Aula2. Estrutura e Replicação do DNA

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Estrutura e 
Replicação do 
Material Genético 
Profa. Luciana Resende 
luresende@gmail.com 
 Compreender como o genoma está organizado e como é 
 Cada célula tem sua cópia do genoma (≈25.000 genes) 
 O nº e a morfologia dos cromossomos varia entre sp. (cariótipo) 
Gene 1 
ESTRUTURA DO DNA 
 Células Somáticas (2n) X Germinativas (gametas - n) 
 N° Cromossomos: 46 x 23 
Cromossomos homólogos 
 
 22 pare de autossomos e 1 par de sexuais (XX;XY) 
ESTRUTURA DO DNA 
 Genes estão arranjados linearmente → homólogos carregam 
informações equivalentes (não iguais!!!!) 
 
 
 
 
 
 
 Homólogos (mesmos locus; mas podem ter diferentes alelos) 
Alelo “A” 
Alelo “B” 
Alelo “a” 
Alelo “b” 
Gene 1 Gene 1 
ESTRUTURA DO DNA 
Gene 1 
 Genoma armazenado em Cromatina = DNA + proteínas 
 O DNA no microscópio (?) 
ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMOS 
 Cada um dos 46 cromossomos humanos contém uma única 
molécula de dupla hélice de DNA! (50 a 250 MM pb) 
Gene 1 
 Genoma armazenado em Cromatina = DNA + proteínas 
 O DNA no microscópio (?) 
ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMOS 
Só é possível separar os cromossomos 
nas células em divisão!! 
 Cromossomo= cromatina condensada durante a divisão 
Como a cromatina é condensada? 
 Proteínas= Histonas (5 tipos: H2A, H2B, H3, H4 e H1) 
 Pares de H2A + H2B + H3 + H4 = octâmero 
  Duas voltas de DNA 
 140 pb 
 
 
 
 
 Octâmero histonas + DNA 
nucleossomo 
ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMOS 
Solenóides 
 Intérfase: Solenóides são a estrutura fundamental (alças) 
 
ORGANIZAÇÃO DOS CROMOSSOMOS 
Histórico 
 O modelo de dupla hélice proposto do Watson e Crick em 1953 foi 
revolucionário e abriu caminho para a compreensão molecular dos 
genes e da hereditariedade 
 O que se sabia sobre os genes e o DNA até essa data? 
 Genes (“fatores hereditários”) descritos por Mendel: 
associados a características específicas, alterados por 
mutações 
 Acreditava-se na teoria “um gene-uma proteína” 
 Uma série de experimentos que iniciaram nos anos 1920 
revelaram que o DNA era o material genético 
 Como a estrutura foi proposta? 
ESTRUTURA DO DNA 
 Na verdade, Watson e Crick reuniram várias 
informações já existentes e modelaram a 
estrutura da molécula de DNA. 
 A replicação deve ser fiel → todas as células do organismo 
apresentam a mesma constituição genética 
 Deve haver algum código, informação capaz de determinar a 
grande variedade de proteínas 
 Embora estável, deve ser capaz de ser modificado em alguns 
casos, pois a seleção atua sobre a variação 
 
 3 propriedades principais do DNA eram conhecidas 
ESTRUTURA DO DNA 
 
 Informações pré-existentes 
 Composição do nucleotídeo → desoxirribose (açúcar 5C) + 
base nitrogenada + grupo fosfato 
ESTRUTURA DO DNA 
 
 Informações pré-existentes 
 
 
 
 
 
 
 Regras de Chargaff da composição de bases 
- quantidade total de purinas é igual à de pirimidinas 
- quantidade de T=A e de C=G 
- A+T ≠ G+C 
- proporção entre bases muda entre organismos mas é 
constante em células diferentes do indivíduo 
ESTRUTURA DO DNA 
 Análise da difração de raios X do 
DNA → sugerem que o DNA é fino e 
longo, com 2 partes similares e 
paralelas formando uma molécula 
helicoidal 
ESTRUTURA DO DNA 
 
Slide retirado de: http://www.ufrgs.br/labvir/material/aulat27.pdf 
 2 fitas complementares 
antiparalelas torcidas na 
forma de uma dupla hélice 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Pontes de Hidrogênio 
entre pirimidinas e purinas 
 Complementação dos 
dois filamentos = 
dedução das bases 
 Modelo sugere um 
mecanismo de 
replicação 
ESTRUTURA DO DNA 
Ligação 
Fosfodiester 
 Ligação entre os 
nucleotídeos = 
Fosfodiéster 
(observar 5´ e 3´) 
ESTRUTURA DO DNA 
 
