Apostila De Citologia - UFPE - Isaíras.

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Plano 
DE 
TRABALHO 
 
 
 
Biologia Celular 
 
 
 
Paulo Antônio Padovan 
Isairas Pereira Padovan 
 
Apoio – Paulo Henrique Padovan 
 
Recife – 2016
 
 
APRESENTAÇÃO 
O Plano de Trabalho foi elaborado pelos Professores Isairas e Paulo Padovan, 
do Depto. de Histologia e Embriologia do Centro de Biociências, que ministram a 
disciplina Biologia Celular / Citologia, sendo destinado aos estudantes dos vários 
Cursos da Área III e do CB – 1os. períodos. 
Este Plano tem por objetivo principal, auxiliar o estudante da Área III e do 
CCB no estudo da Citologia e/ou Biologia Celular. É composto seqüencialmente, 
das seguintes partes: 
 
1. Informações sobre a disciplina Citologia/Biologia Celular (Professores respon-
sáveis, Ementa da disciplina, Conteúdo Programático e Referências bibliográ-
ficas); 
2. Índice (discriminando cada tópico teórico e prático a ser ministrado); 
3. Objetivos comportamentais teóricos para cada tópico da disciplina, 03 textos 
complementares e 02 painéis; 
4. Texto para uso nas aulas práticas “Manuseio do Microscópio Óptico”; 
5. Objetivos comportamentais práticos para cada tópico da disciplina. Esquemas 
de células 
 
Magistério da disciplina 
Cada tópico teórico será apresentado na forma convencional, utilizando-se 
sistema multimídia, projeção de transparências, slides, gráficos, fotos e eletro-
micrografias e uso do quadro em fórmica. 
Para cada aula teórica haverá uma aula Prática correspondente a ser minis-
trada nos laboratórios de microscopia óptica (CCB), onde 4 a 5 preparações his-
tológicas serão analisadas. Nessas aulas, contaremos com o auxílio dos Monitores 
da disciplina. No final de cada aula prática serão recolhidos os desenhos referen-
tes às preparações estudadas. 
A Editora Universitária disponibiliza, aos alunos do CCB/UFPE, o Atlas de 
Morfologia Microscópica, elaborado pelos Profs. Paulo A. Padovan, Isairas P. Pa-
dovan e Luciana A. Tavares. Recomendamos a todos os estudantes que ad-
quiram o referido Atlas, o qual será utilizado, semanalmente, em todas 
as atividades práticas. 
Cada aluno poderá rever os conteúdos práticos, pelo menos uma vez por se-
mana, em comum acordo com os monitores da disciplina (elaborar uma escala 
Curso/Turma) ou mesmo acessando a Homepage da disciplina 
(www.ufpe.br/citologia). 
Os conteúdos teóricos poderão ser revisados através de consulta direta aos 
docentes e monitores da disciplina, bem como, consultando o Ambiente Virtual 
de Estudos – 
 
É aconselhável ao ALUNO estudar e revisar semanalmente, todas as fo-
tomicrografias e elétron micrografias, bem como, realizar os testes 
propostos, para cada tópico da disciplina.
 
3 
Biologia Celular 
(Citologia) 
 
Professores Responsáveis 
Paulo Antônio Padovan 
Isairas Pereira Padovan 
 
Apoio 
Paulo Henrique Padovan 
 
Ementa 
Estudo da célula eucariótica animal sob o ponto de vista morfológico e funcio-
nal. Introdução teórica e prática das principais técnicas citoquímicas aplicadas à 
morfologia. 
Utilização da Informática no estudo da Citologia. 
 
Conteúdo Programático 
1. Microscopias 
2. Métodos de estudo em Biologia Celular 
2.1. Métodos gerais de estudos 
2.2. Métodos especiais de estudos 
3. Membrana plasmática 
3.1. Estrutura 
3.2. Junções celulares1 
4. Citoesqueleto I e II 
5. Secreção Celular I e II 
6. Bioenergética e Inclusões Citoplasmáticas 
7. Núcleo Interfásico 
8. Divisão Celular 
8.1. Mitose 
8.2. Meiose 
 
Referências Bibliográficas 
1. Alberts, B. et al. Fundamentos da Biologia Celular, 3a. ed., Artmed Ed-
itora, Porto Alegre – RS, 844 p., 2011. 
 
2. Carvalho, H.F. & Recco-Pimentel, S.M. A Célula, 3ª. ed., Ed. Manole Ltda., 
Barueri/SP, 423 p.; 2013. 
 
3. De Robertis, E.M.F. & Hib, J. De Robertis - Biologia Celular e Molecular, 
16ª. ed., Ed. Guanabara Koogan – RJ, 363 p., 2014. 
 
4. Kierszenbaum, A.L. Histologia e Biologia Celular – uma introdução à 
Patologia, 2ª. ed., Ed. Elsevier, 677p., 2008 
 
1 Trabalho a ser realizado em equipe. 
 
4 
 
Índice 
 
Atividades Teóricas 
Microscopias 05 
Microscópio Óptico – texto 06 – 13 
Métodos de Estudo em Biologia Celular: Métodos Gerais 14 
Processamento de Material Biológico (Microscopia Óptica e Ele-
trônica de Transmissão) – texto 
15 – 35 
Métodos de Estudo em Biologia Celular: métodos especiais 36 
Membrana Plasmática: estrutura 37 
Junções Celulares 37 
Citoesqueleto I e II 38 - 39 
Secreção Celular I e II 40 - 41 
Bioenergética e Inclusões citoplasmáticas 42 
Núcleo Interfásico 43 
Divisão Celular: Mitose e Meiose 44 
 
Atividades Práticas 
Manuseio do Microscópio Óptico 45 - 47 
Importância do Desenho na Citologia 48 
Métodos Gerais de Estudos / Estudo das técnicas de coletas de 
materiais 
49 
Citoquímica 50 – 53 
Morfologia Celular 54 
Citoesqueleto 55 – 59 
Sistema de Endomembranas 60 – 65 
Bioenergética e Inclusões citoplasmáticas 66 – 69 
Núcleo Interfásico: morfologia e constituintes 70 – 72 
Divisão Celular: Mitose 73 – 75 
Apêndice – Esquemas Ulta-Estruturais de Células 
 
Média Final (MF) = (∑ T + P + S) / 5 
 
 
T1, T2 = avaliações teóricas 
T3 = atividades práticas e trabalhos 
P1, P2 = avaliações práticas (MO + ME) 
 
5 
Microscopias 
Objetivos 
01. Conceituar microscópio óptico (MO) 
02. Citar os componentes da parte mecânica do MO e suas funções. 
03. Citar os componentes da parte óptica do MO e suas funções. 
04. Identificar e dizer o significado de cada inscrição do corpo metálico das ob-
jetivas e das oculares. 
05. Definir limite de resolução e poder de resolução do MO. 
06. Definir abertura numérica. 
07. Conceituar distância de trabalho (WD). 
08. Descrever o princípio básico da microscopia de Fluorescência. 
09. Descrever o princípio básico da microscopia Confocal a laser. 
10. Citar outros tipos de microscopia de luz. 
11. Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de transmissão e sua 
importância para o estudo ultra-estrutural das organelas celulares. 
12. Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de varredura. 
 
 
Principais diferenças entre o MO e o MET - Sumário 
 
Parâmetros Microscópio Óptico Microscópio Eletrônico 
Iluminação Feixe de luz Feixe de elétrons 
Aumento objetivas Variáveis Fixas 
Formação de Imagens Absorção de luz Dispersão de elétrons 
Comprimento de onda 
Luz visível = 550 nm 
Ultravioleta = 200 nm 
Aceleração 20Kv=0,08 
 100Kv=0,04 
Resolução 
Luz visível = 200 nm 
Ultravioleta = 100 nm 
Ponto-a-ponto = 0,3 nm 
 Latice = 0,14 nm 
Poder de Aumento 1000 a 1500 X 
MET = 800.000 X 
MEV = 100.000 X 
MEAV = 1.000.000 X 
Meio de Trabalho Água, óleo, etc Vácuo 
Tipos de Lentes Vidro, Quartzo Eletromagnéticas 
 
 
6 
Microscópio Óptico 
A invenção do microscópio óptico (MO) causou uma verdadeira revolução no 
pensamento humano, colocando ao alcance do homem um universo até então 
desconhecido e inacessível. Hoje em dia, o MO tornou-se indispensável em pra-
ticamente todas as atividades científicas e industriais; nos laboratórios em geral, 
na medicina, na pesquisa, nos setores de controle de qualidade de produção e 
nas empresas. 
 
Definição 
O MO trata-se de um instrumento de óptica com capacidade de mostrar bas-
tante ampliada (aumento) e com determinados detalhes (resolução), a imagem 
de pequenas estruturas não visíveis ao olho desarmado. 
De acordo com as referências bibliográficas consultadas, verificamos que, 
para fins didáticos, o microscópio óptico pode ser dividido em várias partes; 
adaptamos àquela propostapor De Robertis & Hib (2006)3. Assim, podemos 
distinguir duas partes: 
Mecânica ou Estativa - serve de suporte para a parte óptica e para o manuseio 
da preparação histológica em estudo; 
Óptica - destinada a obtenção e ampliação da imagem do corte, bem como, 
fornecer iluminação adequada ao mesmo. 
 
Mecânica ou Estativa – consta dos seguintes componentes: 
 
Base 
Normalmente trata-se de uma peça quadrada ou ligeiramente retangular, com 
5 cm de altura, que tem por funções: sustentar os demais componentes da parte 
mecânica do Microscópio e; abrigar, internamente, alguns componentes do sis-
tema óptico de iluminação (lâmpada, lentes convergentes e espelho). Na sua 
parte antero-superior, possui um diafragma de campo e uma lente convergente. 
 
Coluna 
Encontra-se presa na extremidade posterior da Base, com formato de um "L" 
invertido, sendo a parte menor, responsável pela sustentação do Corpo binocular 
(antigo Tubo) e do Revólver e, na parte maior, a Platina, a Sub-platina e os 
Mecanismos de Movimentos. 
 
Corpo Binocular 
É uma peça metálica, com formato de trapézio, que tem como funções prin-
cipais: 
1. proteger internamente, um sistema de prismas que desvia os raios lumi-
nosos provenientes do sistema de iluminação  corte  lentes da objetiva  
lentes oculares e daí à retina de nossos olhos; 
2. sustentar em sua parte superior externa, as oculares. 
 
