Ciclo celular artigo

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Biologia Celular
Boletim de Biotecnologia 7
Ciclo Celular e novas terapias contra o cancro
(o ano do Nobel)
Introdução
A capacidade de uma célula se
dividir em duas é uma propriedade
fundamental dos organismos vivos, e
por isso o mecanismo pelo qual as
células se dividem desde sempre
fascinou os biólogos. A formação de
uma nova célula tem sempre origem
numa célula já existente, através de
um processo denominado divisão
celular, sendo o ciclo celular definido
como o intervalo entre duas divisões
celulares sucessivas.
É interessante verificar que a duração
do ciclo celular varia enormemente
entre diferentes organismos, entre
células em diferentes fases do
desenvolvimento desses organismos,
e entre diferentes tipos de células no
mesmo organismo (enquanto que
alguns tipos de células se dividem
num espaço de horas, outros
necessitam de meses). Ainda dentro
de um mesmo organismo multicelular
adulto as células podem dividir-se em
três classes, relativamente à sua
capacidade de divisão: As que
possuem um elevado grau de
especialização e que perderam a
capacidade de divisão, como por
exemplo as do sistema nervoso, ou
glóbulos vermelhos; as que
normalmente não se dividem, mas
que podem ser induzidas a fazê-lo
quando estimuladas (eg células
hepáticas e linfócitos); finalmente, as
células que possuem uma actividade
mitótica elevada (eg células das
gónadas ou epiteliais). No entanto, e
apesar destas diferenças, observa-se
que quando crescidas em cultura,
muitas células de diferentes animais
atravessam um ciclo completo em
cerca de 20 horas, o que indica que,
num organismo multicelular, a taxa
de proliferação de cada tipo celular é
regulada por factores extrínsecos à
célula, não dependendo apenas de
características celulares intrínsecas.
Como se estima que, num corpo
humano adulto, em cada segundo se
encontrem em divisão mais de 25
milhões de células, tem-se noção que
a coordenação da divisão celular é
um aspecto essencial ao organismo.
Para além do interesse científico
inerente ao estudo dos mecanismos
envolvidos, o estudo do ciclo celular
tem implicações práticas enormes no
campo da saúde humana,
nomeadamente no que respeita ao
combate ao cancro, uma vez que esta
doença resulta, essencialmente, do
facto de a célula perder o controlo da
sua própria divisão. As células
tumorais dividem-se persistente-
mente em situações em que tal não
deveria acontecer, uma vez que
perderam os controlos moleculares
que as fazem pertencer a uma das três
classes acima descritas.
Ciclo celular
O ciclo celular divide-se tradicional-
mente em interfase e mitose. A fase
de divisão, denominada mitose ou
fase M, é separada da divisão
seguinte pela interfase. A observação
de que a duplicação (replicação) dos
cromossomas ocorre durante um
período específico da interfase
originou a sua divisão em três partes,
tendo o período de síntese do DNA
sido denominado fase S, a fase que o
antecede G1 e o período entre a fase
S e a mitose seguinte, G2.
A mitose é uma fase relativamente
curta do ciclo celular sendo a sua
duração bastante constante entre
diferentes tipos de células
(frequentemente cerca de uma hora).
O mesmo acontece relativamente às
fases S e G2, verificando-se que, em
termos de duração, a maior
variabilidade ocorre na fase G1. Esta
fase corresponde ao período em que a
célula cresce e executa as suas
funções e verifica-se que, com raras
excepções, as células que pararam de
se dividir, quer temporária quer
definitivamente, seja no organismo
seja em cultura, fazem-no num ponto
imediatamente anterior à iniciação da
síntese de DNA. As células nestas
condições dizem-se em G0,
distinguindo assim as células que
abandonaram o ciclo celular daquelas
que se encontram numa fase G1
típica. A re-entrada de células em G0
no ciclo celular, passando a G1, dá-se
por resposta a estímulos externos (eg
hormonas). A passagem da fase G1
para a fase S depende de um sinal
interno que é gerado pela célula, e
determina o início da replicação do
DNA. Este sinal marca um ponto no
ciclo celular, denominado start, que
constitui um ponto sem retorno uma
vez que a partir do momento em que
é desencadeado, o ciclo celular não
pode “voltar atrás” - a célula
invariavelmente completará a dupli-
cação do DNA e entrará em mitose.
