Aula 4 emissão molecular CLESIO

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

22/09/2016 
1 
Emissão Molecular 
Fluorescência 
1 
Prof. Clésio Paim 
 Átomos no estado fundamental absorvem radiação ultravioleta ou 
visível; 
 
 Passam ao estado excitado; 
 
 Quando retornam ao estado fundamental – podem emitir radiação 
que é medida pelo equipamento. 
Fundamento da emissão molecular 
conversão interna, 
externa e energia 
vibracional 
+ 
Radiação 
UV/visível 
Transições Eletrônicas 
Fundamento da emissão molecular 
3 
E 
Ligante  
Ligante  
Não ligante n 
Antiligante * 
Antiligante * 
Luminescência molecular 
Fosforescência Fluorescência 
Quimiluminescência Fotoluminescência 
Fluorescência: as transições eletrônicas NÃO envolvem mudança do spin 
eletrônico, tempo de vida curta (10-10 a 10-5 segundos). 
 
Fosforescência: as transições eletrônicas envolvem mudança do spin 
eletrônico, tempo de vida mais longo (10-5 até segundos ). 
Emissão de radiação 
por espécie formada 
em reação química 
Fundamento da emissão molecular 
4 
5 
S0 = fundamental; 
S1 = estado singlete; 
T = estado triplete; 
R = relaxamento vibracional. 
Fundamento da emissão molecular 
Conversão interna e intersistemas: 
processos não radiativos 
Relaxamento vibracional: energia vibracional 
transferida para outras moléculas (colisões) - 
liberação de energia como calor 
Estado fundamental 
singleto 
Estado excitado 
singleto 
Estado excitado 
tripleto metaestável 
Dois elétrons por 
orbital molecular 
 
Estado emparelhado 
singleto 
Spin Eletrônico 
Fluorescência Fosforescência 
São paralelos 
 
Direção do spin 
Fundamento da emissão molecular 
Placas de transito, uniforme garis Pulseiras de festa (sulfeto de Zn) 
22/09/2016 
2 
7 
Fenantreno 
Fundamento da emissão molecular 
Relação energia x comprimento de onda 
Na maioria dos casos a fotoluminescência ocorre em  maiores que os 
da excitação. 
Espectros de excitação e emissão 
do quinino 
 No entanto, número de métodos que envolve a fluorescência é 
muito maior que as aplicações propostas para a fosforescência e 
quimiluminescência. 
 Métodos que podem ser utilizados como detectores em 
cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar; 
Fundamento da emissão molecular 
8 
Métodos de fotoluminescência: menor aplicação em análise 
quantitativa que os métodos de absorção (muitas moléculas 
absorvem radiação UV e visível, mas não apresentam 
fotoluminescência); 
Estados excitados são susceptíveis à 
desativação pelas colisões e outros processos 
Rendimento Quântico (f) 
 É a fração da radiação incidente que é reemetida como 
fluorescência ou fosforescência em um determinado λ; 
 f = n° de fótons emitido / n° de fótons absorvido; 
 Quanto mais próximo da unidade (valor:1), maior é a fosfo ou 
fluorescência; 
 Valores próximos de zero: não fluorescem. 
Tipos de transição eletrônica 
 Comprimentos de onda () menores que 250 nm dificilmente resultam em 
 fluorescência   * (baixo , alta energia) 
Fluorescência   * (estado singleto excitado) 
Variáveis que afetam a fluorescência e a fosforescência 
Tempo de vida dos estados 
excitados são pequenos (sem 
inversão) e os processos de 
desativação são menos 
prováveis. 
Fosforescência n  * (estado tripleto excitado - menos susceptível a 
 desativação) 
Efeitos de temperatura e solvente 
Temperaturas alta e baixa viscosidade do solvente: aumento 
das colisões entre os elétrons e elevação do número de transições 
externas; 
 