 
 
7 
Revólver 
É uma peça metálica, cromada, de forma circular-achatada, presa central-
mente à parte inferior da Coluna (braço menor), por meio de um parafuso. Possui 
4 ou 5 orifícios que servem para sustentar as Objetivas e apresenta um movi-
mento giratóribo, através do qual permite a inserção de cada uma delas no eixo 
óptico. 
 
Platina 
É uma peça plana, geralmente quadrada e fixa (não giratória), que serve para 
suporte da preparação histológica em estudo. Fica presa à Coluna e disposta 
perpendicularmente ao eixo óptico da Objetiva. No centro, apresenta um orifício 
que permite a passagem dos raios luminosos provenientes do sistema de Ilumi-
nação, localizado abaixo da Sub-platina. Na parte superior da Platina, encontra-
mos o Charriot, sistema de presilhas (uma fixa e a outra móvel) apropriado para 
prender e movimentar a preparação histológica, no sentido norte-sul e leste-
oeste, através de seus parafusos (parafusos do Charriot). 
 
Mecanismos de Movimentos 
Consiste de um sistema formado por dois parafusos grandes e coaxiais, de 
avanço amplo e rápido, o Macrométrico, e de outro sistema também composto 
por dois parafusos pequenos e coaxiais, de avanço lento e diminuto, o Micromé-
trico. O primeiro movimenta a platina proporcionando a aproximação entre a 
Objetiva e a preparação histológica (foco do corte), ao passo que, o segundo, 
também movimenta imperceptivelmente aos olhos desarmados, a altura da Pla-
tina e assim possibilita à obtenção do foco fino da preparação. 
 
Sub-platina 
Consta de um aro metálico, localizado abaixo da Platina, cuja função é a de 
sustentar ou prender, por meio de parafusos fixadores, parte dos componentes 
do Sistema de Iluminação (Filtro, Diafragma Íris e lentes do Condensador), po-
dendo movê-la, para cima ou para baixo, através do parafuso do Condensador. 
 
Óptica 
Podemos subdividir a Parte Óptica em dois sistemas: 
1. Formação e Ampliação da Imagem - compreende as objetivas e as 
oculares; 
2. Iluminação - constituído pelo condensador (sistema de lentes, diafragma 
íris e filtro) e a fonte de luz incidente (lâmpada, sistema de lentes, espelho e 
diafragma de campo). 
 
 
 
 
Vermelho 
 
8 
Sistema de Formação e Ampliação de Imagem 
Objetivas 
São formadas por um sistema de lentes convergentes, montadas em um tubo 
metálico. Formam uma imagem Aumentada, Real e Invertida, do objeto em es-
tudo. A objetiva tem Poder de Resolução, ou seja, a capacidade de produzir ima-
gens nítidas ou distintas de pontos situados muito próximos entre si. 
Geralmente, as objetivas são classificadas de acordo com o grau de correção 
das aberrações. A objetiva de uso geral para trabalhos de rotina é a acromática, 
enquanto que, para fotomicrografias, a mais aperfeiçoada é a plan-apocromática. 
 
Aberrações 
Denominam-se aberrações, aqueles defeitos de imagens produzidos normal-
mente nas lentes, devido a fenômenos de dispersão à deflexão da luz que passa 
pelas mesmas. Se as aberrações não forem corrigidas, as lentes tendem a pro-
duzir imagens distorcidas, pouco nítidas e em cores alteradas. 
As principais aberrações produzidas pelas lentes são: 
 
Cromática 
É devido ao fato das lentes simples não poderem concentrar em um só ponto 
os raios de diferentes comprimentos de onda (de diferentes cores), de modo que 
formam imagens borradas, com anéis coloridos. Esta aberração é corrigida atra-
vés do uso de objetivas acromáticas ou apocromáticas que oferecem imagens 
claras, desprovidas destes halos (anéis). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Violeta 
Vermelho 
 
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Esférica 
Uma lente simples tende a focalizar raios que passam na sua periferia, em 
local mais próximo (a) do que os raios que passam no seu centro (b). Em decor-
rência, produzirá uma imagem pouco nítida. 
Curvatura de campo 
A imagem ampliada, produzida por uma lente, tende a ser curva. Evidente-
mente, esta distorção da imagem prejudica a sua qualidade e impede que todo 
o campo seja visto em foco ao mesmo tempo. Nestas condições, o centro do 
campo aparece em foco e a periferia desfocada, ou vice-versa: 
 
Todas estas aberrações são corrigidas nas lentes do microscópio, por diversas 
técnicas. A mais importante consiste em associar várias lentes de características 
diferentes que neutralizem as aberrações. Assim, as melhores objetivas são 
constituídas por um número maior de lentes e, conseqüentemente, têm seus 
preços mais elevados. 
 
Significado das Inscrições no Corpo Metálico das Objetivas 
Várias inscrições podem ser vistas no corpo metálico das objetivas. De acordo 
com o que será apresentado em sala de aula, observamos, em um lado, a marca 
da firma (Carl Zeiss - Germany), e do outro: na parte superior esquerda, o Tipo 
e o Poder de Aumento da Objetiva (Plan 25); na inferior esquerda, o comprimento 
do Tubo (ou corpo binocular) em mm (170); na parte superior direita, a Abertura 
 
10 
Numérica (A 0,45) e na inferior direita, espessura máxima da lamínula em mm 
(0,17). Além destas, podemos encontrar ainda, os tipos: ( - ) - objetiva que pode 
ser usada com ou sem lamínula, e: (0) - objetiva que deve ser usada somente 
sem lamínula. 
 
Poder de Resolução 
Denomina-se Poder de Resolução a capacidade que tem os instrumentos óp-
ticos de formarem imagens distintas de pontos situados próximos uns dos outros. 
No microscópio óptico, esta característica básica é inerente da Objetiva. O Poder 
de Resolução depende do comprimento de onda (λ) e da Abertura Numérica ( 
AN ). 
 
Limite de Resolução 
Denomina-se Limite de Resolução a menor distância que deve haver entre 
dois pontos para que eles possam ser definidos ou para que apareçam indivi-
dualizados. O Limite de Resolução é inversamente proporcional ao Poder de Re-
solução. Limite de Resolução de uma Objetiva (ou Microscópio Óptico) pode ser 
expresso pela fórmula: 
 
LR = (K x λ) / AN 
 
Abertura Numérica (AN) 
A Abertura Numérica expressa uma relação matemática entre o Poder de Re-
solução de uma Objetiva e sua capacidade de captar luz. Abertura Numérica é 
definida matematicamente, como o produto do menor índice de refração ( n ) 
interposto entre a preparação histológica e a objetiva pelo seno do semi-ângulo 
de abertura (sen µ), sendo este, o ânguloformado pelos raios mais externos que 
penetram na Objetiva. Assim, podemos dizer que: 
 
AN = n x sen µ 
 
Nas Objetivas a seco (4X, 10X e 40X), existe AR entre a lente frontal da Ob-
jetiva e a preparação histológica; o índice de refração ( n ) dado é de valor 1,00. 
Na Objetiva de imersão em óleo ( 100X ), utilizamos uma gota de óleo entre a 
preparação histológica e a lente frontal da mesma e o índice de refração passa a 
ter um valor maior do que aquele estipulado para o AR : 1,51 . 
 
Comprimento de Onda (λ) 
Com relação ao comprimento de onda, os melhores e mais altos valores de 
resolução foram obtidos com o uso do ultravioleta, que possui o menor λ. Na 
região visível do espectro, a luz Azul tem o λ mais curto, seguido pelo verde e 
vermelho. Na prática, a preparação histológica é iluminada por luz branca, cons-
tituída por diversos comprimentos de onda. Geralmente, toma-se o λ da faixa 
do verde-amarelo (0,55µm ) para o cálculo do Limite de Resolução, fixando-
se o valor da constante ( K ) em 0,61. Para a sala de aula, não podemos alterar 
 
11 
o λ e, assim, a Resolução fica restrita à AN das Objetivas; quanto mais comple-
xas e corrigidas opticamente forem as Objetivas, maiores serão os valores de 
AN Com dois exemplos, mostraremos que o Limite de Resolução é estritamente 
dependente da AN da Objetiva e que não existe relação com o Aumento final 
dado pelo microscópio óptico ( Poder de Aumento da Objetiva versus Poder 
de Aumento da Ocular) e nem com o Poder de Aumento da Ocular utilizada 
(levando em consideração as nossas condições de sala de aula prática ): 
 
Exemplo 1 
A: (Obj. 10X) - (Oc. 20X) - (AN = 0,15) - (AF = 200X) 
B: (Obj. 40X) - (Oc. 05X) - (AN = 0,65) - (AF = 200X) 
 
Aplicando-se a fórmula, verifica-se que no caso A, o Limite de Resolução 
será de 2,2 µm e, no caso B, 0,5 µm. Portanto, mesmo sendo o Aumento Final 
(AF) de ambos os microscópios iguais ( 200X ), a imagem fornecida pelo 
caso B será muito mais rica em detalhes. 
 
Exemplo 2 
A: (Obj. 40X) - (Oc. 10X) - (AN = 0,65) - (AF = 400X) 
B: (Obj. 40Xi) - (Oc. 10X) - (AN = 1,00) - (AF = 400X) 
 
Ao compararmos as duas situações, onde usamos a mesma Ocular, com Ob-
jetivas de 40X normal e 40Xi de imersão, o que variamos foi simplesmente a AN 
da segunda (1,00 ao invés de 0,65), sendo o Aumento Final o mesmo. Neste 
exemplo, a situação B, fornecerá uma imagem muito rica em detalhes, e fica 
patente que esta riqueza é fornecida pela AN da Objetiva e não pelo Poder de 
Aumento da Ocular utilizada. 
 
Distância de Trabalho ( WD ) 
Uma outra característica importante das Objetivas é sua Distância de Trabalho 
(WD). A WD é a distância entre a lente frontal de uma Objetiva e o topo da 
Lamínula ou da preparação histológica. Normalmente, quanto maior o Poder de 
Aumento de uma Objetiva, menor será a WD. 
 
