esquemas pr ticas biologia microbiana

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Biologia Microbiana
Preparação de meios de cultura
Pesar constituintes
Dissolver
(1 a 1 com agitação; aquecer se necessário)
Distribuir em tubos ou frascosAdicionar agar
Ajustar pH
(se necessário)
Autoclavar
Plaquear
Cozer
Distribuir em tubos
Autoclavar
Solidificar em 
posição inclinada
Solidificar em 
posição vertical
AutoclavarFiltração
∅ = 0.45 µm
Meios líquidosMeios sólidos
Embora existam numerosos meios de cultura os seus ingredientes essenciais são relativamente pouco numerosos. Constituintes essenciais para uma bactéria heterotrófica (E. coli): sais inorgânicos, 
fontes de carbono e azoto tipicamente glucose e (NH4)2SO4, tampão e um agente quelante como por exemplo o citrato ou EDTA .
Meios de cultura: (i) composição química definida; 
(ii) complexos de composição química não definida baseados em hidrolizados proteicos; estes meios contêm uma mistura de produtos de degradação de proteínas como a caseína. Os principais métodos 
de hidrólise são: (a) hidrólise ácida (HCl) - hidrólise completa de proteínas parcialmente purificadas, como a caseína e a gelatina; (b) hidrólise enzimática pela pepsina, pancreatina, tripsina ou papaína. 
A digestão enzimática produz hidrolizados parciais (Peptona, Triptona) que geralmente são mais eficientes para o crescimento do que os hidrolizados totais ou a mistura de aminoácidos.
As culturas tendem a modificar o pH durante o crescimento, estas alterações podem ser minimizadas incluindo um tampão no meio.
Agente solidificante: Agar - polissacárido que forma um gel com a água (ponto de fusão 100ºC, solidifica a 40º - 45ºC), resiste à digestão pela maioria dos microrganismos. NOTA: o agar é hidrolizado 
em solução ácida após autoclavagem.
Métodos de esterilização:
1 - Calor: (a) calor húmido: (i) autoclave; (ii) tindalização (aquecimento a 100ºC 10 min - morte das células vegetativas - incubação durante algumas horas a 30ºC para germinação dos esporos - o ciclo 
repete-se 2 a 3x); (iii) fervura; (iv) pasteurização - aquecimento a temperaturas <100ºC; (b) calor seco -estufa.
2 - Desinfectantes químicos
3 - Filtração
4 - Irradiação
Biologia Microbiana
Morfologia da colónia
Morfologia celular
Colónias
Morfologia
Cocos
Bastonetes
Cocobacilos
Isolados
Cadeias
Pares
Tétradas
Endósporos
Cápsulas
Células
Morfologia
Diâmetro
Pigmentação
Consistência
Opacidade
Textura
Forma
Elevação
Margem
- microscopia -
Características microscópicas
Dimensão: variável; podem formar uma colónia de tamanho limitado, independentemente do período de incubação; outras espalham-se à superfície do agar.
Pigmentação: a coloração é variável.
Consistência: seca, pulverulenta, húmida, viscosa.
Opacidade: opaca, translúcida, iridiscente.
Textura: lisa, rugosa, granular, radiada, concentricamente zonada.
Forma: punctiforme, circular, elíptica, tripartida.
Elevação: plana, elevada, convexa, estratificada.
Margem: inteira, filamentosa, ciliada, lobada
Os endósporos bacterianos são estruturas de resistência - células vegetativas de paredes espessadas formadas durante a esporulação, que são resistentes à 
radiação, agentes químicos, temperaturas extremamente elevadas, dessecação (Bacillus e Clostridium).
Cápsula: camada de polissacáridos(por vezes proteínas) protege a célula bacteriana, muitas vezes associada com bactérias patogénicas porque serve como uma 
barreira contra a fagocitose.
Biologia Microbiana
Células - suspensões
Contagem de células totais
cfu por µl vol. =
superfície contada (mm2)* x profundidade
da câmara (0,1 mm) x diluição
cfu contadas
cfu/µl =
nº contados x 1/400 x 0,1 x 10-D
células contadas
* = nº contados x 1/400 
=
nº contados
cfu contadas
x 4000 x 10D = N x 4 x 103 x 10D
cfu/ml = N x 4 x 106 x 10D
1 mm
1 mm
Vcamâra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 400 quadrados pequenos (25 x 16 ) Vcontagem = 0,1/400 mm3 = 1/4 x 106 mL
O número total de células é geralmente determinado com o auxílio de uma câmara de contagem calibrada que é observada ao microscópio. Uma 
câmara típica tem uma depressão central, cuja superfície está dividida em quadrados de área conhecida.Uma gota da suspensão bacteriana é 
colocada nesta superfície e coberta com uma lamela espessa.
