10 Replicação

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Luciana Veiga 
Universidade Federal da Bahia - UFBA 
Instituto de Biologia 
Campus Ondina 
Salvador / BA 
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR 
 Curso: Medicina Veterinária 
Replicação e reparo do DNA 
- BIBLIOGRAFIA: 
• Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. 
(2002). Biologia Molecular da Célula, 4ª Ed. Artes Médicas Ed., Porto 
Alegre, 1548p 
 
• Lehninger, A.; Nelson, D.L.; Cox, M.M. (2000). Principles of 
Biochesmistry, 3ª Ed. Worth Publishers, New York, 1232p 
 
• Klug, W.S.; Cummings, M.R.; Spencer, C.A.; Palladino, M.A. (2010). 
Conceitos de Genética, Artmed Editora, Porto Alegre, 863p 
 
• Pierce, B.A. (2011). Genética: Um Enfoque Conceitual. 3ª. Edição, Rio 
de Janeiro, Gen Guanabara Koogan S.A, 774p 
 
• Watson, J; Baker, T.A.; Bell, S.P.; Gann, A.; Levine, M.; Losick, R. 
(2006). Biologia Molecular do Gene, 5ª Ed. Artmed Editora, 728p. 
- Watson & Crick (1953): 
 
“Não escapou à nossa atenção que o pareamento 
específico por nós postulado imediatamente sugere um 
possível mecanismo de cópia do material genético”. 
1. Introdução 
 Serão as duas fitas do DNA parental 
completamente desenroladas antes que cada uma 
replique? 
 A replicação começa em pontos aleatórios ou em um 
único ponto? 
 Depois da iniciação, em qualquer ponto do DNA, a 
replicação prossegue em uma direção ou em ambas? 
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2. Como ocorre a replicação? 
M. S. Meselson & F. 
W. Stahl (1958) 
- Replicação semiconservativa; 
- Escherichia coli; 
- Centrifugação em gradiente de 
densidade; 
- Uso do isótopo N14 e N15; 
- Crescimento por 14 gerações; 
- Bandeamento em gradiente. 
- N14 N14: banda leve. 
- N14 N15: banda intermediária. 
- N15 N15: banda pesada. 
- Gradiente nativo: fita dupla de DNA. 
- Gradiente alcalino: fita simples de DNA. 
• O DNA é capaz de se autoduplicar 
para conservar a informação 
genética; 
• A molécula se abre e novos 
nucleotídeos são acrescidos, 
sempre seguindo a ordem A-T e 
G-C; 
• Ao final se tem duas “moléculas-
filhas” que conservam a metade da 
“molécula-mãe”. 
- Conclusão 
A REPLICAÇÃO EM PROCARIOTOS 
- Unidirecional com duas origens. 
- Unidirecional com uma origem. 
- Bidirecional com uma origem. 
- Em que direção ocorre a replicação? 
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- Replicação bidirecional: identifica duas 
forquilhas de replicação; 
- Estrutura . 
- John Cairns (1963) 
- Qual enzima envolvida na replicação? 
- Arthur Kornberg e colaboradores (Nobel 1959): 
- E. coli: DNA polimerase DNA dependente (DNA pol I); 
- Adicionam desoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dGTP e Dctp); 
- Ligação do grupo livre 3’- OH; 
- Direção: 5’  3’. 
 1955: Acúmulo de evidências que a DNA pol I não é 
adequada à replicação: 
 
- Baixa processividade: velocidade na qual os nucleotídeos são 
adicionados; 
- Estudos genéticos mostram muitas enzimas envolvidas na 
replicação; 
- Mutações na DNA pol I de E. coli: crescimento normal. 
 
 
 
 1970: Descoberto das DNAs pol II e III: 
- DNA pol II: função aparente de reparo; 
- DNA pol III: 
 - Mais complexa: várias subunidades; 
 - Envolvida na replicação (replicase DNA) e correção de 
erros. 
- Fidelidade de replicação: 109 pb replicados - 1 erro; 
- Atividade exonucleásica 3’  5’ (correção de erros de leitura); 
- Atividade exonucleásica 5’  3’ (liga-se à fita dupla do DNA em locais de 
aberturas – corrige quebras); 
- Necessita de um RNA iniciador ou primer. 
- Características gerais da DNA polimerase 
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Subunidade Função 
b ATPase requerida para máxima processividade 
a Atividade polimerizadora (5' para 3') 
e Exonuclease revisora (3' para 5') 
q Não-conhecida 
t 
Estabiliza a ligação ao molde; básica para a 
dimerização da enzima. 
d 
Aumenta a processividade. 
 
