Aula 3 absorção molecular CLESIO

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31/08/2016 
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Espectrofotometria de absorção 
molecular - UV/visível 
1 
Introdução à Absorção Molecular 
 Os métodos espectrométricos incluem todos as técnicas baseadas na 
interação entre energia eletromagnética (E) e matéria (M). 
Espectro de onda 
 A interação entre energia radiante e uma substância pode resultar em 
eventos químicos e físicos variados: absorção, emissão, fotodecomposição, 
reflexão, aquecimento, etc. 
2 
Energia eletromagnética ( f ou E ) do comprimento de onda (), da 
frequência (), da velocidade (c), potência (P) ou da intensidade (I) 
c = ., onde c (velocidade da luz) = 300.000 Km/s; v: frequência. Quanto 
menor o comprimento de onda, maior a frequência e a intensidade da 
radiação ionizante. 
Frequência = número de oscilações que a onda faz a cada segundo. 
E = hc/, onde h = constante de Planck. Energia inversamente 
proporcional ao  . 
 
A radiação eletromagnética 
consiste em energia 
propagada em forma de 
ondas. Apresenta 
comprimento de onda 
característico (λ): distância 
entre os ápices; 
Introdução à Absorção Molecular 
Região do espectro 
eletromagnético 
Transições 
Raios Gama Nucleares ( medicina nuclear – tratamento 
câncer) 
Raios X Eletrônicas – quebra de ligação e ionização 
Ultravioleta Eletrônicas 
Visível Eletrônicas 
Infravermelho Vibracionais e Rotacionais 
Micro-ondas Rotacionais 
Ondas de Rádio Spin 
M + h = M* Absorção de radiação eletromagnética 
Introdução à Absorção Molecular 
˃ E 
˂ E 
Absorção de radiação eletromagnética – Transições Eletrônicas 
Absorção molecular depende da estrutura 
eletrônica molecular. 
-Orbitais moleculares: sigma (), pi () e não 
ligante (n). 
- Para cada orbital ligante existe um orbital 
antiligante. 
E 
Ligante  
Ligante  
Não ligante n 
Antiligante * 
Antiligante * 
Transições 
eletrônicas 
 Transições eletrônicas em moléculas com ligações 
simples  requerem  energia (UV distante -   185 nm). 
 Transições eletrônicas em moléculas com grupos 
insaturados  requerem  energia (UV próximo e 
visível - = 200 a 700 nm). 
Espécies contendo elétrons 
sigma,  ou n 
 Transições envolvendo orbitais não ligantes (n): 
• São possíveis na faixa de UV próximo ou visível 
• Elétrons não ligantes para orbitais antiligantes 
• n  * (faixa de 150 a 250 nm) e n  * (faixa de 200 a 700 nm) 5 
Principais grupos cromóforos 
Cromóforo: átomo ou grupos moleculares contendo  e  
de átomo responsáveis pela absorção de luz 
Grupos auxócromos: grupo saturado que quando ligado a 
um cromóforo altera tanto o comprimento de onda como a 
intensidade de absorção Exemplos: OH, NH2 e Cl. 
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 Espectro (varredura): 
determinado pela estrutura 
química da molécula, mas 
influenciado por alterações do pH, 
polaridade do solvente e 
geometria e simetria da moléculas; 
 Solventes usuais: orgânicos, 
água, meios aquosos ácidos ou 
básicos, tampões; 
 Efeitos nos espectros: 
batocrômico: desloca a absorção 
para um λ maior; hipsocrômico: 
desloca a absorção para um λ 
menor; hipercrômico: aumenta 
intensidade de absorção; 
hipocrômico: diminui intensidade 
de absorção. 
Efeito do solvente na absorção 
batocrômico 
hipscrômico 
Porque o pH pode alterar o espectro? 
/nm Cor absorvida Cor transmitida 
(OBSERVADA) 
380-420 Violeta Verde-amarelo 
420-440 Violeta-azul Amarelo 
440-470 Azul Laranja 
470-500 Azul-verde Vermelho 
500-520 Verde Púrpura 
520-550 Verde-amarelo Violeta 
550-580 Amarelo Violeta-azul 
580-620 Laranja Azul 
620-680 Vermelho Azul-verde 
680-780 Púrpura Verde 
Faixa de absorção de uma solução iluminada por uma luz branca - visível 
A absorção depende da natureza da substância (k), da concentração (C) e do 
caminho ótico (L – espessura) 