Sabemos hoje que os acontecimentos
que se relacionam com a duplicação e
divisão do material genético,
constituem acontecimentos-chave do
ciclo celular. Com efeito, o facto de
os cromossomas, contrariamente a
quase todos os componentes celulares
existirem nas células numa única
cópia e serem portadores da
informação genética faz com que a
sua duplicação e separação exactas
Joana Perdigão2 e Álvaro Tavares1,2
1 Secção de Biotecnologia, Departamento de Engenharia Química,
 Instituto Superior Técnico,
 Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisboa
2 Grupo de Divisão Celular, Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras
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8 Boletim de Biotecnologia
pelas duas células-filhas quando uma
célula se divide constituam um
requisito essencial à viabilidade
celular.
O início da compreensão
do celular
A clonagem dos genes que controlam
o ciclo celular constituiu um passo-
chave para a compreensão da divisão
celular. A aplicação da genética,
associada à biologia molecular, foi
particularmente eficaz no estudo do
ciclo celular em leveduras. Nestes
organismos, os estudos genéticos
iniciais permitiram a identificação de
um grande grupo de genes
envolvidos no controlo da divisão
celular (genes cdc; Hartwell et al.
1970). Mutantes nestes genes foram
isolados, caracterizados fisiologica-
mente, clonados por complementa-
ção, e os genes clonados utilizados
como ponto de partida para análises
bioquímicas subsequentes. A análise
de mutantes em Saccharomyces
cerevisiae e em Schizosaccharo-
myces pombe permitiu verificar que
havia um gene – cdc2 em S. pombe -
com uma função central no ciclo
celular (Nurse et al. 1976).
Simultaneamente, no início dos anos
70 foi feita uma descoberta
importante por embriologistas a
trabalhar com oócitos de Xenopus: a
transferência de citoplasma de um
oócito maduro para um outro imaturo
era capaz de provocar a entrada deste
último em mitose (Masui e Market,
1971). Ao factor citoplasmático
responsável por esta maturação, que
mais tarde se demonstrou estar
presente em todos os tipos de células
mitóticas, chamou-se MPF
(Maturation ou M-phase Promoting
Factor). Desenvolveu-se assim uma
segunda abordagem experimental, in
vitro, utilizando-se extractos
celulares derivados de oócitos ou
ovos de anfíbios e de invertebrados
marinhos, para criar sistemas capazes
de executar os passos do ciclo
celular. A possibilidade de depletar e
purificar certas moléculas destes
extractos permitiu uma análise
bioquímica de cada um destes passos,
da qual resultou a purificação do
MPF (Lohka et al. 1988).
Estas duas abordagens experimen-
tais, a genética e a bioquímica,
complementam-se e o facto de o ciclo
celular e o seu controlo serem
altamente conservados significou que
os estudos puderam ser feitos e
comparados numa diversidade de
organismos biológicos, cada um com
as suas vantagens específicas. Por
exemplo, a purificação do factor
MPF de anfíbios revelou que
consistia num complexo proteíco de
duas subunidades, sendo uma delas
uma cinase proteíca com elevada
homologia com a cdc2 de levedura
(Labbe et al. 1988). A clonagem do
gene cdc2 humano por complemen-
tação do mutante cdc2 em levedura
de fissão (Lee e Nurse, 1987)
demonstrou que a cinase cdc2 é um
regulador universal do ciclo celular.
A segunda subunidade do MPF é
uma ciclina, um tipo de proteína
entretanto isolada de embriões de
ouriço-do-mar, e que é sintetizada e
degradada de um modo cíclico, em
sincronia com o ciclo celular (Evans
et al. 1983). A ciclina identificada
como componente do MPF era uma
ciclina mitótica (com picode
abundância durante a mitose),
denominada ciclina B (Lohka et al.
1988). A convergência destas linhas
independentes de investigação
permitiu que, nos finais dos anos 80,
o factor MPF fosse identificado como
um regulador universal do início da
fase M.
CDKs e ciclinas
Sabe-se hoje que a proteína cdc2
pertence a uma família conservada de
cinases, conhecidas como Cdks
(cyclin-dependent kinases). As Cdks
são inactivas como monómeros,
necessitando de se ligar a um
parceiro ciclina para se tornarem
activas. Em todas as células
eucariotas a progressão do ciclo
celular é controlada pela activação e
inactivação sucessivas de diferentes
complexos ciclina-CDK (para revisão
ver por exemplo Pines, 1999).
Enquanto que em eucariotas
inferiores, como as leveduras, há
apenas um ou dois genes tipo cdc2,
em mamíferos há pelo menos nove
CDKs (Cdk1-9) (Johnson e Walker,
1999). Em S. cerevisiae, a activação
e especificidade da única Cdk
existente (a CDC28) é definida por
nove ciclinas diferentes (Levine et al.