Oculares 
Cada Ocular é composta por duas lentes convergentes, simples ou composta, 
uma superior, denominada lente ocular propriamente dita, e uma inferior, cha-
mada lente de campo, ambas, montadas em um cilindro metálico. A Ocular mais 
comumente usada é a do tipo Huygen, onde as lentes são plano-convexas tendo, 
a convexidade de ambas, voltada para a preparação histológica. Existem as Ocu-
lares de Ramsden, também formadas por lentes tipo plano-convexas, porém, 
com a convexidade para seu interior. As Oculares têm como função principal 
formar uma imagem Virtual, Aumentada e Direta, da imagem real dada pela 
Objetiva. Além desta, corrigem pequenos defeitos da imagem que ainda persis-
tem após passarem pelas Objetivas. No Corpo metálico (rosca superior), normal-
mente, podemos visualizar duas inscrições: H10X ou R10X ( a letra expressa o 
tipo de Ocular e o número, o Poder de Aumento da mesma ). As Oculares de 
10X, em geral, apresentam Número de Campo igual a 18 ou 20mm. O quoci-
 
12 
ente: Número de Campo / Poder de Aumento da Objetiva, nos fornecerá o Diâ-
metro do Campo de Visão. A Ocular apresenta em seu interior, uma seta 
que permite apontar qualquer estrutura no Campo de Visão. 
 
Sistema de Iluminação 
Este sistema compreende o Condensador (sistema de lentes, diafragma íris e 
filtro) e a Fonte de luz incidente ou Iluminadores (lâmpada, sistema de lentes, 
espelho e diafragm,a de campo) 
 
Condensador – sistema de lentes / diafragma iris 
Conjunto de lentes montado num corpo metálico, situado abaixo da Platina 
do microscópio Óptico (preso a subplatina, por um parafuso de fixação), que 
concentra e fornece a luz necessária à iluminação do material em estudo. Os 
Condensadores mais usados são formados geralmente, por duas lentes: uma 
biconvexa (interna) e outra plano-convexa (superior), com face plana voltada 
para o orifício da platina. 
De acordo com o tipo de luz transmitida, temos Condensadores específicos: 
Campo-claro, Campo-escuro, Contraste de Fase e de Fluorescência. Quanto a 
correção óptica, os Condensadores assemelham-se às Objetivas, havendo tam-
bém, aqueles utilizados com Objetivas a seco, bem como, outros, usados com 
Objetivas de Imersão. 
Embora negligenciado no cálculo do Limite de Resolução, o Condensador apre-
senta em seu Corpo Metálico, inscrições especificando o Tipo e a AN do mesmo. 
Na escolha de um Condensador é importante considerar sua AN, que deve ser 
equivalente ou superior à AN da Objetiva de maior aumento a ser utilizada (nor-
malmente, AN do Condensador =1,32 para a objetiva de imersão em óleo). 
Os Condensadores apresentam também, um sistema de palhetas plásticas ou 
metálicas - o Diafragma Íris, situado logo abaixo de seu sistema de lentes. É 
importante salientar que a abertura do Diafragma Íris é crítica para a formação 
da imagem; quando totalmente aberto, a qualidade da imagem perece, devido a 
reflexão da luz ao longo do trajeto óptico no microscópio. Se estiver muito fe-
chado, obtém-se uma menor resolução e diminuição da nitidez. 
Dessa forma, para cada Objetiva existe uma abertura ideal do Diafragma Íris 
e recomendamos regulá-la, sempre. 
 
Filtros 
Os filtros são utilizados para modificar a cor (cromáticos), a intensidade 
(cinza-neutros) ou capacidade térmica (catatérmicos), da luz que chega ao sis-
tema óptico do microscópio. Os Filtros que mudam a cor (cromáticos) são mais 
freqüentemente usados para acentuar o contraste da imagem; por exemplo, é 
comum utilizar-se Filtro Azul para fotografar material corado por Hematoxilina - 
Eosina. 
 O filtro azul converte a temperatura de cor da iluminação de halogênio 
na temperatura de cor da luz natural, exibindo a amostra em suas cores naturais 
(diâmetro = 32,5 mm). 
 
Fonte de luz incidente ou Iluminadores 
 
13 
Geralmente, os Iluminadores consistem de uma lâmpada de 6V - 30W e 
dois sistemas de lentes: um situado internamente na Base (formado por 3 a 
4 lentes) e, outro (geralmente uma lente) – lente de campo, montado em um 
corpo metálico, localizado na parte anterior e externa, na Base, corretamente 
posicionados e definindo a trajetória óptica, no microscópio. Alguns equipamen-
tos possuem o Iluminador situado na Base, próximo da inserção com a Coluna; 
quando emitem raios luminosos, eles são concentrados por um conjunto de 
lentes e desviados, de sua trajetória horizontal, para outra, vertical, por um 
espelho, posicionado a 45°, em direção ao Condensador➟ espécimen em es-
tudo➟ objetivas➟ oculares (eixo óptico) e finalmente as retinas de nossos olhos. 
Nos microscópios modernos, encontramos ainda, o Diafragma de Campo, se-
melhante em constituição ao Diafragma Iris, fica situado abaixo da lente de 
campo, internamente na Base. A principal função dos Iluminadores é fornecerluz 
de qualidade e intensidade adequadas para uma iluminação uniforme e eficiente 
do campo. 
 
Ampliação do Microscópio Óptico 
A Ampliação final de um determinado espécimen em observação, ao micros-
cópio óptico pode ser expressa: 
 
AUMENTO FINAL = Poder Aumento da OBJETIVA x Poder Aumento OCULAR 
 
Deve ficar claro para o estudante que o AUMENTO de uma estrutura somente 
terá valor se houver concomitantemente, AUMENTO DE RESOLUÇÃO. Caso con-
trário, o Aumento será dito VAZIO, sem significado para as nossas proposições. 
 
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Métodos Gerais de Estudos 
Objetivos 
01. Definir técnica histológica 
02. Definir e Citar a importância das técnicas de coleta do material biológico: 
decalque, esfregaço, esmagamento, espalhamento e montagem total. 
03. Definir método a fresco (ou imediato) e Citar suas limitações. 
04. Definir método permanente (ou mediato). 
05. Conceituar fixação (métodos e modos) e fixador. 
06. Citar 04 (quatro) qualidades de um bom fixador. 
07. Definir “misturas fixadoras” e exemplificá-las. 
08. Baseado no quadro abaixo, Descrever cada uma das etapas do processa-
mento de material biológico para análise ao MO e ME de Transmissão e de 
Varredura. 
09. Definir corantes ácidos, básicos e neutros. 
10. Definir acidofilia, basofilia e metacromasia. 
 
 
Quadro Sinóptico Comparativo – Processamento de material biológico, por técni-
cas de rotina, para análise ao MO e ME de transmissão e Varredura. 
 
 M. Óptica METransmissão MEVarredura 
Fixação Formol, Bouin Glutaraldeído Glutaraldeído 
Lavagem Água, Soro Soluções Tampão Soluções Tampão 
Pós-fixação Tetróxido ósmio Tetróxido ósmio 
Lavagem Soluções Tampão Soluções Tampão 
Desidratação Solução Álcool Álcool / Acetona Álcool / Acetona 
Diafanização Xilol, Toluol Óxido propileno Óxido propileno 
Impregnação Parafina Resina Epóxi 
Inclusão Parafina Resina Epóxi Ap. Ponto crítico 
Aparamento Toalete do bloco Toalete do bloco 
Microtomia (MO) 
 
 
Ultramicrotomia 
(MET) 
Comum, manual 
congelação 
(5m) 
Escolha do campo 
de estudo (0,5 - 
1,0m) 
Cortes ultrafinos 
60 nm espessura 
 
Montagem cortes Lâminas de vidro Grades de cobre Suporte metálico 
Desparafinização Xilol, Toluol 
Hidratação Álcool  Água 
Coloração (MO) 
Contrastação 
(MET) 
Hematoxilina Eo-
sina 
Acetato Uranila 
Citrato Chumbo 
 
Metalização Cobertura com 
Ouro/Platina 
Desidratação Soluções Álcool 
Diafanização Xilol, Benzol 
Montagem final Bálsamo Canadá 
 
15 
 
Processamento de Material Biológico 
 
 O objetivo deste texto é oferecer ao estudante da Área III, o conheci-
mento da técnica de processamento de espécimen biológico, para inclusão em 
parafina, coloração pela Hematoxilina e Eosina e, montagem final permanente, o 
que denominaremos de “preparação histológica”. 
 
Introdução 
Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente com o aperfei-
çoamento dos métodos de investigação. A princípio o uso do microscópio com-
posto possibilitou o descobrimento das células e a elaboração da teoria segundo 
a qual todos os seres vivos são constituídos por células (Teoria Celular). 
Posteriormente, foram descobertas técnicas citoquímicas que possibilitaram a 
identificação e localização de diversas moléculas constituintes das células. Com 
o advento do microscópio eletrônico, foram observados pormenores da estrutura 
celular que não eram sequer imaginados pelos estudos feitos com o microscópio 
óptico. 
Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, existem muitas 
vantagens em obter uma preparação permanente, na qual as células ficam pre-
servadas, isto é, fixadas e coradas, para melhor demonstração de seus compo-
nentes. 
Para processarmos material biológico para inclusão em parafina, previamente, 
elaboramos um plano de trabalho, onde levamos em consideração: a escolha do 
animal (devemos nos preocupar com a preservação da fauna), as peças anatô-
micas a serem coletadas, as etapas da técnica histológica a serem cumpridas, 
listagem do material cirúrgico e dos reagentes, entre outros, para que possamos 
alcançar o objetivo final, que é a preparação histológica. 
Denomina-se preparação histológica, ao “sanduíche” composto por duas 
superfícies de vidro, uma, medindo 76mm x 25mm x 1mm, denominada de lâ-
mina e, outra, de formato, comprimento e largura variáveis, mas de espessura 
NUNCA superior a 0,17 mm, conhecida por lamínula e, como “recheio”, o tecido 
ou esfregaço, etc. As preparações histológicas, de acordo com sua perenidade, 
são classificadas em: 1. Permanente (Mediato) - apresentam tempo de vida útil 
muito longo, e; 2. A Fresco (Imediato) – de vida útil muito limitada. 
O processamento histológico pode ser dividido em várias fases: 
 
Coleta do material 
O material para a confecção de preparações histológicas é coletado, na mai-
oria das vezes, de animal de laboratório, como por exemplo, rato, camundongo, 
coelho, etc. 
Ao manipularmos animais de laboratório, inicialmente devemos proceder à 
anestesia para, em seguida, coletarmos a peça anatômica desejada. A anestesia 
deve ser lenta e gradativa, manipulando-se os animais quando estiverem com-
pletamente anestesiados. A narcose é recomendável não apenas no sentido de 
 