 Presença de átomos pesados na molécula (iodo, bromo); 
Diminuição da fluorescência 
Variáveis que afetam a fluorescência e a fosforescência 
10 
Mudança de spin 
Condições que tendem a reduzir o número de colisões entre as partículas 
(baixa temperatura e alta viscosidade) geralmente levam a um aumentam 
da fluorescência. 
SN
H
O
N
 A maioria dos hidrocarbonetos heteroaromáticos não substituídos : 
Não apresentam fluorescência 
Pirrol Tiofeno Furano Piridina 
  * 
 Geralmente a fluorescência mais intensa é observada em 
compostos contendo grupos aromáticos: 
 Estruturas alifáticas e carbonilas alicíclicas podem apresentar 
fluorescência em menor grau que as aromáticas. 
Fluorescência e estrutura química 
Compostos heterocíclicos 
nitrogenados: transição de energia 
mais baixa envolve transições n-π 
(fosforescência). 
N
N
N
H
 Estruturas aromáticas bifundidas (condensadas) apresentam 
fluorescência 
A substituição do anel causa deslocamento de  
máximos de absorção e mudanças nos picos de 
emissão de fluorescência. 
Indol Isoquinolina Quinolina 
Fluorescência e estrutura química 
12 
22/09/2016 
3 
benzeno Ácido benzoico 
 Substituição de um grupo carboxílico ou carbonílico em anel 
aromático 
Intensidade relativa da 
fluorescência = 10 
 Inibição da fluorescência: energia de transição n – π* é menor do 
que a energia π – π* (rendimento da fluorescência em sistemas n – π* 
é geralmente baixo). 
Fluorescência e estrutura química 
13 
Intensidade relativa da 
fluorescência = 3 
Composto Comprimento de onda da 
fluorescência (nm) 
Intensidade relativa da 
fluorescência 
Benzeno 270 – 310 10 
Tolueno 270 – 320 17 
Propilbenzeno 270 – 320 17 
Bromobenzeno 290 – 380 5 
Iodobenzeno - 0 
Nitrobenzeno - 0 
Inserção de grupos substituintes no 
anel benzeno 
Efeito da substituição na fluorescência do benzeno 
14 
Alteração da eficiência quântica 
Moléculas grandes – cruzamento intersistema para o estado tripleto 
Efeito de rigidez estrutural 
fluoreno bifenil 
 A fluorescência é favorecida em moléculas estruturalmente rígidas. 
Eficiência quântica 1,0 Eficiência quântica 0,2 
 Moléculas com estruturas mais flexíveis podem sofrer vibrações de 
baixa frequência com perda de energia; 
 RIGIDEZ = diminui a velocidade de relaxação não radiativa. 
Fluorescência e estrutura química 
15 
N+
O
*
Zn 
Agentes quelantes 
orgânicos 
complexados com um 
íon metálico 
Aumentam a fluorescência 
A 8-hidroxiquinolina apresenta menor fluorescência do que o 
complexo de Zn; 
Complexo com Zn: molécula mais rígida – impede a desativação 
não radioativa (choques entre as moléculas). 
Fluorescência e estrutura química 
16 
 A potência de emissão de fluorescência (F) é proporcional a 
potência radiante do feixe de excitação absorvido pelo sistema. 
F = 2,303 f K’’ A P 
Onde: 
 f é a eficiência quântica; 
 K’’ é a constante dependente de 
 geometria (ângulo); 
A é a absorbância; 
P é a radiação de emissão. 
 A potência da fluorescência de uma solução deve ser linear com 
a concentração de uma amostra; 
 Concentração elevada de analito provoca colisões entre 
espécies e formação de complexos, os quais são interferentes em 
análises quantitativas. 
Efeito da concentração na fluorescência 
17 18 
Métodos por fluorescência 
22/09/2016 
4 
Características: 
 
 Alta sensibilidade; 
 
 Limite de detecção: 0,001 ng (1 pg) – 0,01 ng (UV: 0,1 a 1 ng); 
 
