificação de focos de Leishmania (animais 
 infectados em proximidade a domicílios: 
 silvestres e domésticos: erradicação
 
 Imunização em massa de cachorros (Leishvaccin)
 Vacinas para seres humanos?
 Componentes da saliva de Phlebotomíneos como vacina?
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Ecologia dos Phlebotomíneos: 
 Desenvolvimento e comportamento
 40-70 ovos por desova, agrupados em lugares humidos, eclodem depois 6-17 dias
 Larvas se nutrem de matéria orgânica por mais 15-70 dias, depois pupa (7-14 dias)
 Adultos são ativos no crepúsculo ou a noite, durante o dia permanecem em lugares tranquilos: tocas, arvores ocas, currais, moradias
 Não sobrevivem bem em ambientes que não tenham pelo menos um mes T acima de 20°C
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fêmea macho
“Mosquito palha”
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Uso de repelentes, telas de proteção
Borrifação frequente de ambientes
Tratamento de sintomáticos e assintomáticos em regiões com alta incidência de flebotomíneos
Tratamento/exterminação de animais domesticos infectados
Medidas de prevenção
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Dentistas:
Atenção na hora do tratamento de pacientes em área endêmica: eventuais lesões na boca
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Med. oral patol. oral cir.bucal (Internet) v.12 n.4  Madrid ago. 2007
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Literatura:
L. Rey: Parasitologia
Markell´s
& Voge´s Medical Parasitology
Links interessantes:
http://www.hhmi.ucla.edu/parasite_course/Default.htm 
http://www.genedb.org/genedb/leish/index.jsp 
http://www.leishmaniasis.info/ 
Br Med Bull. 2006 Jul 17;75-76:115-30
Uma revisão muito interessante:
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1. Cita uma espécie de cada Leishmania causadora para leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral, que ocorre no Brasil.
2. Associe as formas amastigota, paramastigota e promastigota metacíclico de Leishmania aos seus habitats (célula/tecido) de ocorrência.
3. No humano, em qual tipo de célula ocorre a proliferação de Leishmania?
4. Explique as diferenças morfológicas entre o processos da infecção do humano por Anopheles/Plasmodium e Flebotomíneo/Leishmania
5. O que é necessário para se infectar acidentalmente no tratamento odontológico de um portador de Leishmania braziliensis com lesão nos lábios?