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31/08/2016 1 Espectrofotometria de absorção molecular - UV/visível 1 Introdução à Absorção Molecular Os métodos espectrométricos incluem todos as técnicas baseadas na interação entre energia eletromagnética (E) e matéria (M). Espectro de onda A interação entre energia radiante e uma substância pode resultar em eventos químicos e físicos variados: absorção, emissão, fotodecomposição, reflexão, aquecimento, etc. 2 Energia eletromagnética ( f ou E ) do comprimento de onda (), da frequência (), da velocidade (c), potência (P) ou da intensidade (I) c = ., onde c (velocidade da luz) = 300.000 Km/s; v: frequência. Quanto menor o comprimento de onda, maior a frequência e a intensidade da radiação ionizante. Frequência = número de oscilações que a onda faz a cada segundo. E = hc/, onde h = constante de Planck. Energia inversamente proporcional ao . A radiação eletromagnética consiste em energia propagada em forma de ondas. Apresenta comprimento de onda característico (λ): distância entre os ápices; Introdução à Absorção Molecular Região do espectro eletromagnético Transições Raios Gama Nucleares ( medicina nuclear – tratamento câncer) Raios X Eletrônicas – quebra de ligação e ionização Ultravioleta Eletrônicas Visível Eletrônicas Infravermelho Vibracionais e Rotacionais Micro-ondas Rotacionais Ondas de Rádio Spin M + h = M* Absorção de radiação eletromagnética Introdução à Absorção Molecular ˃ E ˂ E Absorção de radiação eletromagnética – Transições Eletrônicas Absorção molecular depende da estrutura eletrônica molecular. -Orbitais moleculares: sigma (), pi () e não ligante (n). - Para cada orbital ligante existe um orbital antiligante. E Ligante Ligante Não ligante n Antiligante * Antiligante * Transições eletrônicas Transições eletrônicas em moléculas com ligações simples requerem energia (UV distante - 185 nm). Transições eletrônicas em moléculas com grupos insaturados requerem energia (UV próximo e visível - = 200 a 700 nm). Espécies contendo elétrons sigma, ou n Transições envolvendo orbitais não ligantes (n): • São possíveis na faixa de UV próximo ou visível • Elétrons não ligantes para orbitais antiligantes • n * (faixa de 150 a 250 nm) e n * (faixa de 200 a 700 nm) 5 Principais grupos cromóforos Cromóforo: átomo ou grupos moleculares contendo e de átomo responsáveis pela absorção de luz Grupos auxócromos: grupo saturado que quando ligado a um cromóforo altera tanto o comprimento de onda como a intensidade de absorção Exemplos: OH, NH2 e Cl. 6 31/08/2016 2 Espectro (varredura): determinado pela estrutura química da molécula, mas influenciado por alterações do pH, polaridade do solvente e geometria e simetria da moléculas; Solventes usuais: orgânicos, água, meios aquosos ácidos ou básicos, tampões; Efeitos nos espectros: batocrômico: desloca a absorção para um λ maior; hipsocrômico: desloca a absorção para um λ menor; hipercrômico: aumenta intensidade de absorção; hipocrômico: diminui intensidade de absorção. Efeito do solvente na absorção batocrômico hipscrômico Porque o pH pode alterar o espectro? /nm Cor absorvida Cor transmitida (OBSERVADA) 380-420 Violeta Verde-amarelo 420-440 Violeta-azul Amarelo 440-470 Azul Laranja 470-500 Azul-verde Vermelho 500-520 Verde Púrpura 520-550 Verde-amarelo Violeta 550-580 Amarelo Violeta-azul 580-620 Laranja Azul 620-680 Vermelho Azul-verde 680-780 Púrpura Verde Faixa de absorção de uma solução iluminada por uma luz branca - visível A absorção depende da natureza da substância (k), da concentração (C) e do caminho ótico (L – espessura) 8 É a técnica mais utilizada em laboratórios químicos e clínico em todo mundo; Meio simples para se determinar quantidades diminutas de substâncias; Boa sensibilidade, baixo custo, fácil operação, equipamentos robustos; Sensibilidade: maior sensibilidade (ex. volumétrica C=0,1 mg/ml), espectrofotométricos C = 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml. Facilidade de acoplar com outros métodos analíticos e de separação: HPLC-UV/visível = DETECTOR. A espectrofotometria é um método espectroscópico que se baseia na absorção da radiação nos comprimentos