d' 
g 
y 
c 
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- Pontos centrais da polimerização 
• Necessidade de um molde; 
• Um iniciador é requerido: a DNA pol só adiciona nucleotídeos 
em uma fita pré-existente; 
• Processividade: número de nucleotídeos adicionado, em média, 
depende da dissociação e reassociação com o molde; 
• Se a síntese prossegue sempre na direção 5’  3’, como podem 
as duas fitas serem sintetizadas simultaneamente? 
Mafalda, às vezes me pergunto: 
Qual o sentido da vida? 
É na direção 5’-> 3’, 
Felipe!!! 
• Estrutura assimétrica (anti-paralela); 
• Fita líder: síntese contínua / mesma direção do movimento da 
forquilha de replicação; 
• Fita atrasada: síntese descontínua / direção oposta ao 
movimento da forquilha de replicação; 
• Fragmentos de Okasaki: 
 - Bactérias: 1000 a 2000 nucleotídeos. 
 - Eucariotos: 100 a 200 nucleotídeos. 
- Reiji Okasaki e colaboradores (1960) 
- A replicação do cromossomo circular bacteriano 
•Dividida em três etapas: 
 - Iniciação; 
 - Elongação; 
 - Terminação. 
 
 
 
1. Iniciação: 
 
- Origem: Ori C; 
- 245 pb altamente conservadas; 
- Duas sequências-chave: 
 - 3 repetições de 13 pb 
ricos em AT; 
 - 4 repetições de 9 pb. 
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OriC do cromossomo 
de E.coli 
- Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli 
DnaA Reconhece a origem e abre a dupla fita em 
sítios específicos 
DnaB (helicase) Desenrola o DNA 
DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem 
HU Proteína do tipo histona que estimula a 
iniciação 
Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA 
Single strand binding 
(SSB) 
Liga a fita simples de DNA 
RNA polimerase Facilita a ação da DnaA 
DNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela 
abertura da dupla-fita 
DNA Metilase Metila as sequências GATC na OriC 
2. Elongação: 
- Helicase 
- Proteínas ligadoras de fita simples (SSB) 
- Girase 
- DNA polimerase I e III 
- Primase 
- Cinta deslizante 
- Ligase 
A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA 
Fita contínua 
Fita descontínua 
Síntese da Fita descontínua 
Síntese da Fita Contínua 
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 Fragmentos 
de Okasaki 
ocorrem na fita 
descontínua 
 A DNA 
polimerase III 
é responsável 
pela síntese da 
maior parte do 
DNA 
 A DNA 
polimerase I 
remove o 
primer de RNA 
e preenche as 
lacunas 
 A DNA ligase 
sela as quebras 
- Retirada dos “primers” – DNA pol I 
- A DNA ligase sela as quebras 
• Requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias 
de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia. 
- DNA ligase 
- Região 350 Kb) flanqueada por 7 
sítios de terminação; 
- Forquilha anti-horário: TER A; 
- Forquilha horário: TER C; 
- Proteína TUS; 
- Desligamento da DNA pol III das 
fitas: topoisomerase 
3. Terminação 
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A REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS 
- Após o início da replicação, as proteínas MCM 
são deslocadas da origem (a replicação só inicia 
quando a célula passa pela mitose e entra em G1 
do próximo ciclo celular). 
- Várias origens de replicação ao longo dos cromossomos 
lineares; 
- 1 origem a cada 3 – 300 Kb; 
- Conjuntos de 20 a 80 replicons; 
- Mecanismos para ativação dos replicons e prevenção de 
re-replicação: pouco compreendidos; 
- DNA helicase é necessária. 
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min 
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em 
tempos diferentes 
 Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática 
- Proteínas envolvidas na replicação 
- Helicase 
- Proteínas ligadoras de fita simples (SSB) 
- Girase 
- DNAs polimerase (~13 sendo 5 mais importantes) 
- Primase 
- Cinta deslizante 
- Ligase 
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- “Passagem” por um nucleossomo 
- Replicação dos telômeros 
• Telos → final 
• Meros → parte 
• Estrutura localizada na 
extremidadedo cromossomo. 
• Funções: proteção, arranjo da 
cromatina no núcelo interfásico 
• Formado por proteínas e DNA 
não-codificador. 
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e 
apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades 
denominadas telômeros: 
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- TELÔMEROS: 
 
• Seqüências repetitivas de DNA sem função codificante; 
• Evitam a formação de cromossomos dicêntricos e perda de 
informação genética; 
• Similares em organismos diversos; 
• Fórmula geral: C (1-8) A / T (1-4). 
 
- PROBLEMAS NA REPLICAÇÃO: 
 
• Encurtamento: remoção inadequada do último RNA iniciador e 
substituição por DNA, encurtando a cada ciclo de replicação; 
•A síntese da fita “líder” continua até o término da fita molde de 
DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na 
fita “atrasada” não segue o mesmo padrão. 
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo 
diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo. 
- TELOMERASE: 
 
- Enzima formada por um componente protéico (tipo transcriptase 
reversa) e uma molécula de RNA, que contém o molde invertido. 
 
