Bioquimica aplicada aula 5 pectinases (1)

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PECTINASES
Enzimas capazes de reconhecer as ligações glicosídicas α-1,4 entre as unidades de ácido galacturônico e seus derivados metoxilados;
Produzidas por vegetais e microrganismos;
Substrato: polissacarídeos constituintes da lamela média e da parede primária de células vegetais.
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Substâncias Pécticas
Carboidratos poliméricos componentes da perede celular e da lamela média de vegetais.
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Pectina: ácidos galacturônicos e seus derivados metoxilados (>50% esterificação), ligados entre si por ligações α-1,4 – formam géis em meio ácido e na presença de açúcar
Ácido pectínico: pectinas com baixo teor de metilação (<50%) – resistentes à precipitação com Ca, aplicadas na confecção de geléias com baixo teor de açúcar
Ácido péctico: contém ácidos galacturônicos, contendo quantidades negligenciáveis de metoxilas – precipitam com Ca
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ENZIMAS DESMETOXILANTES
Pectinaesterases ou pectina-metil-esterases
Hidrolases que atacam a ligação éster desmetoxilando ácidos galacturônicos esterificados com metanol
Produtos: pectinas com baixo teor de metoxilação ou ácido péctico + metanol
Consequências:
	↑ suceptibilidade do polissacarídeos ao ataque de enzimas despolimerizantes;
	 ↑ suceptibilidade do polissacarídeo à precipitação na presença de Ca+2 – ácido péctico
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ENZIMAS DESPOLIMERIZANTES
Hidrolisam ligações glicosídicas α-1,4 entre as unidades constituintes das substâncias pécticas.
Poligalacturonases e pectatoliases: 
	atacam preferencialmente ligações entre ácidos galacturônicos (↓ teor metoxilação).
Pectinaliases: 
	atacam ácidos galacturônicos metoxilados, ativadas na presença de Ca+2.
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Poligalacturonases
Pectato liase
Pectina esterase
Polimetilgalacturonases
Polimetilgalacturonato liase
(pectina liase)
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A hidrólise de pectinas altamente metoxiladas pode ser facilmente alcançada pela ação combinada de pectinaesterases e poligalacturonases ou pectinaliases.
Pectinases comerciais:
Contêm variedade de enzimas fúngicas
Pectinaesterase
Poligalacturonase
Pectinaliase
Aspergillus sp
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CELULASES
Enzimas hidrolíticas capazes de romper as ligações glicosídicas β-1,4 entre unidades de glicose.
Substrato: celulose, polímero presente nas paredes celulares dos vegetais.
São produzidas apenas por microrganismos: bactérias do trato gastrintestinal de ruminantes; fungos filamentosos do solo (Aspergillus niger, Penicillium oxalium, Trichoderma viridae)
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Estrutura da celulose: polímero de -D-glicose 
10.000 a 15.000 D-glicose
cadeias lineares alinhadas lado a lado e estabilizadas
por ligacões de H
intra- e intercadeias
Fungos e bactérias possuem celulase: hidrolisam lig. 14 
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Tipos de celulases
ENDO-1,4- β -GLICANASES (EC 3.2.1.4) – CELULASE:
	