de onda (λ) da região do ultravioleta e do visível (200 nm a 800 nm); Espectrofotometria UV/visível 9 Desvantagens Baixa seletividade: baseada na quantidade de energia absorvida ou liberada em um comprimento de onda específico. Difícil distinguir duas substâncias que absorvem no mesmo comprimento de onda. Ex. FARMACOS DE MESMA CLASSE FARMACOLÓGICA : cefalotina, cefalexina e cefpiroma; Alternativas: utilização de padrões isolados e conhecimento da absortividade molar das substâncias (cálculo matemático) ou utilização de derivação. Uso de Padrão*: Compara-se quantidade de luz absorvida pela amostra em relação ao padrão (mesma concentração). SQR Cefpiroma Cefalotina Amostra Cefpiroma Cefalexina * Exceção: utilização da absortividade molar ou absortividade específica Espectrofotometria UV/visível 10 Leis da Fotometria Quando um raio de energia atravessa determinada solução, a energia incidente será sempre de maior intensidade que a energia emergente (transmitida). A atenuação da energia é atribuída a reflexões nas interfaces: - ar, parede da cubeta e a solução; - dispersão por partículas presentes na solução; - absorção de energia. 1ª Lei da fotometria Estabelece que quando uma energia radiante atravessa uma solução a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da espessura atravessada; Correlaciona energia e distância. Lei de Lambert I1/I0 = T Log I0/I1 = a . b a* = constante característica da solução; b = espessura em cm da camada atravessada pela luz. A = a. b Log I0/I1 = A * ε =absortividade molar Lei de Beer 2ª Lei da fotometria Correlaciona energia e concentração; Estabelece que quando a energia incidente atravessa uma solução a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentração da solução Log I0/I1 = A Log I0/I1 = a . c a = constante característica da solução; c = concentração da solução atravessada pela luz. A = a. c Lei de Lambert-Beer 3ª Lei da fotometria A partir da combinação de 2 leis anteriores; Correlaciona energia com o caminho ótico e a concentração. A = a. b. c Log I0/I1 = a. b. c ou a = A(1%, 1 cm) ou ε 12 31/08/2016 3 T = I1/I0 T(%) = (I1/I0) x 100 Transmitância Absorbância A = - log T A = - log (I1/I0) 13 TRANSMITIDA INCIDENTE Limitações da Lei de Beer Limitação Real A lei é válida somente para baixas concentrações; Altas concentrações = interação entre as moléculas; Sofre influência da variação do índice de refração. Desvio Químico Surgem quando um analito se dissocia (COMO CORRIGIR?), se associa ou reage com um solvente para dar um produto que tem um espectro de absorção diferente; Conhecimento do pKa do analito. Desvio instrumental A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de onda (λ); Escolher o λ de máxima absorção, no qual o coeficiente de absortividade molar seja constante. 14 Tipos de equipamentos para medida da radiação UV/visível Espectrômetros: geralmente empregam filtro para seleção do λ ; - Geralmente cobrem a região do visível (COLORÍMETROS); - São simples, robustos e de baixo custo; - Podem ser acoplados a cromatógrafos e outros equipamentos (DETECTORES). Espectrofotômetros: empregam monocromadores para a seleção do λ; - Geralmente cobrem a região do ultravioleta e do visível; - Podem realizar a varredura de espectro (exemplo: 200 nm a 800 nm); - Também podem ser acoplados a cromatógrafos e outros equipamentos. 15 Tipos de espectrofotômetros UV/visível Espectrofotômetro monofeixe – Leitura em absorbância - Ajustar 0% de transmitância (fecha-se o obturador entre a fonte de radiação e o detector); - Ajustar 100% de transmitância com a solução branco (obturador aberto): eliminar a interferência do solvente; - Passar para absorbância (0% de A) e determinar a leitura da solução padrão e da solução amostra. Monofeixe 16 obturador Fonte Radiação luminosa Apenas um local para colocar a cubeta Tipos de espectrofotômetros UV/visível Duplo feixe Espelho rotatório 17 Dois locais para colocar as cubetas s r Fontes de Radiação Contínuas Lâmpada de deutério (D2): 160 – 380 nm - (UV) Lâmpada de tungstênio (W): 350 – 2.200 nm Visível/ IVpróximo Características ideais: intensidade da energia alta, uniforme e de baixo custo. Manutenção periódica Verificação da Energia. 