1999). Três ciclinas G1 regulam os
acontecimentos que ocorrem durante
G1 ou até ao ponto em que as células
entram na fase S e seis outras ciclinas
são requeridas para a iniciação da
replicação do DNA durante a fase S e
Plk
aaTubulin DNA
Metaphase
Anaphase
Telophase
G2
Cell
Cycle
G1
S
Cytokinesis
Interphase
M
Figura 1 - Representação esquemática do ciclo celular. A duração de cada fase não se
encontra representada na figura de modo real. As células humanas (HeLa) apresentadas têm os
cromossomas marcados a azul, os microtúbulos a vermelho e a proteína polo a verde.
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Boletim de Biotecnologia 9
a mitose subsequente (Nasmyth,
1996). Em mamíferos a situação é
muito mais complexa pois para além
das 9 CDKs já isoladas
identificaram-se até ao momento
dezasseis ciclinas (denominadas A,
B1, B2, C, D1, D2, D3, E, F, G1, G2,
H, I, K, T1 e T2) . Todas estas
ciclinas têm em comum uma região
de homologia, a caixa ciclina, que é
na realidade um domínio de ligação
às Cdks (Hunt, 1991). As ciclinas são
muitas vezes referidas como
mitóticas ou da fase S, consoante o
seu pico de expressão ocorre durante
a fase M ou fase S, respectivamente.
Demonstrou-se posteriormente que
os complexos ciclina-CDK que
controlam o início da fase S e da
mitose são distintos, e que
aumentando a actividade destas
CDKs se conseguia acelerar essas as
fases. A actividade cinásica das
CDKs é regulada pela abundância
intracelular das subunidades ciclina,
por mudanças no seu estado de
fosforilação (que é controlado por
actividades antagónicas de outras
cinases e fosfatases), e pela
associação aos inibidores CKI.
A título de exemplo, a transição de
G2 para M (transição G2/M) requer a
activação de um complexo
Cdk/ciclina. A ciclina B é a principal
ciclina mitótica em eucariotas
superiores e em conjunto com a cdc2
(agora chamada Cdk1) forma o MPF.
Contudo, a activação completa do
MPF, necessária para o início da
mitose, depende de outros níveis de
controlo, para além da junção das
duas subunidades. Em primeiro lugar,
é necessário que ocorra a fosforilação
da cdc2 num resíduo de treonina
conservado, o T161, pela cinase
activadora CAK (Cdk-activating
kinase). Por outro lado, a
Cdk1/ciclina B pode ser mantida num
estado inactivo por fosforilação dos
resíduos T14 e Y15 da CDK1, ambos
no local de ligação da cinase ao ATP.
Estas fosforilações inibidoras são
executadas por duas cinases
diferentes chamadas Wee1 e Myt1. A
activação é executada por membros
da família de fosfatases cdc25 que
removem essas fosforilações
inibidoras do local de ligação da Cdk
ao ATP. Após esta desfosforilação, o
complexo Cdk/ciclina B está
finalmente completamente activo e a
mitose inicia-se.
A proteólise e a transcrição
constituem dois outros processos
reguladores importantes para a
progressão do ciclo. A proteólise
controlada tem um papel directo na
regulação das CDKs controlando os
níveis de ciclinas, e contribuindo
também para outros passos do ciclo
celular tais como alterações na
coesão das cromátidas-irmãs, que
ocorrem quando as cromátidas se
separam, na transição metafase/
anafase. As ciclinas são degradadas
de um modo selectivo sendo
“marcadas” para destruição pela
conjugação com moléculas de
ubiquitina, e assim reconhecidas e
degradadas pelo complexo
proteolítico proteossoma. Por
exemplo, durante a mitose diferentes
ciclinas são ubiquitinadas por acção
de um complexo proteico denomi-
nado APC. Este complexo, por
associação a diferentes proteínas
reguladoras, tem especificidade
diferente para as várias ciclinas em
diferentes alturas da mitose. Deste
modo as ciclinas mitóticas não são
todas degradadas simultaneamente
mas sim em alturas muito específicas.
Assim, o aumento e diminuição
sucessivas na concentração de cada
ciclina são obtidos pela coordenação
entre a sua transcrição e a sua
degradação pelo proteossoma. Este
duplo controlo assegura que a
concentração de cada ciclina atinge o
nível necessário para activar o seu
parceiro catalítico (uma Cdk), na fase
correcta do ciclo. A destruição
programada das ciclinas é, por outro
lado, um passo importante que
permite à célula passar à próxima
etapa do ciclo. Por esta razão, células
mutantes que não conseguem
degradar as ciclinas mitóticas ficam
paradas em mitose e não reentram em
G1.
Figura 2 - Acumulação ao longo do ciclo celular dos diferentes complexos ciclina/Cdk
Figura 3 - Mecanismos de activação e inactivação do complexo cdc2/ciclina.