• Promove o mecanismo de síntese nos telômeros; 
• Contém uma sequência curta de RNA que serve como molde; 
• Atuação é restrita em alguns tipos celulares: processo normal de 
envelhecimento e morte celular. 
• Presente principalmente em células embrionárias 
e em tumores 
• Além de prevenir o encurtamento dos telomeros 
(retardando o envelhecimento) também ativa 
genes que fazem a célula se dividir 
indefinidamente. 
• O número de vezes que esta enzima adiciona as 
seqüências repetitivas de nucleotídeos não é 
controlado por ela própria, mas sim por outras 
proteínas envolvidas no processo. 
 
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MUTAÇÃO E REPARO DO DNA 
- Estabilidade: 
 - Mecanismo preciso de replicação do DNA; 
 - Mecanismo preciso de reparo dos erros de cópia; 
 
- Mutação: modificação de bases no DNA. 
- Questões que a célula deve resolver: 
 
1. Como o DNA é corrigido de forma suficientemente 
rápida para impedir que os erros se incorporem no 
material genético como mutações? 
2. Como a célula distingue a fita parental da fita filha 
na correção dos erros de replicação? 
3. Como a célula restaura uma sequência de DNA 
quando (devido a uma quebra ou uma lesão grave) a 
sequência original não pode ser mais lida? 
4. Como a célula enfrenta lesões que bloqueiam a 
replicação? 
 
- Todas essas respostas dependem do tipo do erro ou 
da lesão que necessita o reparo. 
- Ex: > 130 genes de reparo no genoma humano 
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- Taxas de mutação: 
 
- Se elevadas em linhagem somática: destruição do indivíduo 
- Se elevadas em linhagem germinativa: destruição da espécie 
- Célula; depende do funcionamento correto dos genes, que por sua 
vez estão sujeitos a alterações: 
 
- Nas sequências codificadoras 
- Regiões flanqueadoras 
- Nos pontos do splicing etc. 
- MATERIAL GENÉTICO: 
 
- Se perpetuado com fidelidade perfeita, a variação genética 
necessária a evolução seria perdida e novas espécies não teriam 
surgido 
 
- Logo, a BIODIVERSIDADE e a VIDA dependem do equilíbrio 
entre a ocorrência de mutação e do seu reparo. 
 
- Espontâneas: nenhum agente além do ambiente 
 - Taxa de mutação espontânea : 10-7 
 
- Induzidas: presença de um agente indutor 
 - Físico: raios X, radiações ionizantes, etc 
 - Químico: agentes alquilantes, acridinas etc 
 - Biológico: transposons 
- Mudanças herdáveis que representam a base genética da 
variação. 
 a. Mutações pontuais (em nível molecular) 
 b. Mutações cromossômicas (em nível cromossômico) 
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4.1. Reversão direta da lesão no DNA 
4.1.1. Fotorreativação 
4.1.2. Reparo de bases alquiladas 
4.2. Reparo por excisão 
4.2.1. Excisão de bases 
4.2.2. Excisão de nucleotídeos 
4.2.3. Reparo de mal pareamento 
4.3. Reparo pós-replicação 
4.3.1. Reparo por recombinação 
4.3.2. Reparo sujeito a erros 
- Mecanismos de reparo 
a. Excisão de bases: 
 
-A citosina do DNA é desaminada 
espontaneamente sendo, portanto, 
percebida pela uracil (evento mutagênico 
potencial) 
 
 
- A remoção da base defeituosa (ou não 
habitual) pode ocorrer a partir da: 
 
• Clivagem da ligação base-açúcar (excisão 
de base) 
• Incisão endonucleolítica nos dois lados da 
lesão 
• Liberação de nucleotídeos 
• Preenchimento da região pela ação da 
DNA-polimerase I e posterior ligação 
- Reparo por excisão 
- Um dos mais importantes e gerais 
mecanismos de reparo (REN) 
 
ETAPAS 
 
1. Reconhecimento da lesão 
2. Incisão da fita lesada em ambos os 
lados da lesão e a alguma distância 
desta 
3. Excisão do segmento (oligonucleotídeo) 
contendo a lesão 
4. Síntese de um novo segmento de DNA 
utilizando a fita não-danificada como 
molde 
5. Ligação 
 
OBS: reação, a princípio, livre de erro 
b. Excisão de nucleotídeos: - Xeroderma pigmentoso: Doença rara autossômica 
recessiva 1:250.000 
- Hipersensibilidade à luz UV, predisposição a câncer 
de pele quando jovens 
- Deficiência no sistema de reparo por excisão dos 
dímeros de pirimidina 
- Mutações ocorrem em 8 genes: XP-A até XP-G 
- Leveduras possuem genes homólogos 
- Normal: sistema de reparo associado a um fator 
de transcrição (TFII H)