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 É a técnica mais utilizada em laboratórios químicos e clínico em todo 
mundo; 
 Meio simples para se determinar quantidades diminutas de substâncias; 
 Boa sensibilidade, baixo custo, fácil operação, equipamentos robustos; 
 Sensibilidade: maior sensibilidade (ex. volumétrica C=0,1 mg/ml), 
espectrofotométricos C = 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml. 
 Facilidade de acoplar com outros métodos analíticos e de separação: 
 HPLC-UV/visível = DETECTOR. 
A espectrofotometria é um método espectroscópico que se baseia na 
absorção da radiação nos comprimentos de onda (λ) da região do 
ultravioleta e do visível (200 nm a 800 nm); 
Espectrofotometria UV/visível 
9 
Desvantagens 
Baixa seletividade: baseada na quantidade de energia absorvida ou liberada em 
um comprimento de onda específico. Difícil distinguir duas substâncias que 
absorvem no mesmo comprimento de onda. Ex. FARMACOS DE MESMA CLASSE 
FARMACOLÓGICA : cefalotina, cefalexina e cefpiroma; 
Alternativas: utilização de padrões isolados e conhecimento da absortividade 
molar das substâncias (cálculo matemático) ou utilização de derivação. 
Uso de Padrão*: Compara-se quantidade de luz absorvida pela amostra em 
relação ao padrão (mesma concentração). 
SQR Cefpiroma 
Cefalotina 
Amostra Cefpiroma 
Cefalexina 
* Exceção: utilização da absortividade 
molar ou absortividade específica 
Espectrofotometria UV/visível 
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Leis da Fotometria 
 Quando um raio de energia atravessa determinada solução, a energia incidente 
será sempre de maior intensidade que a energia emergente (transmitida). 
 A atenuação da energia é atribuída a reflexões nas interfaces: 
 - ar, parede da cubeta e a solução; 
 - dispersão por partículas presentes na solução; 
 - absorção de energia. 
1ª Lei da fotometria 
 Estabelece que quando uma energia radiante atravessa uma solução a 
quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento 
 da espessura atravessada; 
 Correlaciona energia e distância. 
Lei de Lambert 
I1/I0 = T 
Log I0/I1 = a . b 
a* = constante característica da solução; 
b = espessura em cm da camada atravessada 
pela luz. 
A = a. b Log I0/I1 = A 
* ε =absortividade molar 
Lei de Beer 
2ª Lei da fotometria 
 Correlaciona energia e concentração; 
 Estabelece que quando a energia incidente atravessa uma solução a 
 quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o 
aumento da concentração da solução 
Log I0/I1 = A 
Log I0/I1 = a . c 
a = constante característica da solução; 
c = concentração da solução atravessada 
pela luz. 
A = a. c 
Lei de Lambert-Beer 
3ª Lei da fotometria 
 
 A partir da combinação de 2 leis anteriores; 
 Correlaciona energia com o caminho ótico e a concentração. 
A = a. b. c Log I0/I1 = a. b. c ou 
 a = A(1%, 1 cm) ou ε 
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T = I1/I0 
T(%) = (I1/I0) x 100 
Transmitância 
Absorbância 
A = - log T 
A = - log (I1/I0) 
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TRANSMITIDA 
INCIDENTE 
Limitações da Lei de Beer 
Limitação Real 
 A lei é válida somente para baixas concentrações; 
 Altas concentrações = interação entre as moléculas; 
 Sofre influência da variação do índice de refração. 
Desvio Químico 
 Surgem quando um analito se dissocia (COMO CORRIGIR?), se associa 
ou reage com um solvente para dar um produto que tem um espectro de 
absorção diferente; 
 Conhecimento do pKa do analito. 
Desvio instrumental 
 A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único 
comprimento de onda (λ); 
 Escolher o λ de máxima absorção, no qual o coeficiente de 
absortividade molar seja constante. 14 
Tipos de equipamentos para medida da radiação UV/visível 
Espectrômetros: geralmente empregam filtro para seleção do λ ; 
 