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10 Boletim de Biotecnologia
Pontos de controlo
De modo a executar as diferentes
etapas do ciclo numa ordem correcta
as células possuem controlos que
monitorizam o estado dos
acontecimentos ao longo do ciclo
celular, tais como a replicação dos
cromossomas ou a formação do fuso
mitótico, e que determinam se o ciclo
deve ou não continuar. Se o sistema
detectar problemas despoleta uma
resposta que parará temporariamente
a progressão do ciclo. A célula
poderá então proceder às reparações
necessárias em vez de continuar para
a nova etapa do ciclo, algo que
poderia conduzir à sua morte ou à
transformação numa célula
cancerosa. Se, no entanto, o sistema
de vigilância falha na detecção de
anomalias, o ciclo prosseguirá para as
etapas seguintes mesmo em presença
de erros. É de notar que estes
controlos são extraordinariamente
sensíveis: A presença de uma única
quebra numa das moléculas de DNA
ou de um único cromossoma não
associado ao fuso mitótico são
suficientes para causar uma paragem
no ciclo. Por exemplo, quando
células normais são sujeitas a
tratamentos que danificam o DNA,
como radiação ionizante, a sua
progressão ao longo do ciclo celular
pára enquanto o dano é reparado. A
irradiação de uma célula durante a
fase G1 do ciclo celular atrasa a
progressão até à fase S; de modo
semelhante, células irradiadas
durante a fase S atrasam a
continuação da síntese do DNA,
enquanto que células irradiadas
durante G2 atrasam a entrada em
mitose. Um atraso em G1 impede a
replicação de DNA danificado
(mutado por exemplo) e uma
paragem em G2 evita que a célula
segregue cromossomas defeituosos.
O conceito de ponto de controlo
(checkpoint) foi uma ajuda valiosa
para a compreensão do ciclo celular
(Hartwell e Weinert, 1989).
Os pontos de controlo mais estudados
são os que monitorizam a existência
de danos no DNA e alterações na sua
replicação, bloqueando a mitose
quando o DNA se encontra
danificado ou a sua replicação está
incompleta. Estes pontos de controlo
têm mecanismos de vigilância que
detectam quer estruturas específicas
de DNA quer a presença de
complexos proteicos envolvidos na
replicação e reparação do DNA, que
indicam que alguns desses processos
está em curso. Em consequência é
activada uma via de transmissão de
sinal que ou bloqueia a entrada em
mitose, mantendo a Cdc2numa
forma fosforilada inactiva, ou
bloqueia a mitose numa fase mais
avançada através de outros
mecanismos. Existe ainda um outro
ponto de controlo, que bloqueia a
fase S após danos do DNA, e que em
células de mamífero depende da
presença do gene supressor de
tumores p53 (ver abaixo, secção
“Terapias de combate ao cancro”).
O outro ponto de controlo ocorre
durante a mitose, parando a
progressão da mitose se o fuso
mitótico não estiver correctamente
formado, ou se a ligação e orientação
de todos os cromossomas ao fuso não
estiver assegurada. Este checkpoint
foi descoberto a partir da observação
de que a remoção de um cromossoma
do fuso provoca um bloqueio da
progressão mitótica, e que certos
mutantes em levedura continuam o
processo de divisão mesmo na
ausência de um fuso funcional (Hoyt
et al 1991; Li e Murray, 1991;
Nicklas, 1997). Pensa-se que este
checkpoint funciona monitorizando a
funcionalidade do fuso e a sua
ligação aos cromossomas. Na
ausência dessa ligação, a coesão entre
as cromátidas-irmãs é mantida e os
microtúbulos não encolhem, e como
consequência as cromatides não
ascendem aos polos do fuso. Este
checkpoint assegura que a uma
replicação precisa do DNA ao nível
molecular se segue uma segregação
precisa do DNA replicado ao nível
celular.
Os pontos de controlo devem assim
necessitar de, pelo menos, três
componentes distintos: um
mecanismo sensor que vigia e detecta
as anomalias quando estas surgem;
um sistema de
sinalização/retransmissão de sinais
que transmite a informação
detectada; e um efector que pára a
maquinaria celular. Alguns destes
efectores que causam uma paragem
do ciclo celular são inibidores
específicos que actuam directamente
sobre os complexos ciclinas/Cdks.
Por exemplo, as células irradiadas em
G1 sintetizam uma proteína
denominada p21 que inibe a
actividade da cinase Cdk de G1
impedindo as células de entrarem em
S. É interessante verificar que certos
inibidores das Cdks, tais como o p21
e o p27, desempenham um papel
durante a diferenciação celular.