	Rompem a celulose desordenadamente, no meio da molécula liberando oligossacarídeos β-1,4
 EXO-1,4- β-GLICANASES (EC 3.2.1.91) – CELOBIO-HIDROLASE:
Rompem a celulose a partir da extremidade liberando glicose e celobiose (dissacarídeo de glicose β1,4)
 GLICOHIDROLASES (EC 3.2.1.74):
Rompem unidades de glicose da extremidade de polímeros de celulose e oligômeros
 CELOBIASE (EC 3.2.1.21):
Rompem A CELOBIOSE, LIBERANDO GLICOSES. Atuam também como exo enzimas sobre oligossacarídeos beta-1,4.
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APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS PECTINASES E CELULASES
Enzimas endógenas:
Pectinaesterase:
	Separação de fases em sucos de frutas cítricas:
	↑ atividade pectinaesterase
	↓ atividade enzimas despolimerizantes
	A desesterificação da pectina forma ácido péctico que precipita na presença de Ca+2
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA: adição de pectinaliases ou poligalacturonases.
 Convertem o ácido péctico em oligômeros não sensíveis ao Ca+2.
 Ocorre diminuição da viscosidade do suco.
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APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS PECTINASES E CELULASES
Pectinaesterase e poligalacturonase:
	Tomate: alto teor de enzimas pectinolíticas – causa rápido amolecimento pós-colheita
TOMATE LONGA-VIDA: variedade geneticamente modificada, para menor produção de enzimas (poligalacturonase e pectinesterase) e de etileno
 Maior “tempo de prateleira”.
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PRODUTOS DO TOMATE:
Pastas viscosas (ketchup, sopas e molhos): Processo Hot break (90o C) - inativação térmica das pectinases imediatamente após o despolpamento.
Sucos poucos viscosos: Processo Cold Break (40o C) – processo de depende de um período de repouso após o despolpamento, garantindo atividade das enzimas nativas. 
Após concentrar os sucos são utilizados como corantes e flavorizantes.
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APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS PECTINASES E CELULASES
Enzimas exógenas:
Clarificação de sucos e frutas:
	Sucos após a extração: turvação e alta viscosidade
Pectina em suspensão devido à repulsão eletrostática
proteína
pectina
+ +
+ +
+ +
+ + 
+ + 
+ + 
_ _ _
-
-
-
-
-
-
-
Ação de enzimas pectinolíticas
Exposição das superfícies de cargas opostas
Aglomeração por atração eletrostática
SUCO TURVO: PARTÍCULAS EM SUSPENSÃO
↓ viscosidade
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APLICAÇÃO INDUSTRIAL DAS PECTINASES E CELULASES
Enzimas exógenas:
Extração de sucos:
	Separação da parte líquida da polpa.
	Uso de pectinases facilita o processo – facilita o rompimento das paredes e aumenta o rendimento da extração por prensagem.
Liquefação :
	
	Processo de transformação da polpa em suco que independe da prensagem.
	Solubilização das partes insolúveis da polpa, transformando-a em parte integrante do suco.
Aumenta o teor de sólidos no suco;
Não há produção de resíduos;
Produção de sucos de frutas que não se adaptam ao processo de prensagem: banana, goiaba, manga etc.
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Ou β-galactosidases são enzimas que reconhecem e hidrolisam ligações glicosídicas do tipo β que envolvem galactoses e arabinoses;
Principal substrato: lactose
LACTASES (EC 3.2.1.23)
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Lactose
 Carboidrato dominante no leite – 5% leite bovino, 7% leite humano
 Açúcar pouco solúvel – cristaliza em concentrações superiores a 18% - sensação de arenosidade indesejável
 Apresenta poder de dulçor menor que a sacarose (16%)
 Altamente higroscópica – pode causar empedramento em produtos lácteos em pó
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Fontes e principais características das lactases
Produzidas pelo intestino de mamíferos – alta concentração após o nascimento;
Os adultos normalmente perdem a capacidade de hidrolisar a lactose devido a uma diminuição drástica da produção de enzimas;
Acúmulo de lactose não digerida: multiplicação de microrganismos – gases e diarréia
Pequena fração de crianças nascem com intolerância à lactose
	
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Fontes e principais características das lactases
Vegetais produtores: pêssego, damasco, café e amêndoa – não são comercializadas para uso industrial
Origem microbiana: Aspergillus niger, A. oryzae, Candida pseudotropicalis e Kluvermyces lactis.
Enzimas de origem fúngica: pH 2,5 a 4,5 e tpt 50o C– hidrólise da lactose do soro
Enzimas de leveduras: pH 6,0 a 7,0 e tpt 30-40o C– hidrólise da lactose do leite
	
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Aplicações industriais das lactases
Ingestão ou aplicação doméstica: cápsulas de lactase (ingestão das cápsulas ou adicionar ao leite ou produto lácteo antes da ingestão)
Leites com baixo teor de lactose 
 – para intolerantes à lactose
 - leite tipo UHT
 - lactase comercial de Kluyvermyces lactis
- Aumenta a doçura do leite (glicose + galactose é cerca de 4 a 5 vezes mais doce que a lactose)
	