 Intervalo de resposta linear para soluções diluídas - A < 0,05; 
 
 Interferências de matriz são relevantes (alta sensibilidade); 
 
 Poucas substâncias exibem fluorescência (derivação); 
 
 Utilizados como detectores para cromatografia líquida de alta 
eficiência e eletroforese capilar. 
Método por fluorescência 
19 
 Similares aos equipamentos de absorção molecular; 
 
 Tipos: fluorímetros ou espectrofluorímetros. 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
 Fluorímetros: quando são empregados apenas filtros; 
 

Espectrofluorímetros: empregam dois monocromadores (um 
para excitação e outro emissão) ou podem ser híbridos (filtro e 
monocromador); 
 - Permitem a produção de espectro de excitação ou de 
emissão de fluorescência. 
São utilizados como 
detectores em equipamentos 
de CLAE e ELETROFORESE 
CAPILAR 
 Fluorímetro ou Espectrofluorímetro 
Equipamentos 
Geometria do ângulo: 
minimiza as 
contribuições do 
espalhamento da 
radiação intensa da 
fonte. 
Método por fluorescência 
22 
- Intensidade de emissão é muito menor do que a intensidade da 
radiação de excitação 
- Equipamento de duplo feixe 
Equipamentos: Espectrofluorímetro 
 
Método por fluorescência 
23 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
24 
 Microscópio de fluorescência 
FONTE DE 
RADIAÇÃO 
ocular 
1 – Primeiro filtro de corte: 
deixa passar luz azul de λ 
entre 450 e 490 nm 
3 – Segundo filtro de corte: elimina 
sinais de fluorescência não desejada e 
deixa passar emissão de λ entre 520 e 
560 nm 
2 – Espelho: reflete a luz com λ inferior 
a 510 nm e transmite luz de λ superior 
a 510 nm 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
22/09/2016 
5 
Fontes de radiação 
• Lâmpadas de vapor de mercúrio de baixa pressão com determinados 
λ (254, 302, 313, 546, 578, 691, 773 nm), equipada com janela de sílica 
fundida. 
• Lâmpadas de xenônio de alta pressão (75 - 450W) 
 (emissão contínua 300 - 13000 nm) 
 
• Diodos emissores de Luz 
 - Emitem radiação em 450 – 475 nm. 
 - Adequados a alguns fluoróforos (mais específicos) 
• Lasers 
- Mais caros e menos usados que as lâmpadas 
- Importantes em baixas concentrações do analito 
Sistema óptico 
• Filtros (absorção e interferência) 
• Monocromadores 
25 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
Células de medida (cubetas ou célula de fluxo) 
 
• Cilíndricas ou retangulares; 
• Material utilizado: vidro, sílica e quartzo; 
• Pequenos volumes de amostra; 
• Alguns equipamentos podem apresentar controle de temperatura. 
Detectores 
 
• Fotomultiplicadoras; 
 
• Arranjos de sensores (diodos). 
26 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
Sensibilidade do detector de fluorescência acoplado a CLAE 
 
-Elevada sensibilidade 
 
-Exemplo: análise de antraceno; 
 
- 
 
 
Exemplo: detector de fluorescência Shimadzu® 
Uma relação sinal/ruído 
(S/N) igual a 21,5 foi 
alcançada para uma 
injeção de 10,48 fg de 
antraceno, com limite de 
detecção de apenas 1,5 fg 
(S/N= 3). 
1 fentograma = 10-15 g 
Equipamentos 
Método por fluorescência 
Métodos Quantitativos baseados em fluorescência 
 
 Métodos Diretos: detecção direta do analito ou detecção da reação 
de complexação da amostra com agente complexante; 
 