Imediatamente antes de se
Figura 4 - Pontos de controlo (checkpoints) do ciclo celular. É apresentado no esquema o
tipo de alteração detectado pelo checkpoint, a fase do ciclo durante a qual os checkpoints estão
activos, e o ponto de paragem do ciclo executado pelo checkpoint.
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Boletim de Biotecnologia 11
começarem a diferenciar as células
saem normalmente do ciclo celular e
param de se dividir, pensando-se que
esta descontinuação do ciclo é
induzida pela síntese dos inibidores
das Cdks. Observou-se que os
ratinhos “knockout” que não
possuem o gene p27 são maiores que
os ratinhos normais, e certos dos seus
orgãos, tais como o timo e o baço,
têm um número significativamente
maior de células que os de um animal
normal. Em ratinhos normais, as
células destes orgãos específicos
sintetizam quantidades relativamente
elevadas de p27, e presume-se que a
ausência desta proteína nos ratinhos
deficientes para a p27 permite que as
células continuem a dividir-se para
além do seu ponto de diferenciação.
Em alguns casos esta proliferação
descontrolada tem efeitos nefastos:
por exemplo, o gene que codifica a
p16, um inibidor de Cdks, encontra-
se muitas vezes suprimido em
determinados tumores humanos. Tal
como seria previsível, ratinhos
“knockout” que não possuem o gene
do p16 exibem uma predisposição
elevada para desenvolverem tumores.
O ciclo celular e o
desenvolvimento de
tumores
Antes dos anos 80 pouco se sabia
sobre o modo como as células
tumorais adquirem as suas
propriedades letais de crescimento e
disseminação descontrolados. Não
surpreendentemente, sabe-se hoje que
muitos dos defeitos moleculares
responsáveis pela transformação das
células normais em malignas
consistem em mutações em genes
codificantes para proteínas que
regulam o ciclo celular.
Por exemplo, a ataxia-telangiectasia
(AT) é uma doença hereditária
recessiva caracterizada por uma
variedade de sintomas, incluindo um
risco aumentado para certos tipos de
cancro. Descobriu-se nos anos 60 –
após a morte de diversos indivíduos
que estavam a ser sujeitos a terapia
por radiação – que os pacientes com
AT, ou células destes pacientes, são
extremamente sensíveis a radiação
ionizante. Sabe-se agora que
mutações no gene responsável pela
AT (gene ATM) conduzem a
problemas no checkpoint que detecta
a ocorrência de danos no DNA,
permitindo-se assim que células com
o DNA danificado continuem o ciclo
e que entrem em mitose sem que o
DNA seja reparado.
Muitas vezes a alteração do padrão
de determinadas proteínas é
suficiente para provocar defeitos
graves na célula. Por exemplo, o
complexo ciclina E/Cdk2 catalisa a
transição da fase G1 para a fase S. A
ciclina E tem um nível baixo no
início de G1, que aumenta até atingir
um pico na fase G1 tardia, activando
a Cdk2 na transição G1-S, e decaindo
outra vez durante as fases S, G2 e M.
Este perfil de expressão reflecte a
importância do complexo ciclina E –
Cdk2 na promoção do início da
replicação do genoma durante a fase
S. Um controlo rigoroso do nível da
ciclina E e da actividade da cinase a
ela associada é essencial para o
início, na altura correcta, da síntese
do DNA. Descobriu-se pois que uma
quantidade insuficiente de ciclina E
resulta numa paragem em G1, ao
passo que o aumento do nível desta
proteína provoca uma entrada
prematura na fase S, instabilidade
genómica e formação de tumores.
Para que o nível da ciclina E
diminua, segundo o padrão normal,
durante a fase S, é necessária que seja
destruída tendo-se descoberto
recentemente que uma proteína
pertencente à família das proteínas F-
box, chamada hCDC4 em humanos, é
a responsável pela marcação da
ciclina E para destruição. As
proteínas F-box são adaptadores que
formam pontes entre o substrato
(neste caso a ciclina E) e o SCF, uma
ligase de ubiquitina que faz parte das
vias de degradação pelo proteossoma.
A hCdc4 liga a ciclina E ao SCF e
este último, em conjunto com a
conjugase de ubiquitina (E2), cataliza
a adição de cadeias de ubiquitina à
ciclina E. A destruição da ciclina E
ubiquitinada tem como consequência
a inibição do complexo cinásico
ciclina E/Cdk2. Certas mutações no
hCdc4 inactivam a sua capacidade de
reconhecer a ciclina E ou de interagir
com o SCF, gerando uma
acumulação de actividade
CiclinaE/Cdk2 quando esta já não
deveria existir. Esta acumulação de
ciclina E resulta numa proliferação
celular excessiva, tendo-se verificado
que mutações no hCDC4 também
parecem predispor os indivíduos para
cancro da mama ou dos ovários
(Strohmaier et al., 2001; Moberg et
al., 2001).
