Aminoácidos e Proteínas

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Ministério da Educação
Secretária de Educação Profissional e Tecnologia
Instituto Federal Catarinense
Campus Concórdia
GUILHERME ZUSE
GUSTAVO LAROQUE
INDIANARA VICARI
JUNEI POZZO
RELATÓRIO AULA PRÁTICA:
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
Concórdia
2017
INTRODUÇÃO
Os aminoácidos são formados por um átomo de carbono central no qual é ligado a um grupo amino, um grupo ácido carboxílico, um átomo de hidrogênio e um grupo de cadeia lateral. Já a junção de vários aminoácidos através de ligações peptídicas formam as proteínas. (DEVLIN, 2011)
A maioria das proteínas encontradas nos seres vivos é formada por L-aminoácido. Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das proteínas são determinadas em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da cadeia polipeptídica e ainda pela inter-relação espacial de um aminoácido com o outro. 
Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácido podem existir em duas formas, uma pequena fração pode encontrar numa forma eletricamente neutra, enquanto a maioria estará numa forma ionizada. 
O ponto isoelétrico (pI) é o pH na qual o aminoácido é eletricamente neutro, ou seja, a soma das cargas positivas é igual a soma das cargas negativas. Para um aminoácido como a alanina, por exemplo, que apresenta apenas dois hidrogênios dissociáveis, o PI é a média de pK1 e pK2. (CHAMPE, 2009).
Neste presente trabalho, tivemos a oportunidade de observar a curva de titulação de aminoácidos, bem como também a precipitação de proteínas e a caracterização de aminoácidos e proteínas em reações coradas. Com isso conseguimos visualizar diferentes experimentos, embora básicos, são de grande importância para começar a se inserir na área da bioquímica, bem como na área de alimentos.
PRÁTICA 1: CURVA DE TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
Segundo Campbell, quando um aminoácido é titulado, sua curva de titulação indica a reação de cada grupo funcional com íon de hidrogênio. A classificação de um aminoácido como ácido ou básico depende do pKa da cadeia lateral. Esses grupos podem ser titulados depois que o aminoácido é incorporado em um peptídeo ou em uma proteína, o pKa do grupo titulável não é necessariamente o mesmo em uma proteína. Esse fato de terem um pKa diferente possibilita cargas diferentes em um dado pH.
Foi determinado o pH inicial da solução de glicina com HCl (pH = 1), logo após foi acrescentado a esta solução, 1,0 mL de NaOH 1,0 M e foi repetido este procedimento até ter atingir o valor do pH = 12. Fazendo a leitura dos pH’s no pHmêtro e na fita indicadora de pH, conforme Tabela 1.
Tabela 1: Medidas de pH com fita indicadora.
	pH (fita indicador de pH)
	NaOH adicionado (mL)
	1
	0,0mL
	2
	1,0mL
	2
	2,0mL
	3
	3,0mL
	3
	4,0mL
	3
	5,0mL
	5
	6,0mL
	6
	7,0mL
	7
	8,0Ml
	7
	9,0Ml
	8
	10,0mL
	9
	11,0Ml
	11
	12,0mL
	11
	13,0mL
	12
	14,0mL
Fonte: Autores, 2017.
A calibração do pHmetro foi feita em aula, sendo os parâmetros de pH = 7,00 e pH = 4,00 considerados como fatores de calibração, os resultados foram de pH = 6,50 e pH = 3,83 respectivamente, ou seja, o pHmêtro apresentou descalibração.
No resultados que os pHmêtros mostraram, inicialmente teve um tamponamento em meio ácido, aonde a solução tendeu a ficar num pH = 2,00 aproximadamente. Assim, enquanto em meio básico o tamponamento foi observado próximo ao pH = 10,0. O ponto isoelétrico foi calculado, sendo ele igual pI = 6,00 aproximadamente, conforme Gráfico 1.
Gráfico 1: Curva de Titulação.
Fonte: Autores, 2017.
De acordo com Lehninger, 5ª ed., os pKas da glicina são: pKa1 igual a 2,34 e o pKa2 igual a 9,60. Os dados extraídos a partir da prática apresentaram certas alterações nesses valores. Isso pode ser justificado devido que quando o pH está muito próximo de 1 ou de 14, os valores medidos mostrados pelo pHmêtro podem ter alterações devido a presença de altas ou baixas concentrações de íons.
A importância da curva de titulação é que através dela podemos identificar qual a proteínas que estamos analisando, e também determinar a reatividade das cadeias laterais.
PRÁTICA 2 – PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
PROCEDIMENTO A – PRECIPITAÇÃO POR SAIS NEUTROS
Foi adicionado 2 mL de solução de (NH4)2SO4 em um tubo de ensaio com 2 mL de ovoalbumina diluída observando uma coloração amarela com precipitado branco. Após isso foi misturado essa solução por inversão e percebeu-se uma coloração branca com um pequeno tom amarelado. Com a adição de mais 2 mL de água destilada e misturado por inversão novamente a sua coloração foi incolor com precipitados brancos.
Quando adicionado a solução de sulfato de amônio, ocorre um aumento da força iônica. Ao adicionar a solução com a proteína as cargas do sal interagem com a molécula proteica, resultando a diminuição da interação entre elas. Consequentemente, no meio aquoso aumenta a solubilidade da proteína. A esse fenômeno damos o nome de “salting – in”. Em condições de elevada força iônica, devido a adição de quantidades grandes de sal, o efeito será ao contrário. 