16 
evitar-se o sofrimento do animal, mas também, evitar contrações e distensões 
anormais das peças. 
A anestesia pode ser por gás, líquido ou sólido. Dependendo do organismo, o 
anestésico pode ser administrado por via oral, intramuscular, subcutânea, intra-
peritoneal ou endovenosa. 
O anestésico mais comumente usado é o éter etílico; pequenos mamíferos 
como ratos, camundongos cobaias e mesmo coelhos, são colocados num recipi-
ente contendo algodão saturado com éter, até adormecerem profundamente. 
Outro exemplo é o nembutal (pentobarbital sódico), administrado via endove-
nosa ou intraperitoneal, variando-se a dosagem de acordo com o animal. Para o 
rato, administra-se uma dose de 50 mg/Kg de peso corporal, via subcutânea. A 
anestesia dura aproximadamente 1 hora. 
Na prática, usando-se câmara anestésica, produtos farmacêuticos de uso 
anestésico e meios de aplicação apropriados, promove-se a anestesia do animal. 
Enquanto durar o efeito do anestésico, através de técnicas cirúrgicas indicadas, 
faz-se a coleta das peças anatômicas, iniciando pelas mais sensíveis à autólise. 
O animal anestesiado, deve ser mantido vivo durante a coleta e, as peças ana-
tômicas, coletadas no menor tempo possível, a fim de evitar a autólise. Por ve-
zes, administramos o fixador via endovenosa, o que propicia uma fixação melhor 
e mais uniforme, das peças anatômicas. Em ambos os casos, terminada a coleta 
do espécimen, as mesmas são colocadas em frascos contendo o liquído fixativo 
em uso. 
Para outras técnicas de coleta de materiais, vide Atlas de Morfologia micros-
cópica – fotomicrografias e eletromicrografias – 2004, Ed. Universitária/UFPE. 
 
Fixação 
A fixação é o processo que consiste no uso de substâncias fixadoras, cujo 
objetivo principal é o de estabilizar e preservar os componentes celulares, das 
peças anatômicas, como se estivessem vivos. 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento histológico, é muito 
importante controlar os parâmetros (ou variáveis), tais como: concentração, 
temperatura, pH, soluções diluentes (ex: tampões), osmolaridade, agitação e 
tempo, seja da solução fixadora, bem como, das demais soluções utilizadas no 
decorrer do processamento histológico. Particular atenção deve ser dada ao ta-
manho da peça anatômica a ser coletada, ou seja, quanto MENOR, melhor será 
a penetração dos líquidos ( fixador, desidratante e outros ) em seu interior. 
Fixadores são agentesempregados para manterem inalteradas, o quanto 
possível, as estruturas celulares das peças anatômicas, após sua retirada do ani-
mal. 
As peças anatômicas, normalmente são coletadas e imersas no líquido fixador. 
Entretanto, recomenda-se que os fixadores sejam perfundidos no animal, via 
subcutânea ou intravenosa e, a peça, após ser removida, seja colocada no 
mesmo fixador, em um recipente. 
Um bom fixador deve apresentar: 
01. penetração rápida e vigorosa - atuar rapidamente com a mesma eficácia, 
fixando igualmente tanto as camadas superficiais quanto as mais profundas; 
02. evitar a autólise e impedir a proliferação bacteriana; 
03. coagular as proteínas, de forma moderada; 
 
17 
04. conservar os detalhes estruturais tão próximos quanto possíveis daqueles 
que apresentavam “in vivo”; 
05. promover o endurecimento relativo das peças anatômicas, dando às estru-
turas uma consistência semi-sólida; 
06. impedir o aparecimento de estruturas artificiais; 
07. aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes. 
 
Classificação - os agentes fixadores podem ser classificados, de acordo com 
o quadro ao lado, em Físicos e Químicos. 
Normalmente, os agentes químicos são preferidos para o estudo das células 
e dos tecidos. Esses agentes são subdivididos em Simples, quando constituídos 
de um só componente e, de Misturas fixadoras, quando formados por mais de 
um componente. 
Fixadores simples - dentre os agentes fixadores simples, o mais freqüente-
mente usado é o formaldeído, um gás preparado em solução saturada que recebe 
o nome de formol ou formalina, cuja diluição varia ao redor de 40% (p/v). Nesta 
diluição, denominada de formol comercial, é um líquido incolor, odor picante e 
sabor cáustico. Seus vapores irritam às mucosas nasais e nasofaríngeas. O for-
mol é muito miscível com a água e o álcool e não com o éter e clorofórmio. Pela 
presença do aldeído, o formol comercial, espontaneamente, em contato com o 
ar sofre oxidação; isto aumenta o teor de ácido fórmico, que além de prejudicar 
sua ação fixadora, forma precipitados nas peças e destroi as células mucosas 
com acentuada deteriorização citoplasmática, sendo preferível, por isso, usar-se 
formol neutro. O formol penetra bem, mas de forma lenta, o que exige aumento 
do tempo de fixação e peças de dimensões o mais reduzidas possível. 
Na prática, utiliza-se rotineiramente, o formol neutro a 10%. O tempo de fi-
xação previsto varia de 6 a 24 horas. 
Misturas Fixadoras - Com o objetivo de completar a ação de um fixador 
simples, aumentando suas boas qualidades e atenuando seus defeitos, tornou-
se freqüente o emprego de misturas fixadoras. As misturas mais comumente 
usadas são : BOUIN, ZENKER, ALFAC (ou FAA), etc. 
A mistura de Bouin possui boa penetração, com um tempo médio de fixação 
variando de 04 a 24 horas; é excelente para uso geral, fixando bem proteínas e 
o glicogênio, precipitando os ácidos nucleicos, tornando-os mais evidenciados. 
A solução de Zenker fixa bem o núcleo celular e se presta à muitas técnicas 
de coloração, inclusive aquelas seletivas. O tempo médio de fixação para peças 
pequenas, varia de 06 a 12 horas e, para as maiores, até 24 horas. 
A mistura Alfac (ou FAA), que ao contrário de muitas outras, não recebe o 
nome de seu criador, e sim, designada pelas inicias de seus componentes, pene-
tra satisfatoriamente e com relativa rapidez, mantém a peça sob uma consistên-
cia adequada, não interfere na coloração a ser utilizada e serve como fixador 
para determinados estudos histoquímicos. Utiliza-se um tempo de fixação que 
varia de 06 a 12 horas. 
 
 
 
 
 
 
18 
Agentes 
Fixadores 
Físicos 
 Calor 
 
 Frio 
 
Químicos 
Simples 
 
Ácidos Inorgâni-
cos 
 Tetróxido de Ósmio 
 Tetróxido de Cromo 
 
Sais Metálicos 
Dicromatos de K+, Na+, 
Mg++,Zn++,Ba++,Ca++,Cu++ 
Dicloreto de Mercúrio 
 
 
Ácidos 
Orgânicos 
 
Ácido Acético 
Ácido Tricloroacético 
Ácido Pícrico 
 
Redutores 
Formol-aldeído fórmico 
Álcool Metílico 
Álcool Etílico 
Acetona – Propanona 
 
Misturas 
Fixadoras 
 Bouin 
 Zenker 
 FAA – Formol/Ácido Acético/Álcool 
 
Desmineralização ou Descalcificação 
É a retirada dos sais minerais das peças histológicas normalmente minerali-
zadas, como os ossos e dentes, ou daquelas que, anormalmente, se tornaram 
sede de depósitos dos mesmos. Para a obtenção de cortes ao micrótomo, é ne-
cessário a retirada dos sais minerais e utiliza-se para tal, os agentes desminera-
lizadores (ou descalcificadores). 
Os agentes usados para a desmineralização variam entre os ácidos inorgâni-
cos e orgânicos (exemplo: solução de Perenyil) aos quelantes (E.D.T.A). Os pri-
meiros (ácidos) atuam retirando os íons metálicos (cátions) e com eles tendem 
a formar sais solúveis; promovem alterações consideráveis na peça histológica. 
Já os quelantes, promovem a retirada dos íons metálicos das estruturas sem se 
combinarem com eles, formando sais; por conseqüência, praticamente não cau-
sam alterações no material e, assim, são os preferidos para a desmineralização. 
Após a fixação (e/ou desmineralização), o excesso deste líquido deve ser 
removido, antes da desidratação, e assim, minimizar uma possível reação entre 
o fixador e o agente desidratante. É aconselhável lavar a peça com o líquido 
diluente do fixador. 
 
 
 
 
19 
Desidratação 
A desidratação é necessária porque usualmente, a parafina (ou outros meios 
de emblocagem) não é miscível com a água. Assim, toda a água do fixador (se 
existente) e da lavagem, no espécimen, devem ser substituídas por um solvente 
orgânico. A retirada da água, tanto do interior das células quanto das substâncias 
intercelulares é realizada através do uso de uma bateria crescente de álcool etí-
lico, miscível com a água e com o agente diafanizante (a ser usado, a seguir); 
dessa forma, evita-se alterações estruturais irreversíveis na peça. A substituição 
da água por álcool torna as peças histológicas resistentes, indeformáveis e ma-
cias. Outros agentes desidratantes utilizados são os álcoois metílico, amílico e 
butílico, o clorofórmio, e a acetona. 
Na prática, utiliza-se a seguinte bateria crescente de álcool etílico : 
Álcool 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, Absoluto (100%, 100% e 100%) - 30 a 
60 minutos cada, trocando a solução, pelo menos, 3 vezes cada. 
 
Diafanização 
Consiste na substituição do álcool pelo agente diafanizante, o qual confere a 
peça histológica seu alto índice de refração, tornando-a translúcida, sendo assim, 
esta etapa, chamada diafanização. Como agentes diafanizadores, utilizam-se o 
xilol, benzol, toluol, fenol e o clorofórmio. Embora o xilol endureça muito as peças 
histológicas, tornando-as friáveis, é universalmente mais usado. Existe a tendên-
cia de substituí-lo pelo benzol ou pelo toluol, que não apresentam este inconve-
niente. 
O diafanizador tem obrigatoriamente, que ser miscível com o agente desidra-
tante (álcool) e ser dissolvente da parafina, o que faz com que esta, penetre na 
intimidade dos tecidos, durante a fase seguinte do processamento histológico 
(impregnação). 
Na prática, utilizamos o seguinte protocolo: 
Xilol Puro - 3 banhos de 30 a 60 minutos cada. 
 