18 31/08/2016 4 Sistema ótico Seletores de comprimentos de onda: podem ser monocromadores ou filtros - Função: melhorar a seletividade e a sensibilidade dos equipamentos. Seletores de comprimento de onda que restringem a radiação incidente para uma banda estreita que é absorvida pelo analito. 19 1. Filtros de radiação a) Filtros de interferência: transmissão seletiva de uma estreita faixa de λ b) Filtros de absorção: absorção de toda a radiação de uma fonte contínua com exceção de uma banda estreita – a escolhida para a leitura da amostra. - Limitados a região do visível: isolam bandas com, no mínimo, 50 nm. Apresentam menor custo. Ex. placa de vidro colorido que remove parte da radiação incidente –absorção. Radiação policromática Radiação de banda estreita Lâmina de vidro Camada de dielétrico Filme metálico 2. Monocromadores ou policromadores: isolamento de bandas mais estreitas que os filtros, mais versáteis e mais caros. a) Rede de difração b) Prisma (instrumentos mais antigos) Fenda de saída: isolar o λ de onda; Largura da banda efetiva: 1 a 20 nm; Qualidade do monocromador = desempenho fotométrico Sistema ótico Seletores de comprimento de onda que restringem a radiação incidente para uma banda estreita que é absorvida pelo analito. Material Transparência Aplicabilidade Quartzo 150 - 3000 nm UV / visível ou sílica fundida Vidro 375 - 2000 nm Visível Plástico 380 - 800 nm Visível Compartimento de amostra - Cubetas POSSO UTILIZAR O VIDRO NA ESPECTROFOTOMERIA NO UV?? 21 Detectores 1) Fototubo 2) Fotomultiplicador São dispositivos que lêem a energia incidente para produzir elétrons ou calor; OBRIGATORIAMENTE, devem gerar sinal proporcional a energia incidente. Resposta similar ao fototubo; Mais sensível (200 x); Para cada fóton incidente são produzidos 105 ou 107 elétrons. Ânodo dinodos Cátodo 22 óxido de césio ou magnésio Resposta fundamentada no efeito fotoelétrico em um sistema fotossensível (cátodo); Fotocátodo e ânodo, sob vácuo; A luz extrai, de acordo com a intensidade, elétrons que interagem com o ânodo – produz corrente. Detectores 3) Estado sólido - fotodiodos Dispostos em um chip – incide sobre estes Uso de material semicondutor (constituído de silício); Em presença de energia incidente faz os elétrons livres migrarem gerando corrente resultante da intensidade da radiação incidente; Realização da leitura. Filme fino contendo 1000 unidades ou mais de diodos constituídos pelo material semicondutor (constituído de silício) 4) Arranjo de fotodiodos Permitem a obtenção do espectro total de uma amostra em menos de um segundo. (equipamentos mais modernos). Sistema detector – arranjo de diodos Varredura eletrônica. Pontos coletados Simultaneamente em uma série de fotodiodos em um cristal de silício. 24 Dispersão da radiação policromática 31/08/2016 5 Exatidão de λ: visa garantir um baixo desvio de posicionamento do sistema óptico. Métodos de verificação: emissão da linha de deutério, xenônio ou mercúrio, método do perclorato de hólmio e filtro de óxido de hólmio. Calibração do equipamento 25 Espectro de emissão da lâmpada de mercúrio Luz espúria (Stray Light): quantidade de luz de λ diferente do selecionado que atinge o detector. Causa desvios na Lei de Beer-Lambert, reduzindo a linearidade do sistema. Exatidão fotométrica: medida de valores de absorbância conhecidos (valor esperado e o valor obtido) - método de teste: dicromato de potássio e filtro de vidro cinzento. Calibração do equipamento 26 Determinação qualitativa Comparação de espectros Espectro: gráfico que mostra a variação da absorbância em relação ao comprimento de onda (λ) → Quantidades de energias absorvidas serão diversas, por isso não se observa no espectro uma linha de absorção mas sim uma banda relativamente larga. → Métodos farmacopeicos. 