 - Geralmente cobrem a região do visível (COLORÍMETROS); 
 
 - São simples, robustos e de baixo custo; 
 
 - Podem ser acoplados
a cromatógrafos e outros equipamentos (DETECTORES). 
Espectrofotômetros: empregam monocromadores para a seleção do λ; 
 
 - Geralmente cobrem a região do ultravioleta e do visível; 
 
 - Podem realizar a varredura de espectro (exemplo: 200 nm a 800 nm); 
 
 - Também podem ser acoplados a cromatógrafos e outros equipamentos. 
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Tipos de espectrofotômetros UV/visível 
Espectrofotômetro monofeixe – Leitura em absorbância 
- Ajustar 0% de transmitância (fecha-se o obturador entre a fonte de radiação e 
o detector); 
- Ajustar 100% de transmitância com a solução branco (obturador aberto): 
eliminar a interferência do solvente; 
- Passar para absorbância (0% de A) e determinar a leitura da solução padrão e 
da solução amostra. 
Monofeixe 
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obturador 
Fonte 
Radiação 
luminosa 
Apenas um local para colocar a cubeta 
Tipos de espectrofotômetros UV/visível 
Duplo feixe 
Espelho rotatório 17 
Dois locais para colocar as cubetas 
s 
r 
Fontes de Radiação 
Contínuas 
Lâmpada de deutério (D2): 160 – 380 nm - (UV) 
Lâmpada de tungstênio (W): 350 – 2.200 nm Visível/ IVpróximo 
Características ideais: intensidade da energia 
alta, uniforme e de baixo custo. 
 
Manutenção periódica 
Verificação da Energia. 
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Sistema ótico 
Seletores de comprimentos de onda: podem ser monocromadores ou filtros 
- Função: melhorar a seletividade e a sensibilidade dos equipamentos. 
Seletores de comprimento de onda que restringem a 
radiação incidente para uma banda estreita que é 
absorvida pelo analito. 
19 
1. Filtros de radiação 
 a) Filtros de interferência: transmissão seletiva de uma estreita faixa de λ 
 
 
 
 
 
 
 
 b) Filtros de absorção: absorção de toda a radiação de uma fonte contínua com 
exceção de uma banda estreita – a escolhida para a leitura da amostra. 
 - Limitados a região do visível: isolam bandas com, no mínimo, 50 nm. 
Apresentam menor custo. Ex. placa de vidro colorido que remove parte da 
radiação incidente –absorção. 
Radiação policromática 
Radiação de banda estreita 
Lâmina de vidro 
Camada de dielétrico 
Filme metálico 
2. Monocromadores ou 
policromadores: isolamento de 
bandas mais estreitas que os filtros, 
mais versáteis e mais caros. 
 a) Rede de difração 
 b) Prisma (instrumentos mais 
antigos) 
 
 Fenda de saída: isolar o λ de onda; 
 Largura da banda efetiva: 1 a 20 
nm; 
 Qualidade do monocromador = 
desempenho fotométrico 
Sistema ótico 
Seletores de comprimento de onda que restringem a 
radiação incidente para uma banda estreita que é 
absorvida pelo analito. 
Material Transparência Aplicabilidade 
 