9 quadrados - 1 quadrado = 1 mm2 - volume total = 0,9 mm3.
Biologia Microbiana
Escala de McFarland
McFarland 
Scale
No. Bacteria 
(x106/ml)
1 300
2 600
3 900
4 1200
5 1500
6 1800
7 2100
8 2400
9 2700
10 3000
McFarland Standards 
are tubes labelled 1 
through 10 and filled 
with suspensions of 
Barium salts. 
Células totais
McFarland 
Standard No. 0.5 1 2 3 4
1.0% Barium 
chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1.0% Sulphuric acid 
(ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6
Approx. cell density 
(1X108ml) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0
% Transmittance* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5
Absorbance* 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669
*Wavelength of 600 nm
McF 0.5 Ec 0.5 SF
Células - suspensões
Correlação com:
- peso fresco
- peso seco
- células/ml
- cfu/ml
Escala de McFarland - padrões de turbidez: BaCl2 1% e H2SO4 1% em diferentes proporções de modo a formar suspensões turvas de BaSO4.
O número de células de uma supensão bacteriana pode ser determinado em aproximação, por comparação com os padrões da escala de 
McFarland.
Biologia Microbiana
1
5
2
1
7
6
4
3
Purificação por esgotamento do inóculo
Biologia Microbiana
PREPARAÇÃO DE UM ESFREGAÇO BACTERIANO
Espalhar a mistura H2O-bactérias
Secar ao ar
H2O + bactérias
1 2
3
Fixar pelo calor
4
Biologia Microbiana
C
O
L
O
R
A
Ç
Ã
O
de 
G
R
A
M
Esfregaço
Lavar
Lavar
Violeta Cristal = 1 min
G+ G-
Lugol = 1 min
Álcool 95% até sair todo corante
Secar c/ papel
G+ G-
Lavar
Lavar
Safranina = 1 min
1
6
5
4
3
2
9
8
7
10 11
As células são fixadas pelo calor e coradas com um corante básico, O violeta cristal, que cora as células de azul; as preparações são depois tratadas com lugol 
que permite que o iodo penetre nas células e forme um complexo insolúvel em água com o violeta cristal. Este complexo é posteriormente eliminado com uma 
lavagem com alcool a 95% ou acetona, que solubilizam o complexo iodo-violeta cristal. Após o tratamento com o solvente apenas as bactérias gram + 
permanecem coradas, possivelmente devido à sua espessa parede celular, que não é permeável ao solvente. As células são então tratadas com um contracorante 
(safranina ou ácido fucsinico), para permitir a visualização das células gram - que se encontram descoradas. As células gram - aparecem coradas de vermelho e 
as gram + de azul (violeta).
Biologia Microbiana
CARÁCTER GRAM (Teste de KOH 3%)
Misturar KOH 3% + bactériasKOH 3% + bactérias
Gram negativa Gram positiva
1 2
3 3
teste KOH 3% (+) teste KOH 3% (-) 
A parede das bactérias gram + é resistente à solução alcalina e por isso não ocorre lise celular. 
A parede das bactérias gram - não é resistente à solução alcalina e por isso ocorre lise celular; o DNA reage com o KOH e há formação de um fio 
viscoso
Biologia Microbiana
TESTE DA CATALASE
palitos
Peróxido de hidrogénio + bactérias
H2O2
1
Misturar H2O2 + bactérias
2
catalase positiva (+)
3
catalase negativa (-)
3
2 H2O2 2 H2O + O2
catalase
Biologia Microbiana
TESTE DA OXIDASE
Misturar bactérias + TMPD 
contra papel de filtro
papel de filtro +
tetrametil parafenilenodiamina 
dihidrocloreto + bactéria 
oxidase negativa (-)
TMPD
oxidase positiva (+)
1 2
3 3
Células c/ coloração violeta (resultado imediato)
Oxidação do TMPD ► Redução do citrocromo c 
palitos
Biologia Microbiana
C
O
L
O
R
A
Ç
Ã
O
de
E
N
D
Ó
S
P
O
RO
S
Esfregaço 
Bacillus sp.
Papel de filtro
+
Verde malaquite
Safranina = 1 min
Secar c/ papel
Lavar
1
5
2
6
5 min s/ ferver
Lavar
4
3
7
8
Cobre-se o esfregaço com papel de filtro (para evitar a evaporação do corante) saturado com verde malaquite (corante para endósporos - não 
tem afinidade para as células vegetativas). Aquece-se à chama 5 min sem deixar secar o papel de filtro para auxiliar a penetração do corante nos 
endósporos.