 Método indireto: análise da redução da fluorescência do agente 
fluorescente (supressão); 
- Agente fluorescente + amostra =  fluorescência (medida que é 
quantificada). 
Aplicações de modo geral: fármacos, ânions, proteínas, 
vitaminas, alcaloides, esteroides, flavonoides, identificação da 
origem de petróleo, entre outros. 
28 
Aplicações 
Método por fluorescência 
Método quantitativos para determinação de etinilestradiol 
29 
Dose = 35 μg 
Dissolução = 1 dose / 500 ml 
[ ] = 0,07 μg/ml ou 70 ng/ml 
Aplicações na indústria farmacêutica 
Método por fluorescência 
Determinação de histamina em peixes 
Formação da histamina 
(Descarboxilases exógenas 
produzidas por micro-
organismos 
Processo de extração e purificação (troca-iônica) 
da histamina 
Excitação: 350 nm 
Emissão: 444 nm 
Extração da matriz 
Reação com agentes de 
fluorescência 
Aplicações na indústria de alimentos 
Método por fluorescência 
MO 
22/09/2016 
6 
Aplicações na análise clínica – testes imunológicos 
Método por fluorescência 
Íon Reagente Absorção 
(nm) 
Fluorescência 
(nm) 
Sensibilidade 
(g/mL) 
Al3+ Alizarina garnet R 470 500 0,007 
F- Alizarina garnet R 
(+Al) 
470 500 0,001 
Li+ 8-hidroxiquinolina 370 580 0,2 
Sn4+ Flavonol 400 470 0,1 
Necessidade de reagentes de 
complexação (derivatizantes) 
Determinações de espécies inorgânicas 
Método por fluorescência 
33 
Fosforescência 
Alguns espectrofluorímetros realizam medidas de 
fosforescência: 
Equipamento - Fosforímetros 
34 
Procedimento de análise: 
Irradia a amostra (lâmpada de 
xenônio) e após período de tempo 
realiza-se a medida da amostra – 
tempo de atraso para diferenciar 
a fluorescência da fosforescência. 
35 
Quimiluminescência 
Quimiluminescência 
Bioluminescência (energia 
química transformada em 
energia luminosa) - bactérias, 
fungos, plantas e animais 
(vagalumes) 
36 
Reação química que produz 
uma espécie eletronicamente 
excitada que emite luz quando 
retorna ao seu estado 
fundamental 
Produção de luz está principalmente na 
reação em que uma enzima, denominada 
luciferase, oxida o substrato da proteína 
luciferina, a qual fica excitada e libera a 
energia química na forma de energia 
luminosa. 
22/09/2016 
7 
xxxx 
Geralmente a quimiluminescência usa 
equipamentos simples com um 
fotomultiplicador (não necessita de fonte 
para excitação da amostra) 
Equipamentos 
37 
O sinal típico é dependente do 
tempo e aumenta rapidamente 
para um máximo à medida que a 
mistura do reagente para o 
analito se completa. 
Análise quantitativa: sinal geralmente integrado por um tempo fixo e 
comparado com padrões tratados de forma idêntica 
Quimiluminescência 
Leitura de vestígios de sangue em local de crime. 
Luminol 
3-aminoftalato 
máx = 425 nm 
Ativação do 
luminol com um 
oxidante 
Fe+2 
Aplicação – toxicologia forense 
Quimiluminescência 
Análise de gases 
Determinação de monóxido de nitrogênio (NO) que reage com ozônio (O3). 
NO + O3 NO2* + O2 
NO2* NO + hv (λ = 600 a 2800 nm - emissão de luz). 
Determinação de 
poluentes 
atmosféricos 
Quimiluminescência 
Aplicação na análise ambiental 
Referências 
HOLLER, J. F., SKOOG, D. A., CROUCH, S. R. Princípios em 
Análise Instrumental. 6. ed., Editora Bookman, Porto Alegre, 
2009. 
 
HARRIS, D. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de 
Janeiro: LTC Editora, 2001. 
 
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J.; CROUCH, S.R. 
Fundamentos de Química Analítica. 8. ed., Editora: Cengage 
Learning, São Paulo, 2006. 
 
40