Impregnação pela Parafina 
É a fase na qual a peça histológica é imersa na parafina líquida, que penetra 
nos interstícios da mesma, ocupando completamente, todos os seus espaços. 
À temperatura ambiente, a parafina apresenta-se em estado sólido, de cor 
branca, sendo solúvel nos agentes diafanizantes acima citados. A parafina é ca-
racterizada pelos seus pontos de fusão; as denominadas brandas, fundem-se 
entre 40 a 50 ºC e as chamadas duras, apresentam ponto de fusão em torno de55 a 65 ºC. 
Rotineiramente, utilizamos parafina com ponto de fusão intermediário, entre 
52 e 55 ºC. Ela pode ser misturada com cera de abelha (5% cera / 95% parafina), 
carnaúba a 3% ou ainda, estearina, na proporção de 25g / 1000g de parafina. O 
acréscimo destes produtos à parafina, melhora sua plasticidade e facilita a mi-
crotomia. 
Na prática, a impregnação de peças histológicas é feita na estufa, onde a 
temperatura está sempre 2 graus centígrados acima daquela do ponto de fusão 
da parafina. Freqüentemente usam-se dois ou três banhos sucessivos de parafina 
 
20 
a fim de retirar de cada um deles, todos os vestígios do agente diafanizador que 
prejudicaria a qualidade do bloco, bem como, a perfeição dos cortes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inclusão Definitiva 
A inclusão definitiva da peça na parafina que constituirá o bloco é feita num 
molde apropriado (barras de Leuckart - duas barras de chumbo em forma de L - 
, formas de papel, etc), no qual se despeja a parafina fundida e onde, com o 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Histokinette 2000 - 
Reichert-Jung. Pro-
cessador automá-
tico de tecidos com 
12 estações de pro-
cessamento, becker 
com capacidade de 
2 litros e ciclo pro-
gramável em 24 
horas. (desidrata-
ção até impregna-
ção pela parafina). 
 
1 
2 
3 
Histoembedder, da 
Reichert-Jung 
 
Unidade compacta 
para execução de 
todo o processo de in-
clusão de material em 
parafina 
 
1 - Reservatório de 
Parafina 
 
2 - Material a ser em-
blocado 
 
3 - Placa 
 
21 
auxílio de uma pinça é colocada a peça deixando-a em repouso até que a parafina 
se solidifique, depois de esfriar. Deve-se tomar o cuidado de colocar a superfície 
da peça que se quer cortar, voltada para o fundo do molde. A parafina usada 
para fazer o bloco não deverá ser nem muito mole (temperatura de fusão baixa) 
- o que não permitiria fazer cortes finos - nem muito dura (temperatura de fusão 
alta), já que o aquecimento para fundi-la poderia deteriorar as peças. 
 
Toalete do Bloco 
A peça histológica, agora incluída na parafina, forma com esta o que denomi-
namos de bloco. A toalete do bloco consiste em reduzir as dimensões do mesmo, 
removendo-se o excesso de parafina que venha dificultar, posteriormente, a mi-
crotomia. Em seguida, com o uso de uma espátula aquecida, fundimos a parafina 
da face do bloco contrária àquela que contenha a peça histológica incluída e o 
prendemos a um suporte de madeira, plástico ou metal. Através deste suporte, 
o bloco será preso ao porta-objetos do micrótomo. 
 
Microtomia (confecção de cortes) 
A microtomia tem por finalidade cortar a peça histológica em fatias finíssimas, 
com espessura variando de 1 a 7 m, utilizando-se para isto um aparelho mecâ-
nico denominado micrótomo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para a obtenção dos cortes, devemos proceder da seguinte maneira: 
 
01. Uma navalha de aço é presa ao seu suporte no micrótomo; 
02. Prender e orientar o suporte do bloco (madeira, plástico ou metal) no porta 
- objeto, do aparelho; inicia-se o movimento do bloco no sentido norte - sul 
até que passe pela navalha, fazendo uma secção ou corte; 
3 
1 
2 
Micrótomo para cortes 
de material emblocado 
em parafina ou plástico, 
da Reichert-Jung, mo-
delo 2035. 
 
1 - Tecido emblocado 
em parafina preso ao 
porta-espécimem 
 
2 - Navalha presa ao 
porta-objeto 
 
3 - Embolo para o mo-
vimento do bloco, no 
sentido norte sul 
 
22 
03. Após várias secções realizadas e tendo o tecido cortado em toda a sua ex-
tensão, regula-se a micragem (espessura do corte) desejada; 
04. A cada giro completo (360 o) da manivela (seta negra) do micrótomo, o bloco 
passa pela navalha e novos cortes são confeccionados. 
 
Os cortes ficam ligados uns aos outros, surgindo uma fita de parafina com os 
cortes. 
A fita é transferida para um banho-maria (ou cristalizador) contendo água a 
40 – 50 ºC, para estiramento da parafina e, por conseqüência, dos cortes histo-
lógicos, a fim de não restarem dobras nos mesmos. 
 
Coleta dos Cortes (Pescaria) 
A pescaria dos cortes é realizada, utilizando-se lâmina de vidro limpa, já 
contendo uma película (albumina / glicerina, v/v) na sua face que receberá os 
mesmos. Os cortes, isoladamente, ou vários, em fita, podem ser montados, com 
o auxílio de um pincel, sobre as lâminas nas quais ficarão colados. Escorre-se o 
excesso de água e coloca-se a lâmina, numa estufa (ou placa aquecedora) a 37 
ºC para total evaporação da água e colagem final do corte. 
Uma vez confeccionados os cortes histológicos e montados nas lâminas de 
vidro, o passo subseqüente será corá-los. Entretanto, os cortes estão imersos 
em parafina e a mesma deve necessariamente, ser removida. 
 
Desparafinização e Hidratação dos Cortes 
A retirada da parafina é feita mergulhando-se a lâmina com o corte histológico 
em três banhos sucessivos de xilol: 1o. banho - 5 minutos; 2o banho - 3 minutos, 
e; 3o banho - apenas 2 minutos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Histostainer Ig 
da Reichert – 
Jung 
 
Aparelho para 
coloração auto-
mática, com ca-
pacidade para 
até 20 lâminas 
e memória para 
10 programas 
independentes 
 
23 
O xilol, agora ocupando os espaços teciduais, em substituição à parafina, não 
é miscível com a água (normalmente, o diluente dos corantes). Assim, a substi-
tuíção do xilol é realizada, lavando-se os cortes com álcool absoluto. 
A hidratação consiste na substituição paulatina, do álcool pela água. Para tal, 
utilizamos uma bateria decrescente de álcool etílico até a água corrente. 
 
Prática: 
 
1o. banho de álcool absoluto - 5 minutos; 
2o. banho de álcool absoluto - 3 minutos 
Álcoois 95%, 90%, 80%, 70% e 50% - 2 banhos cada, de 2 minutos 
Água corrente – 10 minutos. 
 
Coloração pela Hematoxilina e Eosina 
A maioria dos elementos que constituem os tecidos é naturalmente incolor ou 
transparente. Para que eles se tornem visíveis no microscópio óptico comum e 
contrastem em relação uns aos outros, os cortes devem ser corados. 
Coloração é o processo que consiste em submeter o corte histológico, já 
hidratado, à ação de um ou vários corantes. 
Os corantes, substâncias ou agentes utilizados para corar, são constituídos 
por sais cujos cátions, ânions ou ambos, são coloridos. Quando somente o cátion 
do sal é colorido, diz-se que o corante é básico (ex: azul de metileno, hemato-
xilina). Quando apenas o ânion do sal é colorido, diz-se que o corante é ácido 
(ex: eosina). Quando ambos os íons são coloridos, considera-se que o corante 
seja neutro (ex: eosinato de azul de metileno) 
A maioria dos corantes usado em histologia (ácidos e básicos) tende a formar 
ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os componentes 
dos tecidos que se coram com corantes básicos são chamados basófilos, sendo 
denominados de acidófilos os que se ligam a corantes ácidos. 
A coloração dupla pela Hematoxilina - Eosina é a mais utilizada na rotina em 
Histologia. Existem várias fórmulas de preparo da hematoxilina, sendo as princi-
pais : Hematoxilina de Harris, Hematoxilina de Delafield, Hematoxilina de Mayer 
e Hematoxilina de Carazzi. A eosina pode ser preparada em solução alcoólica a 
1% ou solução aquosa a 2,5%. Além destes corantes, muitos outros também são 
utilizados. A hematoxilina é um corante denominado hemateína (obtida da árvore 
do paucampeche) usado em combinação com íons Al+3. A hematolixilina, corante 
básicoazulado, é carregado positivamente (catiônico), enquanto a eosina, co-
rante avermelhado, é carregado negativamente (aniônica). Corantes básicos (po-
sitivos) ligam-se a múltiplos grupos PO-3/4 em ácidos nucleicos e, em menor grau, 
a múltiplos grupos SO–3 em certas macromoléculas intersticiais da matriz. Já os 
corantes ácidos (negativos) ligam-se a sítios positivos (NH+3) em proteínas fixa-
das. 
Na prática, o tempo médio de coloração dos cortes, pela Hematoxilina é de 
45 segundos, podendo atingir até 2 minutos (dependendo do tempo de uso do 
corante); em seguida, lava-se os cortes em água corrente (torneira) e deixa-os 
por mais 20 minutos, para que ocorra a viragem para o azul. A viragem é obtida 
pela ação dos sais alcalinos terrosos existentes na água de torneira. Caso a água 
seja ácida, utiliza-se um pouco de carbonato de lítio para alcalinizá-la; passa-se 
 
24 
os cortes rapidamente em água destilada, duas a três vezes. Submergem-se os 
cortes em solução aquosa de eosina a 1%, por 1 ou 2 minutos, obtendo-se uma 
sobrecoloração. Lava-se em água destilada rapidamente e diferencia-se em al-
cool a 70%, até se obter a intensidade de coloração desejada. 
(Resultados: núcleos celulares corados em tonalidades de azul, roxo ou vi-
oleta, pela hematoxilina - e o citoplasma, variando do róseo ao alaranjado, 
pela eosina). 
Uma vez corados, os cortes deverão ser cobertos por uma lamínula, que irá 
protegê-los e preservá-los por longo tempo; este processo é denominado de 
montagem. Usualmente, o meio de montagem permanente mais utilizado, o bál-
samo do Canadá, não é miscível com a água, presente nos cortes; dessa forma, 
torna-se imprescindível sua retirada. 
 