27 Aplicações na área farmácia industrial Curva padrão → formada pelos pontos onde o método obedece a lei de LAMBERT-BEER Plotagem de uma solução de concentração conhecida versus absorbância (A x C). y = 0,04804x + 0,00666 r = 0,99991 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 5 10 15 20 25 30 A b s o rv â n c ia ( m A U ) Concentração (mg/ml) A B C A – Curva muito sensível; B – Curva 45º - Ideal C – Curva pouco sensível. Equação da reta y =ax + b (mínimos quadrados) Determinação quantitativa na região UV 28 Aplicações na área farmácia industrial Determinação quantitativa de furosemida Solução amostra: transferiu-se 20,10 mg da amostra de furosemida para balão volumétrico de 50 mL com auxílio de 30 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol/L. Agitou-se por 10 minutos e após concluir este processo, completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Diluiu-se 1,0 mL da solução resultante para balão volumétrico de 50 mL, completou-se o volume com NaOH 0,1 mol/L e homogeneizou-se. Preparou-se solução padrão na mesma concentração utilizando as mesmas diluições e solvente (pesou-se 19,76 mg). Mediu-se as absorbâncias das soluções resultantes em 271 nm, utilizando NaOH 0,1 mol/L para ajuste do zero. Calcular o conteúdo de furosemida na matéria-prima, a partir das leituras obtidas. Leitura obtida com a solução amostra: 0,660; leitura da solução padrão: 0,645. Determinação quantitativa na região UV Cálculo pelo método de normalização de leitura (1 única concentração) 29 Aplicações na área farmácia industrial Resultado: 100,50% Determinação quantitativa na região UV Utilização dos valores de absortividade porcentual Aplicações na área farmácia industrial Resultado = 101,59% Resultado= 96,81% 31/08/2016 6 31 ANTES DERIVATIZAÇÃO APÓS DERIVATIZAÇÃO Determinação quantitativa na região visível Derivatização – Método extrativo colorimétrico Aplicações na área farmácia industrial Par iônico formado entre o fármaco e o reagente de pareamento iônico (azul de bromotimol) é extraído com clorofórmio ou diclorometano; Determinação quantitativa na região UV Determinação da cafeína em refrigerantes 32 Aplicações na área de alimentos Extração da cafeína da matriz em meio alcalino com clorofórmio; Leitura da absorbância em 276 nm; Método da curva padrão com cinco concentrações. Toxicologia Experimental de Alimentos. Oliveira e Olivera, 2010 Outras aplicações na área alimentícia: furfural em bebidas fermento-destiladas; concentração de corantes artificiais em pós para refresco, balas e gelatinas; nitrito em carnes; presença de BHA em óleos. A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano; A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL; Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máximo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1 Comprimento de onda A b s o rt iv id a d e m o la r, e Determinação quantitativa na região ultravioleta Aplicações na análises clínicas Quantificação de proteínas totais Determinação quantitativa na região visível Métodos de Derivatização Aplicações na análises clínicas Determinação de glicose pelo método da O-toluidina Formação de um complexo azulado e leitura entre 600 nm a 650 nm; Determinação quantitativa na região visível Métodos de Derivatização Aplicações na análises clínicas Determinação de proteínas totais pelo método de biureto Formação de um complexo como o corante e leitura entre 600 e 650 nm; Determinação de albumina sérica pelo método do verde de bromocresol Formação de um complexo e leitura em 545 nm; OUTROS: determinação de ureia, ácido úrico, amônia, amilase, fosfatase ácida, aminotransferases.... Referências VINDADÉ, M.E.C.; VINADÉ, E.R.C. Métodos espectroscópicos de análise quantitativa. Santa Maria-RS: Editora da Universidade, 2005. HARRIS, D. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC Editora, 2001. SKOOG, D.A. Princípios de Análise Instrumental. 5. ed., Porto Alegre: Editora Bookman, 2002. BACCAN, N., ANDRADE, J. C., GODINHO, O., BARONE, J. S. Química Analítica Quantitativa Elementar. 3. ed. São Paulo: Editora Edgard Blücher Ltda, 2001. HOLLER, J. F., SKOOG, D. A., CROUCH, S. R. Princípios em Análise Instrumental. 6. ed. Editora Bookman, Porto Alegre, 2009. OLIVEIRA, M.V.P. Aplicações de estudos bioquímicos quantitativos em ciências biológicas e da saúde. Disponível em: http://www.fara.edu.br/sipe/index.php/renefara/article/viewFile/54/44 36
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