Quartzo 150 - 3000 nm UV / visível 
 ou sílica fundida 
 
Vidro 375 - 2000 nm Visível 
Plástico 380 - 800 nm Visível 
Compartimento de amostra - Cubetas 
POSSO UTILIZAR O VIDRO NA ESPECTROFOTOMERIA NO UV?? 
21 
Detectores 
1) Fototubo 
2) Fotomultiplicador 
 São dispositivos que lêem a energia incidente para produzir elétrons ou calor; 
 OBRIGATORIAMENTE, devem gerar sinal proporcional a energia incidente. 
 Resposta similar ao fototubo; 
 Mais sensível (200 x); 
 Para cada fóton incidente são produzidos 
 105 ou 107 elétrons. 
Ânodo 
dinodos 
Cátodo 
22 
óxido de 
césio ou 
magnésio 
 Resposta fundamentada no efeito fotoelétrico 
em um sistema fotossensível (cátodo); 
 Fotocátodo e ânodo, sob vácuo; 
 A luz extrai, de acordo com a intensidade, 
elétrons que interagem com o ânodo – produz 
corrente. 
Detectores 
3) Estado sólido - fotodiodos 
Dispostos em um chip 
–  incide sobre estes 
 Uso de material semicondutor (constituído de silício); 
 Em presença de energia incidente faz os elétrons livres 
migrarem gerando corrente resultante da intensidade da 
radiação incidente; 
 Realização da leitura. 
Filme fino contendo 1000 unidades ou mais 
de diodos constituídos pelo material 
semicondutor (constituído de silício) 
4) Arranjo de fotodiodos 
Permitem a obtenção do espectro total de 
uma amostra em menos de um segundo. 
(equipamentos mais modernos). 
Sistema detector – arranjo de diodos 
Varredura eletrônica. 
Pontos coletados 
Simultaneamente em 
uma série de fotodiodos 
em um cristal de silício. 
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Dispersão da 
radiação 
policromática 
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 Exatidão de λ: visa garantir um baixo desvio de posicionamento 
do sistema óptico. Métodos de verificação: emissão da linha de 
deutério, xenônio ou mercúrio, método do perclorato de hólmio e 
filtro de óxido de hólmio. 
Calibração do equipamento 
25 
Espectro de emissão da lâmpada de mercúrio 
 Luz espúria (Stray Light): quantidade de luz de λ 
diferente do selecionado que atinge o detector. Causa 
desvios na Lei de Beer-Lambert, reduzindo a linearidade do 
sistema. 
 
 
 Exatidão fotométrica: medida de valores de absorbância 
conhecidos (valor esperado e o valor obtido) - método de 
teste: dicromato de potássio e filtro de vidro cinzento. 
Calibração do equipamento 
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Determinação qualitativa 
Comparação de espectros 
Espectro: gráfico que mostra 
a variação da absorbância 
em relação ao comprimento 
de onda (λ) 
→ Quantidades de energias absorvidas serão diversas, por isso não se 
observa no espectro uma linha de absorção mas sim uma banda 
relativamente larga. 
 
→ Métodos farmacopeicos. 
 27 
Aplicações na área farmácia industrial 
Curva padrão → formada pelos pontos onde o método obedece a lei 
de LAMBERT-BEER 
Plotagem de uma 
solução de concentração 
conhecida versus 
absorbância (A x C). 
y = 0,04804x + 0,00666 
r = 0,99991 
0 
0,2 
0,4 
0,6 
0,8 
1 
1,2 
1,4 
0 5 10 15 20 25 30 
A
b
s
o
rv
â
n
c
ia
 (
m
A
U
) 
Concentração (mg/ml) 
A 
B 
C 
A – Curva muito sensível; 
 
B – Curva 45º - Ideal 
 
C – Curva pouco sensível. 
 Equação da reta y =ax + b (mínimos quadrados) 
Determinação quantitativa na região UV 
28 
Aplicações na área farmácia industrial 
Determinação quantitativa de furosemida 
 