Desidratação, Diafanização e Montagem Final 
A retirada da água das estruturas inter e intracelulares, é realizada através 
do uso de uma bateria crescente de álcool (vide desidratação). Entretanto, o 
álcool também não é miscível com o meio de montagem permanente e, assim, o 
agente desidratante deve ser substituído por uma substância, que obrigatoria-
mente, deve ser miscível no álcool e no bálsamo do Canadá; utiliza-se como 
diafanizador, o xilol (vide diafanização). Nestas circunstâncias, procede-se à 
montagem final dos cortes. 
 
 
 
A montagem final consiste em fechar o material (corte, esfregaço, etc) em 
um tipo de câmara constituída pela própria lâmina de vidro, que suporta o espé-
cimen (cinza) e uma lamínula de vidro (quadrado pequeno) – (fig. acima). 
A lamínula é colada sobre o material com o auxílio de uma resina natural (ou 
sintética) solidificável, meio altamente refringente, que serve ao mesmo tempo 
para aumentar a transparência dos cortes e conservá-los. O meio anidro de mon-
tagem mais usado é o bálsamo do Canadá, resina obtida da casca das árvores 
Abies balsamea e Abies canadensis ; dissolvido no xilol, seu índice de refração é 
de 1,532 e, ao secar (n = 1,535) é próximo ao do vidro de que é feita a lamínula 
( n = 1,518), com o que se evita a perda de raios luminosos por refração. 
 
25 
O bálsamo do canadá é um líquido espesso, transparente e amarelado. É par-
cialmente solúvel em álcool e completamente solúvel no xilol. A principal des-
vantagem do bálsamo do Canadá é que escurece e torna-se ácido com o tempo, 
por oxidação do xilol. Isso resulta em descoloração de corantes básicos (ex: he-
matoxilina). O bálsamo do Canadá não deve ser aquecido para fundir. Para evitar 
acidez, adiciona-se um pedaço de mármore no frasco contendo a resina. 
Outros meios de montagem são utilizados, como por exemplo, o Permount, 
transparente, neutro, seca rapidamente e possui índice de refração de 1,53 
 
26 
Processamento de Material Biológico – MET 
 
O objetivo deste texto é o de apresentar aos estudantes de graduação da Área 
III, os princípios básicos do processamento de espécimen biológico, para inclusão 
em resina Epoxi, ultramicrotomia, contrastação com metais pesados e, posteri-
ormente, exame ao microscópio eletrônico de transmissão (MET). 
 
Introdução 
A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem trazido substanciais con-
tribuições para a solução de problemas em biologia e na medicina, nas quais, o 
Microscópio Eletrônico de Transmissão possibilita e auxilia-nos no exame direto 
das estruturas biológicas a nível ultra-estrutural. Tais informações são de impor-
tância vital para a compreensão da correlação entre estrutura e função a nível 
celular. 
O estudo ultra-estrutural de células e tecidos, utilizando-se o MET, usual-
mente requer fixação química. Os objetivos principais da fixação química são a 
estabilização e a preservação dos componentes celulares. 
 
Anestesia do animal e Coleta do espécimen 
Normalmente, os animais são previamente anestesiados, ou alternativa-
mente, sacrificados por deslocamento cervical ou mesmo decapitação, e em se-
guida, os tecidos são coletados e imersos no fixador. 
Pequenos animais (ex: rato) podem ser anestesiados com anestésicos voláteis 
como o éter ou halotane; entretanto, o uso do barbital é o mais indicado. Para 
grandes animais, a injeção intravenosa ou intraperitoneal com nembutal, hidrato 
cloral ou inactina é usada. Injeção intravenosa é preferida para administração de 
drogas em solução; drogas irritantes aos tecidos podem ser administradas dessa 
maneira, com muita segurança. Por outro lado, a injeção intraperitoneal é rela-
tivamente fácil e recomendada para a administração de drogas não irritantes. O 
efeito da anestesia é mais lento e suave com injeção intraperitoneal do que com 
a intravenosa. 
Se o animal necessita ser sacrificado, é importante ressaltar que o método de 
sacrifício pode alterar a ultra-estrutura de certos tecidos. Os espécimens são co-
letados imediatamente após a anestesia do animal, evitando-se assim, alterações 
pós-morte, devido à parada da circulação sangüínea. 
Durante a coleta, o tecido está sujeito a danos físicos; para minimizar estes 
danos, devemos banhar (ou colocar algodão sobre) o órgão de interesse, com a 
solução fixadora, por 5 ou 10 minutos, antes de sua coleta. A perfusão vascular 
é ideal para minimizar danos físicos e obter-se uma fixação uniforme mesmo nas 
regiões mais profundas dos órgãos. 
 
Fixação 
A fixação química é o método mais extensivamente usado para a preservação 
de espécimens biológicos, tanto para a microscopia eletrônica de transmissão 
quanto para a de varredura. 
Os principais objetivos da fixação são: 
 
27 
01. preservar a estrutura celular com o mínimo de alterações possíveis, princi-
palmente quanto à morfologia, volume e relação espacial de organelas e ma-
cromoléculas; 
02. Perda mínima de constituintes dos tecidos; 
03. Proteção do espécimen contra os tratamentos subsequentes, incluindo lava-
gem, desidratação, embebição, contrastação, vácuo e a exposição aos feixes 
de elétrons; 
04. A fixação deve também, minimizar as alterações na reatividade química das 
substâncias celulares tais como as enzimas e preservar e protegê-las. 
Idealmente, o que se espera de um método de fixação é a preservação satis-
fatória da célula como um todo e não meramente a melhor preservação de ape-
nas uma parte dela. Na prática, a fixação é usualmente mais seletiva do que 
geral, uma vez que, o objetivo do estudo é que determina o tipo e a maneira de 
fixação. 
Na fixação, como em qualquer etapa do processamento histológico, é muito 
importante controlar os parâmetros (ou variáveis), que afetam a sua qualidade, 
tais como: concentração, temperatura, pH, soluções diluentes (ex: tampões), 
osmolaridade, agitação e tempo, seja da solução fixadora seja das demais solu-
ções utilizadas no decorrer do processamento. Particular atenção deve ser dada 
ao tamanho da peça anatômica a ser coletada,ou seja, quanto MENOR (0,5 a 
1,0mm3), melhor será a penetração dos líquidos (fixador, desidratante e outros 
) em seu interior . 
Os mais efetivos fixadores usados rotineiramente na MET são os aldeídos e o 
tetróxido de ósmio (OsO4). 
Dentre os aldeídos, o Glutaraldeído (ou aldeído glutárico), um dialdeído, 
promove ligações cruzadas irreversíveis, intra e intermolecular, dentro das pro-
teínas, principalmente através dos grupos -amino da lisina. Os grupos aminos 
nos fosfolipídios também reagem com o glutaraldeído, resultando na ligação en-
tre estes lipídios e as proteínas da membrana. Outros tipos de lipídios, bem como, 
glicoproteínas não são fixados com o glutaraldeído. Outro aldeído menos comu-
mente utilizado é o formaldeído, obtido da dissociação do paraformaldeído em 
pó. Sendo um monômero, ele penetra nos tecidos mais rapidamente do que o 
glutaraldeído, fixa mais facilmente grandes blocos de tecidos, sendo por isso, 
utilizado para preservar aqueles provenientes de cirurgia e biópsias, para ambas 
as microscopias, eletrônica de transmissão e óptica. O formaldeído é um pobre 
fixador para lipídios; degrada alguns deles e, aqueles fixados, durante a desidra-
tação são extraídos. Dessa forma, não sendo utilizado como fixador primário, 
são indicados, em certos casos, combinados com o glutaraldeído, na concentra-
ção de 1,5 a 4%. Ressalta-se que a mistura formaldeído-glutaraldeído penetra 
até 500 m em tecidos ou órgãos, como o fígado de ratos ou camundongos. 
Os aldeídos, sendo de natureza orgânica, não oferecem eletro-densidade ao 
espécimen. Essa deficiência é superada pelo uso do tetróxido de ósmio, como 
agente pós-fixador. 
 
Procedimentos Práticos 
Fatias pequenas e finíssimas de tecidos são coletadas do animal, utilizando-
se uma pinça e uma gilete e, em seguida, imersas em frascos contendo solução 
fixadora de aldeído glutárico a 2,5% (podendo variar de 2 a 4%). Após 10 a 20 
 
28 
minutos de prévia fixação, sobre uma placa de cera ou um pedaço de borracha 
contendo uma ou duas gotas do mesmo fixador, usando-se uma gilete nova, 
estas fatias são reduzidas a pequenas peças ou fragmentos com cerca de 0,5 
mm3. Os fragmentos são colocados em frascos pequenos e arrolhados, contendo 
a referida solução fixadora, por 1 a 3 horas (às vezes, devendo permanecer por 
até 24 horas), à temperatura ambiente ou a 4o C, de preferência, sob constante 
agitação mecânica. Findo o tempo de fixação, os fragmentos deverão ser lavados 
e pós-fixados em tetróxido de ósmio. 
 
Soluções Tampão 
O veículo de um fixador normalmente consiste de uma solução tampão a qual 
pode ser adicionado sais ou outras substâncias para aumentar a sua osmolari-
dade. O termo osmolaridade é usado aqui estritamente com relação à resposta 
da célula quando imersa na solução, ou seja, uma solução fixadora é isotônica 
com a célula (ou tecido) se a mesma não incha e nem se contrai, quando imersa 
nela (solução). Dentre as principais e mais utilizadas soluções tampões, citamos 
o Fosfato de sódio e o Cacodilato de sódio. 
 
Lavagem 
Após fixação primária com glutaraldeído, o espécimen deve ser lavado e, 
posteriormente, pós-fixado com tetróxido de ósmio. A lavagem evita que possa 
ocorrer qualquer reação entre estes agentes fixadores. Uma vez pós-fixado, o 
espécimen deve ser lavado novamente, pela mesma razão descrita acima, ou 
seja, para que NÃO haja reação entre o pós-fixador e o desidratante. Para ambas 
as lavagens, utiliza-se a solução tampão usada como diluente dos fixadores, o 
que minimiza diferenças na osmolaridade efetiva. 
 
Procedimentos Práticos 
Utilizando-se uma pipeta de Pasteur, retira-se todo o liquido fixador do frasco. 
Com outra pipeta, coloca-se a solução tampão; agita-se o frasco para que os 
espécimens sejam bem lavados; novamente, retira-se o líquido e substitui-se por 
um novo e, a partir de então, marca-se o tempo desejado. Repete-se esse pro-
cedimento pelo menos três vezes, como programado no protocolo experimental. 
Em seguida, procede-se à pós-fixação com tetróxido de ósmio. 
 