PRODUTOS PARA INTOLERANTES À LACTOSE
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Aplicações industriais das lactases
Leite congelado: 
hidrólise da lactose diminui desestabilização do leite pois não forma cristais de lactose que rompem o glóbulo de gordura.
Doce de leite, leite condensado e sorvete 
Diminuição da arenosidade causada pela lactose
 	
PRÉ-TRATAMENTO DO LEITE PARA OBTENÇÃO DE DIVERSOS PRODUTOS
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Aplicações industriais das lactases
Iogurte: 
hidrólise da lactose aumenta a doçura do produto final sem aumentar valor calórico.
Redução tempo fermentação
Melhoria da textura
Redução
dessora
Queijo 
Queijo Cheddar- redução tempo de produção e maturação
 	
PRÉ-TRATAMENTO DO LEITE PARA OBTENÇÃO DE DIVERSOS PRODUTOS
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Aplicações industriais das lactases
Ação transferase: podem ligar uma unidade de galactose a outra unidade de galactose livre ou da lactose por ligação β-1,6.
PRODUÇÃO DE GALACTOLIGOSSACARÍDEOS
PRÉ-BIÓTICOS
Japão e Europa: principais ingredientes pré-bióticos utilizados: 15.000 ton/ano
LACTOTRIOSE
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Oligossacarídeos bifidogênicos
Compostos que não são digeridos no trato digestório humano, capazes de atingir o cólon sem alterações.
Favorecem o crescimento de populações microbianas benéficas (Bifidobacterium) em detrimento de bactérias putretativas (Enterobacteriaceae)
	
PRÉ-BIOTÍCOS
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INVERTASES (β-frutofuranosidases, EC 3.2.1.26)
Hidrólise da sacarose em glicose + frutose.
Hidrólise da sacarose leva à inversão da rotação óptica específica do meio reacional quando observado em polarímetro.
Produto: xarope de glicose+frutose – açúcar invertido
	
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Açúcar invertido
Apresenta maior poder edulcorante (devido à presença de frutose)
Maior possibilidade de concentração – os monossacarídeos são mais solúveis do que o dissacarídeo original
Ponto de ebulição mais alto e ponto de congelamento mais baixo – maior pressão osmótica
A hidrólise é facilmente alcançada pelo uso de resinas catalíticas (hidrólise ácida) – hidrólise enzimática é pouco utilizada
	
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SUBSTRATO
Sacarose 
Dissacarídeo não-redutor formado por glicose e frutose ligadas β-1,2.
É o principal açúcar comercializado no mundo
Fontes: beterraba e cana-de açúcar
É considerada o padrão de doçura na indústria de alimentos
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Fontes e principais características das invertases
Amplamente distribuídas na natureza – vegetais, microrganismos e animais.
Industrialmente as mais importantes – Saccharomyces sp e Kluyveromyces sp – leveduras
Fungos filamentosos: Aspergillus sp
Fontes vegetais: aspargos, beterraba, chicória
	
Além da atividade hidrolítica podem apresentar atividade de transferases – removem uma unidade de frutose do substrato e ligam a diferentes aceptores em diferentes posições.
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Aplicação industrial das invertases
Uso de invertases na obtenção de açúcar comercial não é muito difundido – hidrólise ácida com resinas catalíticas, já que a sacarose utilizada é bastante pura.
Principal aplicação: atividade de transferase - obtenção de oligossacaríderos bifidogênicos
	
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Oligossacarídeos bifidogênicos
Lactossacarose: tranferência de uma frutose para o aceptor lactose (frutose se liga à glicose da lactose por ligação β-1,2).
Frutoligossacarídeos:
 Produzidos por empresas européias e japonesas – 12.000 ton/ano
	
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Frutoligossacarídeos: transfrutosilação por invertases
Unidades de sacarose ligadas por ligações β-1,2 a 1, 2 ou 3 unidades de frutose
1-questose
1-nistose
1-frutofuranosilnistose
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Frutoligossacarídeos: transfrutosilação por invertases
Comercializadas no japão com o nome de “Neosugar” e “Meioligo” – marca registrada
Invertase de Aspergillus niger – pH 5,0, tpt= 40o C por 72 horas
	
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