Solução amostra: transferiu-se 20,10 mg da amostra de furosemida para 
balão volumétrico de 50 mL com auxílio de 30 mL de hidróxido de sódio 
(NaOH) 0,1 mol/L. Agitou-se por 10 minutos e após concluir este processo, 
completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Diluiu-se 
1,0 mL da solução resultante para balão volumétrico de 50 mL, completou-se 
o volume com NaOH 0,1 mol/L e homogeneizou-se. Preparou-se solução 
padrão na mesma concentração utilizando as mesmas diluições e solvente 
(pesou-se 19,76 mg). Mediu-se as absorbâncias das soluções resultantes em 
271 nm, utilizando NaOH 0,1 mol/L para ajuste do zero. 
Calcular o conteúdo de furosemida na matéria-prima, a partir das leituras 
obtidas. Leitura obtida com a solução amostra: 0,660; leitura da solução 
padrão: 0,645. 
Determinação quantitativa na região UV 
Cálculo pelo método de normalização de leitura (1 única 
concentração) 
29 
Aplicações na área farmácia industrial 
Resultado: 100,50% 
Determinação quantitativa na região UV 
Utilização dos valores de absortividade porcentual 
Aplicações na área farmácia industrial 
Resultado = 101,59% 
Resultado= 96,81% 
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ANTES DERIVATIZAÇÃO 
APÓS DERIVATIZAÇÃO 
Determinação quantitativa na região visível 
Derivatização – Método extrativo colorimétrico 
Aplicações na área farmácia industrial 
 
 Par iônico formado entre o fármaco e o 
reagente de pareamento iônico (azul 
de bromotimol) é extraído com 
clorofórmio ou diclorometano; 
Determinação quantitativa na região UV 
Determinação da
cafeína em refrigerantes 
32 
Aplicações na área de alimentos 
 Extração da cafeína da matriz em 
meio alcalino com clorofórmio; 
 Leitura da absorbância em 276 nm; 
 Método da curva padrão com 
cinco concentrações. 
Toxicologia Experimental de Alimentos. Oliveira e Olivera, 2010 
Outras aplicações na área alimentícia: furfural em bebidas fermento-destiladas; 
concentração de corantes artificiais em pós para refresco, balas e gelatinas; nitrito 
em carnes; presença de BHA em óleos. 
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu 
conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, 
especialmente triptofano; 
 A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que 
uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL; 
 Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máximo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1 
Comprimento de onda 
A
b
s
o
rt
iv
id
a
d
e
 m
o
la
r,
 e
 
Determinação quantitativa na região ultravioleta 
Aplicações na análises clínicas 
Quantificação de proteínas totais 
Determinação quantitativa na região visível 
Métodos de Derivatização 
Aplicações na análises clínicas 
 Determinação de glicose pelo método da O-toluidina 
 
Formação de um complexo azulado e leitura entre 600 nm a 650 nm; 
Determinação quantitativa na região visível 
Métodos de Derivatização 
Aplicações na análises clínicas 
 Determinação de proteínas totais pelo método de biureto 
Formação de um complexo como o corante e leitura entre 600 e 650 nm; 
 Determinação de albumina sérica pelo método do verde de bromocresol 
Formação de um complexo e leitura em 545 nm; 
OUTROS: determinação de ureia, ácido úrico, amônia, amilase, fosfatase 
ácida, aminotransferases.... 
Referências 
VINDADÉ, M.E.C.; VINADÉ, E.R.C. Métodos espectroscópicos de análise 
quantitativa. Santa Maria-RS: Editora da Universidade, 2005. 
 
HARRIS, D. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC Editora, 
2001. 
 
SKOOG, D.A. Princípios de Análise Instrumental. 5. ed., Porto Alegre: Editora 
Bookman, 2002. 
 
BACCAN, N., ANDRADE, J. C., GODINHO, O., BARONE, J. S. Química Analítica 
Quantitativa Elementar. 3. ed. São Paulo: Editora Edgard Blücher Ltda, 2001. 
 
HOLLER, J. F., SKOOG, D. A., CROUCH, S. R. Princípios em Análise Instrumental. 
6. ed. Editora Bookman, Porto Alegre, 2009. 
 
OLIVEIRA, M.V.P. Aplicações de estudos bioquímicos quantitativos em ciências 
biológicas e da saúde. Disponível em: 
http://www.fara.edu.br/sipe/index.php/renefara/article/viewFile/54/44 36