PROCEDIMENTO B – PRECIPATAÇÃO POR SAIS DE METAIS PESADOS
Foi adicionado 0,5 mL de solução de acetado de chumbo em um tubo de ensaio contendo 1 mL de ovoalbumina diluída. Após isso foi adicionado 5 mL de água destilada e sua coloração foi um branca turvo com precitado branco.
Assim ocorreu a formação de sais “quelatos” entre aminoácidos e os metais. A proteína irá precipitar, pois os sais são insolúveis em água, também em meio aquoso os aminoácidos hidrofóbicos ficam expostos. A precipitação é mais intensa quando está acima do ponto isoelétrico, a carga líquida sobre a proteína é negativo favorecendo a interação com cátion dos sais. 
PROCEDIMENTO C – PRECIPITAÇÃO POR ÁCIDOS FORTES
Foi adicionado 0,5 mL de solução de ácido clorídrico 6 M em um tubo contendo 1 mL de ovoalbumina diluída. Após isso foi adicionado mais 5 mL de água destilada e sua coloração foi incolor com precipitado branco.
Isso acontece pois os ácidos fortes desnaturam as proteínas e com isso alteram-se a solubilidade levando a sua precipitação.
PROCEDIMENTO D – PRECIPITAÇÃO PELO CALOR
Foi colocado 5 mL de ovoalbumina diluída em dois tubos de ensaio. O primeiro tubo foi levado ao banho-maria por 5 minutos e o outro foi levado por 20 minutos no refrigerador. Com isso observamos que o tubo levado ao banho-maria ficou com um precipitado branco, pois sua proteína desnaturou já o tubo levado ao refrigerador ficou com uma coloração amarela clara.
Isso ocorre porque a estrutura da proteína é sensível a altas temperaturas, causando uma desorganização nas suas cadeias e alteração conformacional, sendo chamada de desnaturação, ela não afeta a cadeia primária da proteína. Ela promove a diminuição na solubilidade da proteína, resultando na precipitação. Ocorre no ponto máximo isoelétrico da proteína, com adição de sais e pode sofrer alteração.
Imagem 1: Reações de precipitação das proteínas.
 Fonte: Autores, 2017.
PRÁTICA 3 – CARACTERIZAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS: REAÇÃO CORADAS
Prática 3.1:
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Violeta
	2 - 2 mL da solução de glicina 0,1%
	Azul claro
	3 - 2 mL da solução de cisteína 1%
	Incolor
	4 - 2 mL da solução de fenilalanina 1%
	Azul claro
	5 - 2 mL de água destilada
	Azul claro
	6 - 2 mL Activa GS
	Violeta
 Fonte: Autores, 2017.
Os tubos 1 e 6 apresentaram a coloração violeta, isso indica que o íon Cu2+ proveniente do CuSO4 formou complexo com ligações peptídicas da ovoalbumina e do Activa.
Prática 3.2:
Antes do banho-maria
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Marrom em cima e transparente em baixo
	2 -2 mL da solução de tirosina 1%
	Incolor
	3 - 2 mL da solução de cisteína 1%
	Incolor
	4 - 2 mL da solução de triptofano 1%
	Incolor
	5 - 2 mL de água destilada
	Incolor
	6 - 2 mL Activa GS
	Branco/ Transparente
Fonte: Autores, 2017.
Depois do banho-maria:
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Preto
	2 - 2 mL da solução de tirosina 1%
	Incolor
	3 - 2 mL da solução de cisteína 1%
	Cinza
	4 - 2 mL da solução de triptofano 1%
	Incolor
	5 - 2 mL de água destilada 
	Incolor
	6 - 2 mL Activa GS
	Amarelo fraco
Fonte: Autores, 2017.
Prática 3.3:
Antes do banho-maria
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Amarelo com precipitado branco 
	2 - 2 mL da solução de fenilalanina 1%
	Incolor
	3 - 2 mL da solução de tirosina 1%
	Incolor
	4 - 2 mL da solução triptofano 1%
	Amarelo fraco
	5 - 2 mL de água destilada 
	Incolor
	6 - 2 mL Activa GS
	Amarelo claro
Fonte: Autores, 2017.
Depois do banho-maria:
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Precipitado amarelo
	2 - 2 mL da solução de fenilalanina 1%
	Incolor
	3 - 2 mL da solução de tirosina 1%
	Amarelo escuro
	4 - 2 mL da solução triptofano 1%
	Marrom avermelhado
	5 - 2 mL de água destilada 
	Incolor
	6 - 2 mL Activa GS
	Amarelo bem claro
Fonte: Autores, 2017.
Após a adição de solução NaOH 12M:
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
	Vermelho alaranjado
	2 - 2 mL da solução de fenilalanina 1%
	Incolor
	3 - 2 mL da solução de tirosina 1%
	Vermelho alaranjado
	4 - 2 mL da solução triptofano 1%
	Alaranjado forte
	5 - 2 mL de água destilada 
	Incolor
	6 - 2 mL Activa GS
	Amarelo
Fonte: Autores, 2017.
Prática 3.4
Antes do banho-maria:
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 1 mL da solução de ovoalbumina 10%
	
	2 - 1 mL da solução de tirosina 1%
	
	3 - 1 mL de água destilada
	Incolor
	4 - 1 mL Activa GS
	Branco com precipitado branco
Depois do banho-maria
	TUBO
	COLORAÇÃO APÓS A ADIÇÃO DE BIRUETO
	1 - 1 mL da solução de ovoalbumina 10%
	Amarelo/cozinhou a gema
	2 - 1 mL da solução de tirosina 1%
	Amarelo
	3 - 1 mL de água destilada
	Incolor
	4 - 1 mL Activa GS
	Amarelo claro
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DEVLIN, Thomaz M. Manual de bioquímica com correlações clínicas. São Paulo; Blucher, 2011.
SANTOS, Eduardo; SPAGIARI Matheus; CAVALHEIRO, Ricardo. Reações de Proteínas. Porto Alegre; 2013.