integridade do DNA
DNA não 
replicado
centrossomas
não separados ?
cinétocoros livres
cromossomas 
não alinhados
fuso mal 
posicionado
G2 profase metafase anafase telofase
citocinese
G1
A B DC
Figura 5 - Pontos de controlo que regulam a progressão da mitose. A, B, C e D indicam diferentes tipos de erros detectados pelos
checkpoints e o ponto de paragem da mitose em que actuam (adaptado de Nigg 2001)
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12 Boletim de Biotecnologia
Terapias de combate ao
cancro
Descobriu-se que algumas proteínas
descritas como supressoras de
tumores (eg. a p53 e a retinoblastoma
(Rb)) são proteínas envolvidas no
controlo do ciclo celular, sendo
centrais na decisão final da via
seguida pela célula – progressão/
paragem do ciclo celular e entrada ou
não em apoptose – no caso de
ocorrência de problemas. Por
exemplo, a proteína p53 é
responsável pela paragem em G1
quando o DNA contém lesões,
impedindo a ocorrência da replica-
ção, atrasando a progressão do ciclo
celular até à sua reparação e
promovendo a apoptose (suicídio
celular) nos casos em que tal não é
possível. Mutações no p53, por outro
lado, permitem a sobrevivência e
reprodução de células contendo
lesões no DNA. Desta forma, as
células alteradaspassam as mutações
que contêm à sua descendência, que
terá depois a oportunidade de
acumular mutações adicionais
necessárias para o desenvolvimento
de neoplasias. Compreende-se assim
facilmente que grande parte dos
tumores possuam alterações nesta
proteína, uma vez que a sua
inactivação é muitas vezes um dos
primeiros passos da progressão da
célula para um estado maligno.
Relativamente à terapia de tumores
contendo mutações nestes genes,
pensa-se actualmente que o
restabelecimento funcional de um
gene supressor de tumor, como o p53
ou o Rb, poderá ser suficiente para
induzir a apoptose celular e parar o
crescimento tumoral, tal como é
sugerido pelo facto de a introdução
de genes p53 e Rb normais em
células tumorais ser capaz de inibir o
seu crescimento (Cai et al., 1993).
Por estes motivos, a proteína p53 é
um dos alvos terapêuticos actual-
mente mais estudados, tentando re-
estabelecer a sua actividade nas
células tumorais em que se encontra
inactiva. De uma forma mais geral, o
restabelecimento de vias de
checkpoint alteradas para o seu
O 100º prémio Nobel para a Fisiologia ou Medicina reconheceu, em 2001,
o trabalho dos investigadores Timothy Hunt, Paul Nurse e Leland
Hartwell, que os conduziu à identificação das moléculas-chave que
regulam o ciclo celular em todos os organismos eucariotas, incluindo
leveduras, plantas e animais.
Leland Hartwell (1939-), actualmente director do Fred Hutchinson Cancer
Research Center, Seattle, foi distinguido pelos trabalhos que conduziram à
identificação de genes com funções-chave na regulação do ciclo celular e pela
definição do conceito e mecanismo de checkpoint celular. Utilizando a levedura
Saccharomyces cerevisae como modelo para a análise genética do ciclo celular
identificou, no início dos anos 70, mutações em mais de 100 genes
especificamente envolvidos no controlo da divisão celular e a que chamou genes
CDC (do inglês Cell division control ), provando assim que o controlo do ciclo
celular era determinado geneticamente. No seguimento deste trabalho, o gene
CDC28 foi identificado como responsável pelo controlo da progressão do ciclo
celular através de G1, e posteriormente denominado “start” quando se estabeleceu
que a sua expressão marca um ponto crucial no ciclo celular em que ocorre a
integração do estado de proliferação celular com os sinais intra- e extra-celulares.
Foi também o responsável pela introdução e definição do conceito de checkpoint
celular, que constituiu um marco fundamental no desenvolvimento dos
conhecimentos sobre a regulação do ciclo celular (Hartwell e Weinert, 1989). As
experiências que conduziram a este conceito pretenderam estudar o efeito da
irradiação de células de levedura sobre a progressão do ciclo celular, tendo
demonstrado que as células que contêm danos no DNA, provocados por
irradiação, sofrem uma paragem do ciclo celular.