Replicação do 
Material Genético 
REPLICAÇÃO 
 
A replicação é o processo no qual a célula 
sintetiza uma nova cópia do seu material 
genético 
 Quando ocorre? 
 Logo antes da divisão celular 
 Embora o modelo dupla hélice sugira uma 
forma de replicação, outros modelos 
também eram possíveis e deveriam ser 
testados 
 
Replicação Semiconservativa: 
Cada uma das duas dupla-
hélices sintetizadas possuiria 
um filamento parental e um 
filamento novo 
REPLICAÇÃO 
Replicação Conservativa: 
Uma nova dupla-hélice seria 
sintetizada, fazendo com que 
co-existissem por certo 
momento a dupla-hélice 
parental e a dupla-hélice nova 
 Replicação Dispersiva: 
Cada uma das duas novas fitas 
produzidas conteria tanto 
parte da molécula parental 
quanto parte da molécula 
recém-sintetizada 
REPLICAÇÃO 
1958: Experimento de Meselson-Stahl 
 Moléculas de DNA que possuíam 
nucleotídeos de uma maior densidade 
foram colocadas para serem replicadas 
em um ambiente com nucleotídeos de 
menor densidade 
 Moléculas com maior densidade 
podem ser separadas das de menor 
densidade por centrifugação em 
gradiente de cloreto de césio 
N15 
N14 N14 N14 
N14 
N14 N
14 N14 
Mas como descobrir qual modelo estava correto? 
REPLICAÇÃO 
1958: Experimento de Meselson-Stahl 
 Resultados esperados para cada modelo 
REPLICAÇÃO 
1958: Experimento de Meselson-Stahl 
 Resultados esperados para cada modelo densidade 
REPLICAÇÃO 
1958: Experimento de Meselson-Stahl 
 Resultados esperados para cada modelo densidade 
REPLICAÇÃO 
RESULTADO 
OBTIDO! 
Fita 
molde 
Fita nova 
Por este experimento comprovou-se que a replicação do DNA é 
semiconservativa 
REPLICAÇÃO 
Fita 
molde 
Fita nova 
Mas faltava ainda comprovar uma outra previsão do modelo de 
Watson e Crick: a Forquilha ou Zíper de replicação 
Forquilha 
REPLICAÇÃO 
 Em 1963, John Cairns comprovou essa previsão 
 John colocou bactérias para replicar em um ambiente com 
nucleotídeo (timina) radioativo e expôs as moléculas de DNA 
em um filme fotográfico 
 1 rodada de replicação 
Autoradiografia Interpretação 
REPLICAÇÃO 
Forquilhas de Replicação 
Interpretação Autoradiografia 
 2 rodadas de replicação 
DNA Polimerases 
 Mas como os nucleotídeos que estão “soltos” no citoplasma são 
unidos para formar a nova fita? 
 Em 1959, Arthur Kornberg isolou a enzima DNA polimerase I 
 Adição de desoxirribonucleotídeos ao 
carbono 3’ de outro, de acordo com a 
correspondência da fita molde 
 A polimerase que mais contribui para a 
síntese da nova fita de DNA é a DNA 
polimerase III 
dCTP 
dATP, dGTP, dTTP 
REPLICAÇÃO 
 A DNA pol. 
acrescenta dNTP, 
liberando fosfatos 
para obter a energia 
necessária 
desoxirribonucleotídeo 
Fita nova Fita molde 
REPLICAÇÃO 
DNA Polimerases 
 VIDEO 1 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
 A DNA pol III atua na forquilha de replicação 
 A medida que a enzima adiciona nucleotídeos de acordo com a 
fita molde, a dupla hélice vai se desenrolando, expondo outros 
trechos das fitas para servirem como molde 
 Mas a DNA pol. III só adiciona 
nucleotídeos ao carbono 3’ (5’→3’)! 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
Em uma das fitas molde a síntese da fita nova ocorre continuamente, 
crescendo na ponta 3´ 
Na outra fita molde isso não é possível, pois não há como crescer na 
ponta 5´! 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamentorecém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
? 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
3’ 
5’ 
5’ 
3’ 
5’ 
3’ 
Filamentos molde 
Filamento recém 
sintetizado 
Forquilha de 
replicação 
5’ 
3’ 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
Como a DNA pol. III sintetiza a nova fita no molde contrário? 
 O crescimento da fita nova, na replicação descontínua, ocorre em 
fragmentos 
 À medida que a forquilha de replicação se move, há o início da 
síntese de um novo fragmento na fita DESCONTÍNUA 
 Fragmentos de Okasaki 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
Mas a DNA pol. só adiciona nucleotídeos, não inicia uma cadeia 
de nucleotídeos! 
 Para a DNA pol. adicionar um nucleotídeo é preciso que antes 
exista ao menos alguns nucleotídeos já colocados 
 A síntese das fitas novas só se inicia se antes houver um “primer” 
já presente. 
 Primer: pequeno n° de nucleotídeos já unidos e colocados junto à 
fita molde. 
Primer do fragmento 
de Okasaki 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
Mas como surgem esses “primers”? 
 A enzima primase (RNA polimerase) sintetiza um trecho curto (de 
8 a 12 ribonucleotídeos), complementar à fita molde. 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
 A DNA pol. I remove os primers de RNA e preenche o espaço com DNA 
 A DNA ligase é a enzima que liga o DNA produzido pela DNA pol. I 
ao fragmento de Okasaki 
 