Pós-fixação 
O tetróxido de ósmio é um fixador que reage com lipídios insaturados e com 
certas proteínas, bem como, fornece eletro-densidade ao tecido. Assim, o tetró-
xido de ósmio atua como fixador e como corante eletro-denso. Este agente é um 
fixador aditivo, pois se torna parte da substância celular que ele fixa. As ligações 
insaturadas nas moléculas lipídicas são os sítios de reações primários. O tetróxido 
de ósmio não reage com as pentoses ou hexoses dos açúcares ou seus polímeros 
e, a maioria dos carboidratos dos tecidos (se fixados) são extraídos durante a 
lavagem e a desidratação. Uma rápida e uniforme fixação com o tetróxido de 
ósmio podem ocorrer até uma profundidade de 0,25 mm, para a maioria dos 
tecidos. 
 
29 
A solução tamponada de tetróxido de ósmio é rotineiramente usada na con-
centração de 1% ou 2% (às vezes, 4%), a temperatura ambiente. 
 
Procedimentos Práticos 
A melhor preservação da ultra-estrutura celular tem sido obtida pela fixação 
primária com glutaraldeído (ou mistura glutaraldeído mais paraformaldeido), 
como descrito acima e, em seguida, pós-fixado pelo tetróxido de ósmio. Esta 
fixação sequencial é denominada de dupla fixação. A pós-fixação do espécimen 
é realizada necessariamente, dentro de uma capela, uma vez que este reagente 
é muito volátil e cancerígeno. O líquido de lavagem (solução tampão) é substitu-
ído pela substância pós-fixadora, na concentração de 2%, usando pipeta de Pas-
teur. A pós-fixação é realizada à temperatura ambiente, por aproximadamente 2 
horas, sob constante agitação mecânica. Findo o tempo, procede-se a uma nova 
lavagem com o tampão diluente do fixador para, em seguida, desidratar-se os 
espécimens. 
Importante - Embora os tipos celulares variem de organismo para orga-
nismo, bem como entre os tecidos ou estágios do ciclo biológico, existem alguns 
critérios para a análise preliminar da fixação (PEASE – 1968, Histol. Techniq. 
Electr. Microsc., Academic Press, NY) : 
 
01. Os núcleos devem aparecer uniformes e finamente granulares, usualmente 
associados com outras organelas. 
02. A cromatina deve aparecer como massas agregadas, embora nem sempre 
presentes no corte. 
03. Mitocôndrias devem aparecer sem expansões (inchações) e não terem as-
pectos “vazios”. 
04. Quando o retículo endoplasmático está disposto mais ou menos em cisternas, 
o arranjo e o diâmetro das cisternas devem ser mais ou menos uniformes e 
não expandidas irregularmente. 
05. O espaço entre as duas membranas do Envoltório nuclear deve ser uniforme. 
06. A Membrana Plasmática deve ser contínua. 
07. A matriz citoplasmática ou substância de fundo, deve ser finamente precipi-
tada e não muito evidente na maioria das células. 
 
Desidratação 
É necessária, uma vez que, vários meios para inclusão NÃO são miscíveis com 
a água. Dessa forma, toda a água contida no espécimen, proveniente da fixação, 
lavagem e pós-fixação, deve ser substituída por solvente orgânico antes da em-
bebição e da inclusão (ou emblocagem). A remoção total da água é desnecessária 
quando o espécimen for embebido em resinas miscíveis em água. A água é re-
movida, submetendo-se o espécimen a uma bateria crescente de álcool etílico ou 
acetona. O uso de óxido de propileno no último estágio da desidratação é neces-
sário quando o etanol é usado como agente desidratante. 
 
Procedimentos Práticos 
O líquido de lavagem (ou o pós-fixador) é retirado do frasco com pipeta de 
Pasteur e substituído pelo líquido desidratante. O frasco é agitado, manualmente, 
 
30 
para que os espécimens sejam bem lavados. Em seguida, o líquido desidratante 
é substituído por um novo, da mesmaconcentração; os frascos, devidamente 
arrolhados e contendo os espécimens são guardados na geladeira a 4o.C sob 
constante agitação mecânica, durante o tempo determinado no protocolo expe-
rimental. Este procedimento é realizado para todas as etapas da desidratação. 
As seguintes baterias podem ser utilizadas: 
Acetona – 10% - 20% - 40% - 60% - 80% - 95% - 100% - 100% - 100% - 
5 minutos para cada etapa, ou; 
Álcool Etílico – 10% - 20% - 40% - 60% - 80% - 95% - 100% - 100% - óxido 
de propileno 100% (2 vezes) – 5 minutos para cada etapa (ou tempos superio-
res). 
 
Embebição e Emblocagem 
Normalmente, os espécimens são extremamente pequenos, frágeis, porosos 
e quebradiços, devendo ser manuseados com muito cuidado. Esses materiais, 
após a desidratação, devem ser penetrados com resinas apropriadas e que faci-
lite a obtenção dos cortes semi e ultrafinos. A maioria dos espécimens é embe-
bida e emblocada em resinas NÃO miscíveis com a água, como por exemplo, 
Epon 812, Araldite e o Maraglas. Outros são embebidos e incluídos em resinas 
miscíveis com a água; dentre eles citamos o Durcupan e o Lowicryl K4M. As 
primeiras são polimerizadas por aquecimento, enquanto que as últimas, são “so-
lidificadas” por aquecimento ou radiação ultravioleta a baixas temperaturas. A 
finalidade básica da emblocagem ou inclusão é oferecer ao espécimen condições 
de rigidez suficientes para a realização da ultra-microtomia e, por conseqüência, 
a obtenção de cortes ultrafinos (60nm de espessura). 
 
Procedimentos Práticos 
Embebição – semelhantemente aos procedimentos anteriores, o líquido de-
sidratante é substituído pela substância na qual os espécimens ficarão embebi-
dos. A embebição é realizada à temperatura ambiente, sob constante agitação 
mecânica e, sempre que possível, dentro de uma capela. O seguinte protocolo 
pode ser utilizado: 
 
 Acetona + Resina Epon 812 (3v : 1v) - 30 minutos 
 Acetona + Resina Epon 812 (1v : 1v) - 30 minutos 
 Acetona + Resina Epon 812 (1v : 3v) - 30 minutos 
 Resina pura Epon 812 - 30 minutos. 
 
Emblocagem – é feita em cápsulas de gelatina ou moldes de borracha. Uma 
pequena gota de resina Epon 812 pura e nova é colocada no fundo da cápsula 
(ou no topo do molde). Os espécimens são removidos do frasco e colocados sobre 
um papel alumínio e, com um palito de dente, cada fragmento é colocado indivi-
dualmente, em uma cápsula, imerso na gota de resina. Em seguida, a cápsula é 
preenchida em sua totalidade, por resina. As cápsulas são transferidas para uma 
 
31 
estufa a 60o.C, por 72 horas, para a polimerização da resina. Findo este tempo, 
cada bloco é retirado de sua respectiva cápsula (ou molde). 
Importante – especial atenção deve ser dada à orientação do espécimen, na 
cápsula ou no molde de borracha, por ocasião da emblocagem. 
 
Ultra-microtomia 
Existem duas principais razões para se realizar cortes ultra-finos: 
1. o feixe de elétrons do microscópio eletrônico de transmissão, operado a 
uma aceleração de voltagem convencional (50 ~70Kv) não penetra cortes mais 
espessos do que 100nm; 
2. sendo, a maioria dos tecidos de consistência relativamente mole, deve ser 
emblocado em resinas duras, tipo resinas epóxi. 
Usualmente, o bloco contendo o espécimen embebido deve ser reaparado an-
tes da ultra-microtomia. Para a MET, o principal propósito deste reaparamento é 
o de remover o excesso de resina ao redor do espécimen, no topo do bloco (to-
alete do bloco). 
Cortes semi-finos – o uso destes cortes em histologia e patologia é de 
grande valia no diagnóstico clínico. Além disso, saliente-se que as resinas pre-
servam os componentes celulares melhor do que o faz a parafina. Para exame 
ao microscópio óptico, estes cortes são 5 vezes mais finos do que aqueles obtidos 
quando emblocados em parafina. Na MET, através destes cortes, pode-se deter-
minar precisamente a área de interesse de estudo, prioritariamente à obtenção 
de cortes ultra-finos, ganhando-se assim, em economia de tempo gasto e na 
acuracidade do estudo. Localiza-se a área de interesse analisando-se os cortes 
ao microscópio óptico e, posteriormente, reapara-se o bloco de modo que ele 
contenha apenas a região de interesse. Este bloco agora é cortado para obtenção 
de cortes ultra-finos. 
 
Procedimentos Práticos 
Utiliza-se uma gilete para a remoção da resina, resultando num bloco cujo 
espécimen adquire uma forma piramidal, e o tamanho final não exceda a 0,3 
mm2 (ou menor). Uma vez reaparados, os blocos são presos ao embolo do ultra-
micrótomo e, com o uso de navalha de vidro e com sua “banheira” cheia de 
água, cortes semi-finos de aproximadamente 0,5 a 1 m de espessura são rea-
lizados. Em seguida, são transferidos para uma lâmina de vidro, secos numa 
placa aquecedora a 60o.C e corados com azul de toluidina a 1% + bórax. Esses 
cortes são examinados ao microscópio óptico para escolha da área de interesse. 
Como descrito acima, os blocos são novamente reaparados, resultando numa 
área extremamente pequena. Cortes ultra-finos, com espessura em torno de 
60 nm são realizados no referido ultra-micrótomo, utilizando-se preferencial-
mente, navalha de diamante. A espessura do corte é determinada por interfe-
rência de cor. 
Coleta dos cortes – os cortes ultra-finos ficam flutuando por sobre a água 
contida na banheira da navalha de diamante e são estirados por vapores de ace-
tona. Em seguida, são coletados com grades metálicas perfuradas (variando de 
100 a 800 mesh). Normalmente, utilizam-se grades de cobre em trabalhos de 
rotina, mas, recomendam-se para trabalhos especiais as de níquel, ouro, platina 
 
32 
e teflon. A perfuração (mesh) das grades mais comumente usadas é a de 200 a 
300 mesh. Uma grade possui um diâmetro externo de 3mm. 
 