Paul Nurse (1949-), Director-Geral do Imperial Cancer Research Fund, Londres,
identificou o gene cdc2 numa outra espécie de levedura – Schizosacharomyces
pombe - e demonstrou que a proteína que codifica é responsável pela transição da
fase G2 para mitose. O gene cdc2 viria posteriormente a ser identificado como
homólogo do gene CDC28 de S. cerevisiae isolado por Hartwell, e como envolvido
na regulação de diferentes fases do ciclo celular. O seu homólogo humano,
conhecido como CDK1, foi identificado por Nurse em 1987 a partir de ensaios de
complementação genética utilizando uma biblioteca de cDNAs humanos para
complementar a mutação do cdc2 em S. pombe (Lee e Nurse, 1987). Nurse
mostrou ainda que a regulação da actividade cinásica das CDK depende do seu
estado de fosforilação.
No início dos anos 80 Timothy (Tim) Hunt (1943-), hoje director do Cell Cycle
Control Laboratory Imperial Cancer Research Fund, Londres, com base em
estudos da divisão celular em embriões de ouriços-do-mar (Arbacia) descreveu
uma nova classe de proteínas cuja abundância varia de forma cíclica ao longo do
ciclo celular e que, por esse motivo, denominou ciclinas (Evans et al., 1983).
Demonstrou ainda que a oscilação do nível de ciclinas é regulada através da sua
degradação periódica em pontos específicos do ciclo celular, mecanismo que tem
uma importância fundamental para o controlo do ciclo celular, uma vez que a
actividade das CDK depende da sua associação com ciclinas.
Em resumo, estes três investigadores premiados com o Nobel, em 2001,
descobriram os produtos e mecanismos moleculares básicos de regulação do ciclo
celular. As suas descobertas abriram caminho a uma importante e fascinante área
de investigação, que inicialmente utilizou como modelo organismos muito mais
simples que o Homem. O facto de se ter vindo a demonstrar que os mecanismos
básicos que regulam a progressão do ciclo celular foram extraordinariamente
conservados ao longo da evolução permitiu um grande avanço no conhecimento
do controlo do ciclo celular nas células humanas. Por outro lado, o facto de os
mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de processos tumorais
resultarem, em última análise, de alterações a nível do controlo da progressão do
ciclo celular, faz com que todos estes conhecimentos adquiram extrema
importância a nível de implicações terapêuticas.
2001 – O Ano do Ciclo Celular
Biologia Celular
Boletim de Biotecnologia 13
funcionamento normal poderá
restabelecer a resposta apoptótica das
células malignas e assim aumentar a
sua sensibilidade a agentes que
provocam danos a nível do DNA.
Conceptualmente, a estratégia mais
simples para conseguir este objectivo
seria substituir o gene mutado pelo
seu equivalente normal (terapia
génica) sendo esta uma linha actual
de investigação intensa. Os métodos
que se encontram actualmente mais
avançados relativamente à terapia
génica para o gene p53 tentam re-
introduzir o gene p53 normal nos
tecidos tumorais, ou inocular o tumor
com um adenovírus citolítico que se
replica, selectivamente, em células
que não possuem a proteína p53
normal. Esta última é particular-
mente atractiva dada a sua
especificidade para células tumorais.
Especificamente, sabe-se que a
proteína viral Eb1 do adenovírus
“normal” se liga à p53 celular,
inactivando-a, o que permite a
replicação viral nas células que
possuem p53 normal. Logo, a
infecção de células normais com uma
forma mutada do adenovírus que não
possua a proteína Eb1, originará uma
infecção não-produtiva porque a p53
normal é activada em consequência
da infecção. Por outro lado, a
infecção de células tumorais que têm
a proteína p53 mutada com o mesmo
adenovírus alterado resultará numa
infecção produtiva (o vírus pode
replicar-se), que causará a morte das
células tumorais (revisto por Beaudry
et al., 1996 e Gibbs, 2000).
Uma segunda estratégia consiste no
desenvolvimento de pequenas
moléculas biológicas capazes de
interagir com as formas alteradas da
proteína p53 presentes em tumores, e
assim re-estabelecer a sua função
normal. Isto porque em cerca de 75%
dos casos descritos, a forma
oncogénica da p53 é, predominante-
mente, uma proteína com uma
substituição num único aminoácido
no seu domínio de ligação ao DNA,
resultando numa alteração conforma-
cional que torna a proteína inactiva.
Por este motivo, a pesquisa de
pequenas moléculas que consigam
interactuar com a proteína mutada re-
estabelecendo a sua conformação
funcional é actualmente objecto de
grande interesse (Foster et al., 1999;
revisto recentemente por Beaudry et
al., 1996 e Bullock e Ferhst, 2001).
