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Métodos de Estudo da Célula Aline Gonzaga Cunha TECNOLOGIA DA BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR • Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação; • Microscópio óptico ou microscópio de luz; • Técnicas citoquímicas: localização de diversas moléculas; • Microscópios eletrônicos (resolução). CONFECÇÃO DE CORTES PARA ESTUDO NOS MICROSCÓPIOS ÓPTICO E ELETRÔNICO • Células fixadas e coradas - Melhor demonstração dos seus componentes; • Um preparado ideal deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam quando vivas – artefatos- alterações. 1ªETAPA: FIXAÇÃO • Evitar autólise; • Impedir atividade e proliferação de bactérias; • Endurecer as células; • Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica. Lâminas permanentes GRUPAMENTOS AMÍNICOS DAS PROTEÍNAS GRUPAMENTOS AMÍNICOS DAS PROTEÍNAS FIXADORES MAIS UTILIZADOS EM MICROSCOPIA ELETRÔNICA: • TETRÓXIDO DE ÓSMIO; • GLUTARALDEÍDO. COAGULAM AS PROTEÍNAS PRODUZINDO ALTERAÇÕES MÍNIMAS FORMOL 2ª ETAPA: MICROTOMIA • Cortes em fatias. • O fragmento de tecido fixado deve ser protegido em um material que o envolve e nele penetra; • Inclusão em parafina ou em resinas plásticas especiais- microsc. Óptico: -navalhas de aço; • Inclusão em resinas epóxi- microsc. Eletrônico: - navalhas de vidro ou diamante. 3ª ETAPA: COLORAÇÃO • Quase todas as organelas são transparentes e incolores; • Corantes básicos- grupamento cromóforo é catiônico grupamentos aniônicos (ácidos) Ex; DNA, RNA são basófilos(afinidades por corantes básicos) Azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina. Responsável pela cor • Corantes ácidos- grupamento cromóforo é aniônico grupamentos catiônicos (básicos) Ex; Proteínas citoplasmáticas são acidófilos (afinidades por corantes ácidos) Eosina, Orange G e Fucsina ácida O M ic ro sc ó p io Ó p ti co AUMENTO: OBJ X OCULAR As partes do microscópio Oculares Tubo Asa de transporte Adaptador de iluminação Platina Indicador da Intensidade Luminosa Botão Liga/Desliga Charriot Revólver Presilha Parafuso Macrométrico Parafuso Micrométrico Aumento total Aumento visual total: Aumento da objetiva X Aumento da ocular FINALIDADE DO CONDENSADOR • Chama-se poder de resolução de um sistema óptico a sua capacidade de separar detalhes. Na prática, o poder de resolução é expresso pelo limite de resolução, que é a menor distância que deve existir entre dois ptos para que eles apareçam individualizados; • Riqueza de detalhes- limite de resolução e não pelo aumento dos objetos; • O limite de resolução depende da objetiva, a ocular não pode acrescentar detalhes à imagem. LR: K x comprimento de onda (obj.) AN MICROSCÓPIO DE POLARIZAÇÃO • O microscópio de polarização é semelhante a microscópio de luz, acrescido de dois prismas ou dois discos polaróides, que permitem estudar certos aspectos da organização molecular dos constituintes celulares. • O microscópio de polarização serve para individualizar a estrutura que se quer analisar. Um fragmento de mesentério do rato Sob luz polarizada, as fibras de colágeno exibem intensa birrefringência e aparecem brilhantes ou em amarelo. Aumento médio. Imagem retirada do Livro: JUNQUEIRA & CARNEIRO, Histologia Básica, 10ª ed., Ed.Guanabara Koogan (Pg. 5 - Fig. 1.4) MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE • É empregado no estudo de células vivas. • Conforme a densidade do material, a luz o atravessa com mais ou menos intensidade, diferenciando a coloração do objeto. MICROSCÓPIO CONFOCAL • Iluminação feita por feixes de raios laser; • Soluciona o problema da imagem borrada fornecida pelo microscópio óptico. Construção 3D de Células da Mesoderme de Embriões de Galinha (Gallus gallus) MICROSCÓPIO ELETRÔNICO • Feixe de elétrons, acelerados por diferença de potencial de 60.000 volts, têm um comprimento de onda de 0,005nm; • Dificuldades em se preservar as células e em se obter cortes extremamente finos; COMPONENTES DE UM MICROSC. ELETRÔNICO • Os elétrons são obtidos pelo aquecimento de um filamento de tungstênio- o cátodo- que emite elétrons; • Estruturas elétron-densas: estruturas nas células que não formarão imagem; • Tela de ZnS ou sobre um filme fotográfico. • Trajeto de elétrons é feito no vácuo; • Visualização de células fixadas; • Fixação: Glutaraldeído tamponado a pH 7,2 e com tetróxido de ósmio; • Ósmio atua como contraste- desvio de elétrons; • Espessura: 20-100nm (resina epóxi); • Micrótomos: navalhas de vidro ou diamante. • Além dos contrastes, usa-se também a coloração negativa; • Corante fica entre as estruturas e penetra em suas depressões • Ressaltar a forma dos bacteriófagos. MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA • Usa também um feixe de elétrons; • Fornece imagens tridimensionais, mas não tem alto poder de resolução quanto o microsc. eletrônico, • O material não precisa ser cortado; • Objetos de 1cm ou + podem ser observados inteiros. • Estudo da superfície de células mantidas em cultivo. Citoquímica • Estuda a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células ; • Reação indicativa pela intensidade da cor: conc. da substância a ser analisada; • DNA: Reação de Feulgen (complexo de cor vermelha); • RNA: digestão pela ribonuclease - azul de toluidina (corante básico); • Catecolaminas: reação com formaldeído- produzindo compostos fluorescentes. • Proteínas: identificação de aminoácidos; • Polissacarídeos: PAS (glicogênio)- cor vermelha; • Enzimas: reação substrato-enzima. Imunocitoquímica localiza moléculas protéicas específicas • Reação antígeno-anticorpo. • Imunocitoquímica direta Recentemente ME • Imunocitoquímica indireta (+usada) Por centrifugação é possível obter organelas citoplasmáticas e estudar suas propriedades • Centrifugação com sacarose (mantém a integridade dos componentes celulares e evita a tendência de as organelas aglutinarem-se quando as células se rompem) Partículas separadas contra gradiente de densidade É possível separar as células de um tecido e isolar um determinado tipo celular . Estudo de células vivas e culturas de células animais e vegetais- corantes supravitais- verde jano.
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