Mas esses “primers” de RNA ficam adicionados ao DNA novo? 
Primer de RNA 
removido pela 
DNA pol. I 
Ligação feita 
pela DNA ligase 
O REPLISSOMO 
 Além de todas essas enzimas, há outros componentes importantes! 
O replissomo é uma “máquina molecular”, um complexo de proteínas 
que estão envolvidas na replicação do DNA 
 Fazem parte também do Replissomo: 
 Helicase: Rompem as pontes de hidrogênio da dupla-hélice 
abrindo-a 
 Topoisomerase (Girase) : Mantém a estabilidade do DNA 
enquanto a helicase vai abrindo-o 
 O replissomo é capaz de unir 1000 nucleotídeos por segundo usando 
uma fita molde! 
O REPLISSOMO 
Proteína de ligação 
unifilamentar 
 VIDEO 2 
ESQUEMA GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA 
 Freqüência de erro : 1 a cada 10 bilhões de nucleotídeos inseridos!! 
 Tanto a DNA pol I quanto a DNA pol III são enzimas de alta 
precisão e possuem função de revisão 
 removem as bases erroneamente adicionadas 
 O padrão de metilação da fita molde permite identificar qual é a 
base correta 
 
 
A precisão da replicação 
O REPLISSOMO EUCARIÓTICO 
 Maior complexidade do DNA (cromatina, nucleossomos, etc.) 
 Procariotos: 13 componentes do replissomo 
 Eucariotos: 27 componentes do replissomo 
 Não é preciso apenas sintetizar novas fitas de DNA, mas 
também desmontar todo o complexo de nucleossomos e 
remontá-lo depois 
O REPLISSOMO EUCARIÓTICO 
Histonas 
DNA sendo 
replicado 
Montagem do 
nucleossomo 
INÍCIO DA REPLICAÇÃO 
Origens procarióticas da replicação 
 O início da replicação no DNA circular 
bacteriano ocorre em uma posição 
específica. 
Duas helicases são recrutadas para se ligar 
ao DNA, uma em cada ponta, e começam a 
separar a dupla-hélice nas forquilhas dos 
dois sentidos. 
INÍCIO DA REPLICAÇÃO 
Origens eucarióticas da replicação 
 O início da replicação no DNA de 
eucariotos ocorre em vários locais de cada 
um dos cromossomos, em posições ricas 
em AT. 
Há cerca de 400 origens de replicação nos 
16 cromossomos de leveduras e milhares 
espalhadas nos 23 cromossomos humanos 
 
INÍCIO DA REPLICAÇÃO 
EXEMPLO DE PATOLOGIA 
 Síndrome de Bloom 
 Patologia autossômica recessiva rara, 
vinculada a problemas na replicação do 
DNA 
 Alterações no gene da enzima helicase, 
no cromossomo 15 (a replicação normal 
é interrompida, levando a quebras 
cromossomicas e várias mutações) 
 Os indivíduos são de baixa estatura, 
cabeça pequena e estreitada, com alta 
pré-disposição a vários tipos de câncer