A possibilidade de explorar vias
alternativas de checkpoint, que não se
encontrem inactivas nas células
tumorais, constitui uma outra
possibilidade terapêutica. Os taxanos
– drogas actualmente utilizadas com
bastante sucesso no tratamento do
cancro da mama - foram
originalmente descobertas de forma
empírica, com base na toxicidade
para células tumorais em cultura. O
seu mecanismo de acção foi
posteriormente elucidado - os taxanosestimulam a polimerização da
tubulina, induzindo a apoptose
tumoral via um checkpoint G2/M,
independente da presença de p53
normal (Lanni et al., 1997 e Sorger et
al., 1997). Isto permitiu a
identificação de novas drogas, como
as epotilonas, descobertas em
rastreios na procura de compostos
que estimulassem a polimerização da
tubulina, e que vieram a revelar-se
eficazes em casos de cancros
resistentes a outros medicamentos.
Uma outra possibilidade, mais
extrema, e que representa uma
estratégia conceptualmente oposta,
consiste em tentar tirar partido do
facto de a alteração de vias de
checkpoint constituir uma diferença
fundamental entre as células tumorais
e as células normais. Neste caso, a
ideia base é a de provocar nas células
tumorais uma acumulação tal de
mutações que as torne totalmente
inviáveis. Uma forma de provocar
essa acumulação de mutações nas
células tumorais poderá consistir na
inibição de vários mecanismos de
checkpoint simultaneamente. De
acordo com dados obtidos em
leveduras, a acumulação de mutações
em dois ou mais genes de checkpoint
em simultâneo torna as células
hipersensíveis à radiação, de tal
forma que mesmo doses mínimas de
radiação são suficientes para lhes
provocar a morte. Com base nestas
observações, a pesquisa de produtos
capazes de inibir a função de
proteínas de checkpoint constitui
uma linha actual de investigação na
área da terapêutica contra o cancro,
que permitiu já a obtenção de alguns
resultados promissores em células em
cultura.
Para além das proteínas directamente
envolvidas nos checkpoints celulares,
foram já identificadas alterações, em
células tumorais, de outras proteínas
que desempenham funções essenciais
no controlo do ciclo celular, e que
poderão constituir potenciais alvos
terapêuticos. Neste sentido, estas
proteínas ocupam um lugar
importante na investigação actual que
tem como objectivo o
desenvolvimento de substâncias que
funcionem como inibidores
Endereços de Páginas WEB com Informações Úteis
Prémio Nobel da Fisiologia ou Medicina 2001
http://www.nobel.se/medicine/laureates/2001/
http://almaz.com/nobel/medicine/medicine.html
Ciclo Celular
http://www.new-science-press.com/cellc-primer.asp
http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/C/CellCycle.html
http://www.nature.com/celldivision/milestones/index.html
Ciclo Celular e Cancro
http://www.sciam.com/0996issue/0996weinberg.html
Proteínas do ciclo celular e terapêutica do cancro
http://www.cyclacel.com
Biologia Celular
14 Boletim de Biotecnologia
específicos, quer sejam compostos
químicos ou péptidos com actividade
biológica, anticorpos específicos (que
alteram a conformação ou interacção
das proteínas mutadas) ou
tratamentos baseados em ácidos
nucleicos (por exemplo utilização de
oligonucleótidos antisense). A
identificação de inibidores específi-
cos para algumas Cdks constitui um
exemplo deste tipo de produtos. Uma
das linhas de investigação
actualmente em curso tem como base
a ideia de desenvolver pequenos
péptidos (com menos de 10 amino-
ácidos) que simulem o efeito dos
inibidores de Cdk que ocorrem
normalmente nas células. Neste
sentido, a optimização de um péptido
de 8 amino-ácidos a partir da
sequência da proteína p21 conduziu
ao desenvolvimento de um produto,
denominado CYC103, que exibe
actividade inibidora específica contra
a Cdk2 simulando a actividade da
proteína p21 endógena normal. O
fármaco CYC202 constitui um
exemplo de um outro tipo de
inibidor, que demonstrou actividade
contra células tumorais num vasto
painel de células tumorais humanas e
se encontra actualmente na fase Ib de
ensaios clínicos. CYC202 é uma
purina tri-substituída que compete
com o ATP para o local activo da
Cdk2, apresentando-se como um
inibidor altamente específico da
actividade Cdk2/ciclina E e
induzindo a apoptose de forma
selectiva em linhas celulares
neoplásicas. O inibidor CYC202 é
activo em linhas celulares resistentes
à quimioterapia convencional, e a
sua actividade é independente da
presença das vias p53 e Rb activas.
Por último, novos métodos para a
detecção de potenciais alvos
terapêuticos podem envolver a
utilização de leveduras na realização
de rastreios baseados em “letalidade
sintética”, na tentativa de identificar
identificar proteínas que quando
inibidas de forma selectiva, matam as
células que contêm defeitos genéticos
frequentemente encontrados em
tumores humanos.
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