Contrastação dos cortes ultra-finos (60 nm) 
A coloração positiva aumenta o poder de dispersão de elétrons por parte dos 
espécimens biológicos. Este aumento é necessário por duas razões: 1. espéci-
mens biológicos são compostos principalmente de elementos de baixo número 
atômico (carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio), os quais possuem um po-
der de dispersão de elétrons relativamente baixo; 2. para a obtenção dos cortes, 
os espécimens estão embebidos em resinas epóxi, as quais são de origem bioló-
gica e assim, possuem os mesmos átomos que os espécimens. Dessa forma, 
existe pouca diferença entre espécimens e resinas quanto ao poder de dispersão 
dos elétrons. Um relativo poder de dispersão de elétrons de um espécimen é 
aumentado pela introdução de metais de átomos pesados (ósmio, urânio e 
chumbo), no tecido ou corte, ou ambos. 
Espécimens podem ser corados durante a fixação (com tetróxido de ósmio), 
antes ou durante a desidratação (com acetato de uranila, em bloco), após a em-
blocagem mas antes da microtomia (com ácido fosfotungstico, PTA) , e/ou após 
cortes ultra-finos (com acetato de uranila e citrato de chumbo). 
 
Procedimentos Práticos 
O método de dupla coloração de cortes ultra-finos com acetato de uranila e 
citrato de chumbo é o mais utilizado. Uma pequena quantidade de pastilhas de 
NaOH é colocada em um dos lados de uma placa de Petri, produzindo uma at-
mosfera livre de CO2. Um pedaço de cera dental é colocado no outro lado da 
placa e servirá de local para a contrastação. A placa de Petri é coberta. Sobre o 
pedaço de cera, cada grade é imersa em uma gota de solução aquosa de acetato 
de uranila a 0,5 a 1%, por cerca de 5 minutos. Durante o tempo de contrastação, 
a atmosfera está livre de CO2. Em seguida, cada grade é lavada com jatos de 
água bi-destilada livre de CO2, utilizando-se uma pisceta plástica. Repete-se esta 
lavagem, 3 ou 4 vezes. 
Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur limpa, duas gotas de citrato de 
chumbo(Reynold, J. Cell Biol., 17: 208 - 1963) são colocadas por sobre a 
placa de cera. Imediatamente, a grade é imersa na gota ou colocada por sobre 
a mesma, com o lado dos cortes voltados para baixo (sobre o corante). O tempo 
de contrastação varia de 5 a 15 minutos e a placa de Petri deve permanecer 
tampada. Em seguida, a grade é lavada vigorosamente com solução a 0,02N de 
NaOH (0,08%) livre de CO2 e água destilada livre de CO2. As grades lavadas são 
secas tocando-as lateralmente em papel de filtro. 
Importante – os cortes não devem tocar o papel de filtro. Alguns pesquisa-
dores recomendam contrastar as grades minutos antes de sua análise ao MET. 
 
Referências Bibliográficas 
1. HAYAT, M.A. – Basic transmission electron microscopy / Academic Press, Inc., pp. 411 / 1986. 
2. JOHANNESSEN, J.V. – Instrumentation and techniques / In “Electron microscopy in human medicine” 
/ vol. 1 / McGraw – Hill, Inc. / pp. 348 / 1978. 
 
33 
 
34 
 
 
35 
Métodos Especiais de Estudos 
 
Objetivos 
01. Definir citoquímica. 
02. Citar os critérios para que uma reação seja considerada citoquímica. 
03. Definir investigação “in situm” e “extra-situm”. 
04. Descrever as bases da reação de Feulgen, o controle de sua especificidade e 
seu uso como método quantitativo na investigação do DNA. 
05. Descrever as bases da reação do PAS (ácido periódico – reativo de Schiff) e 
sua especificidade para evidenciação do glicogênio. 
06. Conceituar reação plasmal. 
07. Citar as principais técnicas consideradas citoquímicas, para evidenciar lipídios 
nos tecidos. 
08. Citar algumas das principais técnicas citoquímicas para evidenciar enzimas. 
09. Descrever as bases dos métodos Imunocitoquímicos. Relacioná-los à análise 
integrada com microscopias especiais. 
10. Descrever os princípios gerais da Radioautografia. 
11. Citar a importância da técnica de Cultura de células (ou tecidos). 
12. Descrever a técnica do Fracionamento celular e Citar sua importância. 
13. Citar as principais técnicas empregadas no estudo citoquímico ultra-estrutu-
ral de macromoléculas biológicas. 
14. Citar as principais técnicas histoquímicas e citoquímicas utilizadas para estu-
dos e diagnósticos em laudos histopatológicos. 
15. Estabelecer comparações e diferenças entre métodos especiais de estudos e 
métodos gerais de estudos. 
 
36 
Membrana Plasmática – Estrutura e Junções 
Celulares 
 
Objetivos 
Membrana plasmática - estrutura 
01. Definir membrana plasmática (MP) e enumerar suas principais funções ge-
rais. 
02. Descrever a importância dos eritrócitos humanos no estudo da MP. 
03. Citar os principais tipos de lipídios da MP. 
04. Citar as principais funções dos lipídios da MP. 
05. Descrever as Bolsas Lipídicas presentes na MP e Citar sua importância. 
06. Explicar, exemplificando, a assimetria da bicamada lipídica na MP e até 
mesmo, em partes de uma mesma MP. 
07. Citar as principais funções dos glicolipídios. 
08. Descrever as possíveis associações das moléculas de proteínas com a bica-
mada lipídica. 
09. Caracterizar as proteínas espectrina, glicoforina e banda 3, presentes nos 
eritrócitos. 
10. Explicar, exemplificando, como uma proteína é restrita a um domínio espe-
cífico da MP e Citar a importância deste fato para a célula. 
11. Definir glicocálice e Citar suas principais funções. 
12. Definir unidade de membrana e Citar sua espessura. 
13. Descrever o modelo do mosaico fluido (Nicolson et al., 1977). 
 
Junções Celulares (trabalho em equipe) 
14. Citar a classificação funcional das junções celulares. 
15. Descrever as junções bloqueadoras (tipo compacta ou de vedação). 
16. Descrever as junções ancoradouras, com sítios de ligação aos filamentos de 
actina: cintos de adesão (célula-célula) e aderentes (célula-matriz). 
17. Descrever as junções ancoradouras, com sítios de ligação aos filamentos in-
termediários: desmossomos (célula-célula) e hemidesmossomos (célula-ma-
triz). 
18. Descrever a junção comunicante, tipo “fenda” (Gap ou comunicante). 
19. Exemplificar alguns complexos juncionais e Citar suas localizações. 
 
37 
Citoesqueleto I e II 
Objetivos 
Introdução ao Citoesqueleto das Células Eucarióticas 
01. Classificar as organelas citoplasmáticas. Definir o critério para classificação 
02. Introduzir: o citoesqueleto nas células procarióticas e nas eucarióticas. 
03. Definir citoesqueleto. Citar suas principais funções. 
04. Citar os principais componentes (proteínas filamentosas) do citoesqueleto. 
 
Filamentos Intermediários 
05. Definir, Localizar e Citar as caracteristicas gerais dos Filamentos Intermedi-
ários (FI). 
06. Explicar a formação do FI como uma estrutura NÃO polarizada. 
07. Definir e caracterizar cada parte de um FI 
08. Citar os principais tipos de FI nas células dos vertebrados. 
09. Descrever a importância dos FI para a estabilidade mecânica das células (re-
sistência à tensão mecânica). 
10. Conceituar e Citar as características gerais da lâmina nuclear. 
11. Caracterizar e Citar a importância do estudo do FI de queratina (tonofila-
mentos). 
 
Microtúbulos 
12. Definir Microtúbulos (MT) e Citar sua constituição. 
13. Descrever resumidamente, a formação do MT. 
14. Citar dois inibidores que atuam na formação dos MT. 
15. Descrever o Centrossomo, principal centro organizador de MT, nas células 
animais. Citar outros centros organizadores de MT. 
16. Explicar a importância da estabilização seletiva dos MT para a polarização 
celular. 
17. Citar as características das duas proteínas motoras, cinesinas e dineínas e 
Explicar o relacionamento das mesmas com a direção do transporte intrace-
lular, via MT. 
 
Organelas Microtubulares 
18. Descrever a ultra-estrutura do centríolo e/ou corpúsculo basal e Citar suas 
funções. 
19. Descrever a ultra-estrutura microtubular axial básica dos cílios e/ou flagelos. 
20. Explicar o movimento dos cílios (batimento ciliar) e dos flagelos (flexão do 
flagelo). 
 
Microfilamentos de Actina 
21. Definir microfilamentos (MF) de actina. 
22. Descrever os mecanismos de polimerização e despolimerização dos MF de 
actina. 
23. Citar os efeitos das drogas, citocalasina e faloidina sobre os MF de actina. 
 
38 
24. Citar a importância das proteínas de ligação à actina. 
25. Descrever o modelo hipotético básico do citoesqueleto para a membrana 
plasmática dos eritrócitos. 
26. Descrever um modelo explicativo para microvilosidades e para contatos fo-
cais. 
27. Esquematizar a unidade contrátil do músculo esquelético. 
28. Baseado no quadro abaixo, explicar as possíveis associações entre a actina 
e as principais classes de proteínas ligadoras a ela. 
 
(Baseado: Fundamentos da Biologia Celular/Alberts, Bruce (et al.)/Ar-
tmed/1a.ed/p.546/ 1999). 
 
 
39 
Secreção Celular I e II 
Objetivos 
01. Definir e Citar os componentes do Sistema de endomembranas. 
02. Sumarizar os compartimentos intracelulares da célula eucariótica envolvidos 
nas rotas, biossintética-secretora e endocítica. 
 
Ribossomos 
03. Definir ribossomo e Citar sua principal função. 
04. Descrever comparativamente, a constituição dos ribossomos eucariotes e dos 
procariotes. 
05. Citar as populações de ribossomos no citoplasma e relacioná-las com regiões 
intensamente basófilas, em certas células. 
06. Definir polirribossomos. 
07. Descrever a biogênese dos ribossomos. 
 
Retículo Endoplasmático 
08. Descrever resumidamente, a proposição evolutiva do aparecimento do retí-
culo endoplasmático e do núcleo. 
09. Definir retículo endoplasmático Rugoso e Liso e Correlacioná-los com os tipos 
celulares em que estão presentes, em grande quantidade. 
10. Definir microssomos e Citar seus tipos e sua importância